2008 Fukumori Determinacao

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada Universidade de So Paulo
DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM

RADIOFRMACOS PELO MTODO DE FORMAO DE GEL.
VALIDAO.
NEUZA TAEKO OKASAKI FUKUMORI
Dissertao apresentada como parte dos

requisitos para obteno do Grau de
Mestre em Cincias na rea de
Tecnologia Nuclear Aplicaes.
Orientadora: Dra. Constancia Pagano
Gonalves da Silva
SO PAULO
2008
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares, IPEN-CNEN/SP, por possibilitar

a realizao deste trabalho.
Dra. Constancia Pagano Gonalves da Silva, mulher valorosa, excelente
profissional, pioneira no desenvolvimento da Radiofarmcia no Brasil e minha
orientadora, pela convivncia harmoniosa, pelos ensinamentos, pelo exemplo de
vida, conselhos, apoio e confiana em mim depositados contribuindo para o meu
crescimento pessoal e profissional.
Dra. Nilda Petrona Sosa de Pereira, minha amiga, pelo apoio, pelo incentivo, pela
pacincia, por me conduzir nos primeiros passos da radiofarmcia, pelos
ensinamentos, conselhos e maravilhosas experincias de vida transmitidos.
Ao MSc. Jair Mengatti, gerente do Centro de Radiofarmcia do IPEN-CNEN/SP,
pelo inestimvel apoio e colaborao.
Dra. Margareth Mie Nakamura Matsuda, pelos conselhos, ensinamentos e
colaborao durante a execuo do trabalho.
querida Adriana Vidal Fernandes pelo inestimvel apoio, carinho e colaborao na
parte experimental e anlise estatstica.
Aos funcionrios do Centro de Radiofrmacia, especialmente Domingos Gomes de
Campos e Natanael Gomes da Silva, que muito contriburam na realizao deste
trabalho,
A todos os colegas e professores das disciplinas de ps-graduao do IPEN, pelo
agradvel convvio, incentivo, amizade e conhecimentos adquiridos.
Luzia de Fatima Pereira, funcionria da Alko do Brasil, fornecedora da maior parte

do material utilizado nos experimentos, pelo inestimvel apoio e colaborao.
minha querida famlia, pelo amor, compreenso e encorajamento em todos os
momentos de minha vida.
"...se buscares a sabedoria como a prata e como a tesouros escondidos a

procurares, ento, entenders o temor do Senhor e achars o conhecimento
de Deus."
(Provrbios 2:4-5)
DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM

RADIOFRMACOS PELO MTODO DE FORMAO DE GEL. VALIDAO.
Neuza Taeko Okasaki Fukumori

RESUMO
Antes do Ensaio do Lisado de Amebcitos do Limulus (LAL), a nica forma de se avaliar a

pirogenicidade em drogas parenterais e dispositivos mdicos era o ensaio de pirognio em
coelhos da Farmacopia Americana (USP). Especialmente para radiofrmacos, o ensaio
LAL a escolha para a determinao de endotoxina bacteriana (pirognio). O objetivo deste
trabalho foi validar o mtodo de formao de gel para alguns radiofrmacos sem uma
interferncia mensurvel. O guia do mtodo LAL do Food and Drug Administration (FDA)
define interferncia como uma condio que causa uma diferena significativa entre os
pontos finais de gelificao das sries de controle positivo da gua e controle positivo do
produto utilizando-se um endotoxina padro. Os experimentos foram realizados de acordo
com o teste de endotoxinas bacterianas da USP na m-iodobenzilguanidina-131I, nos
radioistopos Glio-67 e Tlio-201, nos reagentes liofilizados DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn
Coloidal. A Mxima Diluio Vlida (MDV) foi calculada para cada produto com base na sua
dose clnica e diluies seriadas abaixo da MDV foram avaliadas em duplicata para a
deteco de interferncias. A sensibilidade declarada do reagente de LAL foi de 0,125 UE
mL-1 (Unidades de Endotoxina por mililitro). Para a validao, uma srie de diluies foi feita
utilizando-se padro de endotoxina (PE) nas concentraes de 0,5 a 0,03 UE mL-1 para a
confirmao da sensibilidade do reagente de LAL, em quadruplicata. A mesma srie de
diluies foi feita com o PE e o produto diludo 100 vezes em trs lotes consecutivos de
cada radiofrmaco. Os produtos m-iodobenzilguanidina-131I, Glio-67, Tlio-201, DTPA,
SAH e Sn Coloidal foram compatveis com o mtodo no fator de diluio 1:100. Fitato e
GHA apresentaram interferncia no ensaio de formao de gel. Outras tcnicas para
determinar endotoxinas como o ensaio cromognico (desenvolvimento de cor) e o
turbidimtrico (desenvolvimento de turbidez) foram avaliadas para obter informaes
qualitativas e quantitativas sobre as concentraes de endotoxinas nas amostras.
DETERMINATION OF BACTERIAL ENDOTOXIN (PYROGEN) IN

RADIOPHARMACEUTICALS BY THE GEL CLOT METHOD. VALIDATION.
Neuza Taeko Okasaki Fukumori
ABSTRACT
Before the Limulus amebocyte lysate (LAL) test, the only available means of pirogenicity
testing for parenteral drugs and medical devices was the United States Pharmacopoeia
(USP) rabbit pyrogen test. Especially for radiopharmaceuticals, the LAL assay is the elective
way to determine bacterial endotoxin. The aim of this work was to validate the gel clot
method for some radiopharmaceuticals without measurable interference. The FDAs LALTest guideline defines interference as a condition that causes a significant difference
between the endpoints of a positive water control and positive product control series using a
standard endotoxin. Experiments were performed in accordance to the USP bacterial
endotoxins test in the
131
I- m-iodobenzylguanidine; the radioisotopes Gallium-67 and
Thallium-201; the liophylized reagents DTPA, Phytate, GHA, HSA and Colloidal Tin. The
Maximum Valid Dilution (MVD) was calculated for each product based upon the clinical dose
of the material and a twofold serial dilution below the MVD was performed in duplicate to
detect interferences. The labeled sensitivity of the used LAL reagent was 0.125 EU mL-1
(Endotoxin Units per milliliter). For validation, a dilution series was performed, a twofold
dilution of control standard endotoxin (CSE) from 0.5 to 0.03 EU mL-1, to confirm the labeled
sensitivity of the LAL reagent being tested in sterile and non pyrogenic water, in
quadruplicate. The same dilution series was performed with the CSE and the product in the
1:100 dilution factor, in three consecutive batches of each radiopharmaceutical. The
products
131
I-m-iodobenzylguanidine, Gallium-67, Thallium-201, DTPA, HSA and Colloidal
Tin were found compatible with the LAL test at a 1:100 dilution factor. Phytate and GHA
showed some interference in the gel clot test. Other techniques to determine endotoxins as
the chromogenic (color development) and the turbidimetric test (turbidity development), were
also assessed to get valuable quantitative and qualitative information about the endotoxin
concentration in samples.
SUMRIO
Pgina
1 INTRODUO .................................................................................... 10
1.1 Radiofrmacos .................................................................................. 11
1.2 Pirognio e Endotoxina ..................................................................... 14
1.3 Estrutura, Funo e Atividade da Endotoxina ..................................
16
1.4 Processos de Despirogenizao .......................................................
18
1.5 Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo .......................................... 22

1.5.1 Histrico ......................................................................................... 23
1.6 Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodo in vitro .....
24
1.6.1 Histrico ......................................................................................... 27

1.7 Validao do Ensaio do LAL ............................................................. 30
1.8 Interferncias ....................................................................................
32
1.9 Outros Mtodos para Determinao de Endotoxina ......................... 34

1.9.1 Mtodo Turbidimtrico Quantitativo ............................................... 34
1.9.2 Mtodo Colorimtrico de Protena .................................................
35
1.9.3 Mtodo Nefelomtrico .................................................................... 35

1.9.4 Mtodo Cromognico Quantitativo ................................................
35
2 OBJETIVO .......................................................................................... 37
3 REVISO DA LITERATURA .............................................................. 38
4 MATERIAIS E MTODOS .................................................................. 40
4.1 Materiais ............................................................................................ 42
4.1.1 Materiais Utilizados no Mtodo in vitro de Determinao de
Endotoxina por Formao de Gel ..............................................................
4.1.2 Materiais Utilizados no Mtodo CromognicoPTS de
Determinao de Endotoxina Bacteriana ..................................................
4.1.3 Materiais Utilizados no Mtodo Turbidimtrico de Determinao de
Endotoxina Bacteriana ..............................................................................
4.2 Mtodos .............................................................................................
42
42
44
44
4.2.1 Mtodo de Formao de Gel ........................................................... 44

4.2.1.1 Preparao das Diluies Sucessivas de Padro de Endotoxina. 46
4.2.1.2 Preparao das Diluies Sucessivas do Produto com Padro
de Endotoxina ........................................................................................... 46
4.2.1.3 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL ...................... 47
4.2.2 Mtodo Cromognico - PTS ...........................................................
48
4.2.3 Mtodo Turbimtrico ...................................................................... 49

5 RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................
50
5.1 Validao dos Produtos pelo Mtodo de Formao de Gel .............
50
5.1.1 Clculo de MDV ............................................................................. 50

5.1.2 Inibio ou Potencializao ...........................................................
51
5.1.3 Sries de Diluio do Padro de Endotoxina ................................
54
5.1.3.1 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL ......................
54
5.2 Validao pelo Mtodo Cromognico PTS ..................................... 56

5.2.1 Clculo de MDV ............................................................................. 58
58
5.3 Validao pelo Mtodo Turbimtrico ................................................
66
5.3.1 Clculo de MDV ............................................................................. 66

66
CONCLUSES .................................................................................
73
ANEXO 1 - Modelo de Ficha para Validao .......................................
74
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................
75
LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS

BCG
Bacilo de Calmette e Gurin
BPF
Boas Prticas de Fabricao
CDRH
Center for Devices and Radiological Health
CEP
Concentrao de Endotoxina no Produto
CPP
Controle Positivo do Produto
CV
Coeficiente de Variao
DTPA
cido Dietilenotriaminopentactico
FDA
Food and Drug Administration
GHA
Glucoheptonato de Clcio
HIMA
Health Industry Manufacturers Association
IgG
Imunoglobulina G
KTS
Sistema Cintico Turbidimtrico
LAL
Lisado do Amebcito de Limulus
LPS
Lipopolissacardeo
MBq
Megabecquerel
MCV
Mnima Concentrao Vlida
MDV
Mxima Diluio Vlida
MIBG
Metaiodobenzilguanidina
nm
Nanmetro
PE
Padro de Endotoxina
PET
Tomografia por Emisso de Psitron
pNA
para-nitroanilina
PRE
Padro de Referncia de Endotoxina
PTS
Sistema de Teste Porttil
RCCP
Recuperao do Controle Positivo do Produto
RDC
Resoluo da Diretoria Colegiada
SAH
Soro Albumina Humano
UE
Unidade de Endotoxina
USP
Farmacopia Americana
10
1 INTRODUO
O conceito de controle total de qualidade de produtos farmacuticos,
correlatos e cosmticos consiste no esforo organizado dentro de uma empresa, no
sentido de projetar, produzir, manter e assegurar as caractersticas especificadas
em cada unidade do produto distribudo para comercializao. A atividade de
prover, em toda a amplitude, a evidncia necessria para estabelecer confiabilidade
de que a funo qualidade est sendo adequadamente efetuada e administrada faz
parte do Sistema de Gesto da Qualidade.[1]
A preocupao relativa qualidade, quando associada atividade produtiva,
foi sempre inerente ao ser humano, que busca aperfeioar, desenvolver, superar
limites, independentemente da atividade que exera, a fim de atender aos anseios
da sociedade.[1]
Na fabricao de produtos estreis devem ser tomadas medidas para se
evitar a contaminao, tanto particulada como microbiana.[1,2] A rea produtiva
deve seguir rgidos conceitos de engenharia, deve apresentar paredes e teto lisos e
impermeveis; superfcies e equipamentos devem ser de fcil limpeza e construdos
de material que resista desinfeco qumica. Deve ser previsto sistema de
circulao e de tratamento de ar que auxilie na manuteno da limpeza da rea,
promovendo renovaes expressas em nmero de vezes que o volume total do ar
da sala trocado por hora.[1]
Para garantir que os produtos farmacuticos tenham e mantenham as

caractersticas
de estrutura, identidade,
pureza, concentrao, potncia e
inocuidade requeridas para o seu uso existe um conjunto de normas e atividades

relacionadas entre si denominado Boas Prticas de Fabricao (BPF). No Brasil, a
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria o rgo normativo que regulamenta as
Boas Prticas de Fabricao de Medicamentos por meio da RDC (Resoluo da
Diretoria Colegiada) n 210, de 04 de agosto de 2003.[3]
11
A abrangncia das Boas Prticas de Fabricao est direcionada s
instituies da rea de sade e tambm atividade industrial dos produtores de
medicamentos, correlatos, cosmticos, domissanitrios e alimentos.[1]
Para estabelecer evidncia documentada, que proporcione com alto grau de
segurana, de que determinado procedimento quando executado sob condies
pr-estudadas e definidas seja capaz de reproduzir um servio ou bem dentro das
especificaes e qualidade desejveis, as BPF recomendam que seja realizada a
validao dos processos e das metodologias analticas. parte integrante do
Sistema de Qualidade e tem por escopo a confiabilidade dos processos e sistemas.
[1,4]
1.1 Radiofrmacos
Todo produto a ser administrado em humanos deve reunir requisitos de
qualidade, segurana e eficcia. Os radiofrmacos devem cumprir os requisitos
exigidos aos produtos farmacuticos convencionais, como as BPF e ainda outros
especficos, por se tratarem de substncias radioativas.[5]
Radiofrmaco um medicamento especial ou produto que, quando pronto
para uso, contm um radioistopo em sua constituio e utilizado em seres
humanos para o diagnstico e tratamento de enfermidades.[6,7]
Com uma filosofia similar, as Boas Prticas de Fabricao em Radiofarmcia
ou Boas Prticas Radiofarmacuticas so recomendaes ou conjunto de normas e
atividades que conjugam os princpios das BPF e as normas de Proteo
Radiolgica. As Boas Prticas Radiofarmacuticas destinam-se a garantir que os
produtos terminados de uso radiofarmacutico tenham e mantenham as
caractersticas necessrias para a utilizao segura e correta dos radiofrmacos a
serem administrados nos seres humanos no mbito dos servios de Medicina
Nuclear.[6]
A maioria dos radiofrmacos utilizados administrada aos pacientes por via
parenteral e, portanto, devem ser estreis e livres de pirognio.[6,7] Alm disso, a
12
preparao do radiofrmaco feita com o uso de solues radioativas, sendo mister
que se tomem medidas necessrias para evitar contaminao direta do operador e
do ambiente de trabalho.[6]
Embora o termo radiofrmaco seja o mais usado, outras designaes, a
saber, radiotraador, agente radiodiagnstico ou simplesmente traador tambm
so encontradas.[7]
O radiofrmaco deve ser seguro e no txico para administrao em
humanos, as radiaes emitidas pelo radioistopo devem ser facilmente detectadas
por instrumentos adequados e a dose de radiao ao paciente deve ser mnima.[7]
Os radioistopos utilizados em medicina nuclear so na sua maioria, artificiais
e so produzidos principalmente em ciclotron ou reator.[7,8]
Os compostos marcados com radioistopos emissores tm sido utilizados
em experimentos in vitro e em terapia, enquanto que os que so marcados com
emissores e + possuem aplicaes mais amplas e so teis na obteno de
imagens in vivo de diferentes rgos.[7]
Mais de 80% dos radiofrmacos usados em medicina nuclear so compostos
marcados com tecncio-99m (99mTc). O seu uso clnico decorre de suas
caractersticas fsicas favorveis. A meia vida fsica de 6 horas e a baixa
porcentagem de emisso de eltrons permitem a administrao de miliCuries de
99m
Tc sem uma dose de radiao significativa ao paciente. Os ftons
monocromticos de 140 keV so colimados e fornecem imagens com boa resoluo

espacial. Alm disso, o
99m
Tc est disponvel facilmente em um estado livre de
carregador, estril e apirognico a partir dos geradores de 99Mo-99mTc.[7, 9]

O uso dos reagentes liofilizados para marcao com
99m
Tc facilitou a prtica
nas radiofarmcias hospitalares por causa do prazo de validade, podendo ser

comercializados e armazenados antes de sua preparao.[7]
O pertecnetato de sdio (Na99mTcO4), que a forma qumica do
99m
Tc
disponvel no gerador, empregado na cintilografia de glndulas salivares e de

tireide8. Os reagentes liofilizados cido Dietilenotriaminopentactico (DTPA),
13
Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro Albumina Humano (SAH) e Estanho
Coloidal (Sn Coloidal) marcados com
99m
Tc so usados, respectivamente, para
cintilografia renal (estudo do fluxo renal e medida da velocidade de filtrao

glomerular); cintilografia heptica e localizao de linfonodo sentinela; cintilografia
renal e cerebral; estudos circulatrios e cintilografia hepato-esplnica.[7,8,9]
Glio-67 (67Ga) na forma de citrato utilizado na deteco de doenas
malignas, a saber: doena de Hodgkin, linfomas e carcinoma broncognico.
tambm utilizado para localizar doenas inflamatrias agudas e infeces.[7,8]
Tlio-201 (201Tl) na forma de cloreto empregado na obteno de imagem de
perfuso miocrdica na diferenciao entre miocrdio isqumico e infartado.
indicado para a deteco de hiperparatireoidismo e tumores cerebrais.[7,8]
O composto metaiodobenzilguanidina (MIBG) marcado com Iodo-131 pelo
mtodo de troca isotpica e usado para imagem da medula adrenal e tumores
neuroendcrinos (deteco
de
feocromocitomas
tratamento
de
neuroblastomas).[7,8]
Entre os radiofrmacos descritos para uso em tomografia por emisso de
psitron (PET) encontra-se o Flor-18 (18F) como marcador do anlogo da glicose, a
flor-18-deoxiglicose (FDG), com ampla aplicao em cintilografia cerebral, cardaca
e em deteco de uma variedade de tumores em todo o corpo.[7,9]
O controle de qualidade envolve vrios ensaios especficos que asseguram a
pureza, potncia, identidade do produto, segurana biolgica e eficcia dos
radiofrmacos. Todos os procedimentos de controle de qualidade que so aplicados
aos frmacos no radioativos so igualmente aplicados aos radiofrmacos, com o
acrscimo dos ensaios de pureza radioqumica e radionucldica.[7,10]
Os ensaios biolgicos so realizados essencialmente para avaliar a
esterilidade, apirogenicidade e toxicidade dos radiofrmacos antes da sua
administrao parenteral em seres humanos. Enquanto os radiofrmacos perdem a
esterilidade devido ao crescimento de bactria, fungo e levedura, a pirogenicidade
advm de certos produtos metablicos (endotoxina) destes microorganismos. A
esterilidade de uma soluo no garante a sua apirogenicidade e nem a
14
esterilizao destri o pirognio num radiofrmaco. Desde que o pirognio se
origina do metabolismo da bactria, o melhor recurso para prevenir a contaminao
utilizar material estril, solues e equipamento sob condies asspticas em
qualquer procedimento de preparao.[7]
1.2 Pirognio e Endotoxina
Substncias que induzem febre so chamadas pirognios. A palavra
pirognio relacionada palavra grega pyro, que significa ardente ou fogo, uma
descrio adequada para substncias que produzem elevao da temperatura do
corpo.[11]
Os pirognios so divididos em duas classes. Pirognios exgenos so
aqueles originrios fora do corpo e induzem elevaes trmicas quando injetados
em humanos e animais. Embora o lipopolissacardeo (endotoxina) seja o mais
presente e importante pirognio exgeno, h outros de constituio qumica diversa,
que causam elevao de temperatura quando injetados sob condies especficas.
Classes gerais de pirognios exgenos incluem bactria, fungos e vrus, como
tambm pirognios no microbianos, por exemplo, alguns frmacos, esterides,
fraes
do
plasma
adjuvante
sinttico
muramil
dipeptdeo.[1,11]
O pirognio endgeno, entretanto, produzido internamente pelo hospedeiro

em resposta ao estmulo de vrios pirognios exgenos. O pirognio endgeno
uma substncia homognea sintetizada por diferentes clulas de hospedeiros aps
exposio aos pirognios exgenos como a endotoxina. Hoje, est bem
estabelecido que o pirognio endgeno o mediador central da febre.[11]
Os nveis de pirognio tornaram-se cruciais na liberao de produtos

farmacuticos. Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetveis,
bem como os acessrios para transfuso, infuso e todos os dispositivos
implantveis ou descartveis empregados em terapia parenteral devem oferecer
segurana ao paciente, sob o ponto de vista de contaminantes pirognicos.
Produtos injetveis de grande volume e de pequeno volume, assim como produtos
na forma de aerossol, para uso respiratrio devem ser analisados. O potencial de
15
periculosidade maior quando se trata de injetvel de uso exclusivo por via
intravenosa. O risco ser ainda maior quando se trata de produto com inoculao
intratecal, em que a experincia demonstrou ser a endotoxina 1000 vezes mais
potente que na via intravenosa.[1]
Endotoxinas so complexos de alto peso molecular associados membrana
externa de bactrias Gram-negativas, sejam elas patognicas ou no, e se
constituem na mais significante fonte de pirognio para a indstria farmacutica.
[1,2,12]
Apesar de a maior parte da endotoxina permanecer associada parede
celular at a desintegrao da bactria, quantidades nfimas de endotoxinas so
liberadas, na forma solvel, por culturas de bactrias jovens ou tambm por
bactrias Gram-negativas como E.coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas,
Neisseria, Haemophilus e outros agentes patognicos, em crescimento.[1]
Endotoxinas no purificadas podem conter lipdeos, carboidratos e protenas.
Como podem ser encontradas unidades no purificadas nas fases em processo ou
nos
produtos
farmacuticos
terminados,
prefere-se
utilizar
terminologia
endotoxina. A denominao de lipopolissacardeo (LPS) aplicada endotoxina

purificada, para enfatizar a sua natureza qumica.[1]
Na FIG. 1, est representada a estrutura da parede celular de uma bactria

Gram-negativa.
(endotoxina).
membrana
externa
composta
de
lipopolissacardeo
16
LIPOPOLISSACARDEO
Cadeias laterais O-especficas
Polissacardeo
Lipdeo A
Fosfolipdeo
Protena
Lipoprotena
Peptdeoglicano
Espao periplsmico
Membrana interna
Citoplasma
FIGURA 1 Estrutura da parede celular de bactria Gram-negativa. (Fonte: Charles

River Laboratories)
1.3 Estrutura, Funo e Atividade da Endotoxina

As endotoxinas so txicas maioria dos mamferos. Estudos tm
demonstrado que a injeo de clulas de bactrias Gram-negativas vivas ou mortas,
ou LPS purificados causa uma srie de reaes patofisiolgicas que podem variar
de uma leve alterao de temperatura (febre), mudana na contagem de clulas
brancas do sangue, coagulao intravascular disseminada, hipotenso, choque, at
mesmo a morte. Por isso, a deteco e a eliminao de endotoxina bacteriana em
frmacos de uso in vivo so de vital importncia aos pacientes.[1,10,13]
O mecanismo de induo de febre envolve a fagocitose do lipdeo A, sendo
produzido pirognio endgeno, que atravessa a barreira hematoenceflica e altera o
ponto de equilbrio dos neurnios reguladores de temperatura do hipotlamo
anterior. Um significante aumento na concentrao de prostaglandina E2 e
adenosina monofosfato cclica (cAMP) foi encontrado no fluido cerebrospinal de
17
coelhos nos quais foi induzida febre por injeo intravenosa de lipdeo A, indicando
que ambos ocupam papel importante na induo de febre.[11]
O lipdeo A, considerado a poro ativa da membrana da bactria Gram
negativa, composto de um dissacardeo de glicosamina, altamente substitudo por
cidos graxos de cadeia longa com grupamentos amida e ster. Tipicamente, o
lipdeo A ligado ao ncleo de heteropolissacardeo pelo cido 2-ceto-3deoxioctnico, um acar cido de 8 carbonos, exclusivo de lipopolissacardeo
bacteriano.[11]
unidade lipdeo A da endotoxina so atribudas diversas atividades
biolgicas como: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose,
fenmeno de Shwartzman, necrose da medula ssea, reabsoro do osso
embrionrio, ativao do complemento, queda de presso sangunea, agregao
plaquetria, ativao do fator de Hagemen, induo do fator plasminognio,
toxicidade aumentada pelo pr-tratamento com BCG, toxicidade aumentada pela
adrenalectomia, reatividade drmica aumentada epinefrina, induo de resistncia
no especfica infeco, induo de tolerncia endotoxina, induo de sntese
de IgG em camundongos neonatos, induo produo de interferon, induo
produo de fator de tumor necrtico, induo produo de quinase-piruvato em
fgado de camundongo, hipotermia em camundongos, gelificao do lisado do
amebcito de Limulus (LAL).[11]
A determinao da sensibilidade relativa de coelhos e humanos a vrias
endotoxinas foi considerada de grande importncia, uma vez que o teste de
pirogenicidade era feito objetivando segurana no uso de medicamento parenteral
em humanos. Embora se admita equivalncia para dose-limite na reao pirognica
de coelhos e do homem, quando sob doses consistentemente mais altas, a relao
dose-resposta observada no homem mais intensa, podendo ser at 10 vezes
maior.[11,13] Esses estudos foram realizados utilizando-se preparaes purificadas,
enquanto que as endotoxinas que ocorrem naturalmente como contaminantes de
produtos farmacuticos apresentam comportamentos distintos; a pirogenicidade
pode depender do tipo de endotoxina, assim como do nvel de dose utilizado.[1]
18
A HIMA (Health Industry Manufacturers Association) nos Estados Unidos
escolheu E. coli 055:B5 como padro de referncia de endotoxina aps conduzir um
estudo colaborativo entre os laboratrios que realizavam teste de pirognio em
coelhos nos Estados Unidos. O estudo estabeleceu com 95% de confiana que uma
mdia de 50% de resultados passa ou no passa ocorre em concentraes acima
de 98 pg mL-1 (aproximadamente 0,1 ng mL-1). Assim, a HIMA recomendou
estabelecer 0,1 ng mL-1 de endotoxina como um padro de referncia contra o qual
o ensaio do LAL poderia ser comparado.[11,13,14]
O padro de referncia de endotoxina mais comumente chamado EC-5 e
pode ser obtido do Office of Biologics, National Center for Drugs and Biologics, por
fabricantes licenciados de LAL.[11]
A escolha da preparao de E. coli 055:B5 pelo Bureau of Medical Devices foi
o resultado de um esforo cooperativo com o propsito de desenvolver guias para a
utilizao do ensaio do LAL em dispositivos mdicos.[11]
Se um fabricante escolher utilizar uma preparao de endotoxina que no
seja o Padro de Referncia de Endotoxina (PRE), este Padro de Endotoxina (PE)
deve ser padronizado contra o PRE.[11,12]
As relaes entre PE e PRE devem ser determinadas antes da
comercializao de um novo lote de LAL, ou um novo lote ou fabricante de PE.[11]
1.4 Processos de Despirogenizao
A endotoxina notoriamente resistente destruio pelo calor, dessecao,
pH extremos e vrios tratamentos qumicos, por isso a validao do processo de
destruio ou remoo da endotoxina na produo de injetveis um fator crtico
para o fabricante.[4]
Duas grandes classes de processos de despirogenizao que podem ser
aplicadas a componentes, dispositivos, materiais que entram em contato com
injetveis e s prprias drogas incluem a inativao e a remoo da endotoxina.
[1,4,11] A inativao pode ser obtida pela detoxificao da molcula de LPS usando
tratamentos qumicos que quebrem pontes lbeis ou bloqueiem stios necessrios
19
atividade pirognica: hidrlise cida, oxidao com perxido de hidrognio,
hipoclorito de sdio, periodato de sdio, permanganato de potssio diludo,
alquilao com anidrido actico e succnico, ou mesmo xido de etileno. Outros
processos que levam inativao de endotoxinas so: tratamento por calor seco,
radiao ionizante e tratamento com o antibitico polimixina B.[1,11]
A hidrlise cida ocorre na ligao do lipdeo A com o ncleo de
polissacardeos separando o lipdeo A do restante da molcula, que isolado e
insolvel em meio aquoso tem sua atividade pirognica reduzida ou eliminada. A
hidrlise cida tambm pode agir sobre a frao lipdeo A, alterando a conformao
da molcula em stios funcionais essenciais, ou clivando cidos graxos, afetando a
solubilidade e pirogenicidade do lipdeo.[1,4,11]
Na despirogenizao de materiais utiliza-se HCl 0,05 N por 30 minutos a
100 C ou cido actico glacial 1,0% por 2 a 3 horas a 100 C.[1,4,11]
No processo de oxidao, o perxido de hidrognio efetivo na eliminao
do pirognio da gua Estril para Injeo USP, soluo salina normal e salinadextrose, com vantagem adicional da ausncia de perxidos em seu final. O
processo dependente do tempo, pH e concentrao.[1,4,11]
O tratamento de endotoxinas com agentes alquilantes, como anidrido actico
e succnico, promove reduo de atividade pela acetilao e succinilao,
respectivamente.[1,4,11]
O xido de etileno um forte agente alquilante com ao eficaz na destruio
de endotoxinas. [1,4,11]
Para materiais resistentes temperatura, como frascos de vidro e
instrumentos metlicos, o mtodo de escolha para inativao de endotoxina o
tratamento por calor seco obtido em estufas ou tneis de conveco, conduo ou
irradiao (Infravermelho).
O mtodo padro de exposio a no menos de
250 C, por no menos que 30 minutos, sendo o mecanismo de inativao a

incinerao.[1,4,11]
20
Para verificar a eficcia do processo de despirogenizao por calor seco,
devem ser realizados experimentos utilizando quantidades conhecidas de
endotoxina de Escherichia coli.[1]
A toxicidade de endotoxinas bacterianas reduzida com Cobalto-60, sendo
que as alteraes fsicas e biolgicas relatadas so dependentes da dose. Como
este processo aumenta a possibilidade de alteraes qumicas desconhecidas em
frmacos e solues parenterais, o uso de radiao ionizante na despirogenizao
de materiais no tem sido considerado. Os riscos de toxicidade decorrentes do
processo superam os benefcios.[1,4,11]
A polimixina B um antibitico catinico que pode anular a atividade
biolgica da endotoxina, embora mais estudos sejam necessrios para esclarecer a
sua ao.[1,4,11]
A remoo de endotoxinas pode ocorrer por diferentes mtodos, baseada em
caractersticas fsicas da endotoxina, a saber, tamanho, peso molecular, carga
eletrosttica ou afinidade da endotoxina a diferentes superfcies: lavagem com gua
estril para injeo USP, destilao, ultrafiltrao (o tamanho da subunidade bsica
do LPS cerca de 10.000 a 20.000 daltons), osmose reversa, adsoro em carvo
ativo ou em asbestos, por atrao eletrosttica, ou em membrana hidrofbica.
[1,4,11]
A lavagem com solvente livre de pirognio, como gua Estril para Injeo
USP, um dos mtodos mais simples e antigos para a remoo de endotoxina de
superfcies slidas. Com procedimentos adequados de lavagem podem-se remover
nveis baixos de endotoxina superficial de vidraria, tampas e dispositivos.[1,4,11]
Na destilao, as molculas de lipopolissacardeos permanecem na fase
lquida enquanto a gua pela fervura passa ao estado de vapor. Molculas de LPS
que estiverem nas gotculas de gua transportadas pelo vapor tendem a cair por
gravidade devido ao seu elevado peso molecular. Sabe-se que a gua recm
destilada, coletada e mantida em frascos despirogenizados estreis, apirognica.
[1,4,11]
21
Membranas de ultrafiltrao so efetivas como filtros despirogenizantes pois
seu mecanismo fundamentado em limites de excluso de peso molecular.
Endotoxinas so retidas na superfcie da membrana quando excedem um valor
limite de peso molecular, normalmente 10.000 daltons. A ultrafiltrao como mtodo
de remoo de pirognios tem sido aplicada com sucesso a uma ampla faixa de
frmacos e solues de baixo e mdio peso molecular.[1,4,11]
Membranas convencionais de osmose reversa (com porosidade nominal de
cerca de 10 A) removem endotoxinas por simples excluso de tamanho, j que os
poros da membrana so pequenos o suficiente para impedir a passagem de
pirognios. So extremamente efetivas na remoo de endotoxinas da gua, porm
o seu uso na despirogenizao tem sido limitado, porque muitas molculas distintas
da gua tambm passam atravs dos poros na membrana de osmose reversa.
[1,4,11]
O procedimento mais adotado para a despirogenizao de solues pela
adsoro de endotoxinas ao carvo ativo a sua adio soluo e aps agitao,
o carvo removido por filtrao ou precipitao. Como o carvo possui grande
afinidade por substncias no ionizadas de elevado peso molecular, a sua aplicao
limitada.[1,4,11]
Os agregados de endotoxina so negativamente carregados e se comportam
como nions em pH acima de 2. No passado, o asbestos em pH abaixo de 8,3, foi
empregado para remoo de endotoxinas por adsoro, por apresentar superfcie
com carga positiva. Atualmente, procura-se adotar material sinttico base de
poliamidas ou aminas. Produtos microporosos com carga modificada, utilizando
membranas com potencial negativo so comercialmente disponveis e empregados
com sucesso na despirogenizao de vrias solues farmacuticas.[1,4,11]
Polipropileno, polietileno, fluoreto de polivinilideno e politetrafluoretileno
apresentam afinidade para ligao endotoxina. Estudos deste mecanismo de ao
sugeriram que interaes inicas ou hidrfobas contribuem para a adsoro de
endotoxina.[1,4,11]
22
1.5 Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo
O ensaio in vivo aplicado aos produtos que podem ser tolerados pelo
animal em uma dose mxima de 10 mL por kg e envolve a medida do aumento na
temperatura em coelhos aps a injeo intravenosa de uma soluo. So utilizados
coelhos adultos e saudveis, acomodados individualmente em uma rea com
temperatura uniforme entre 20 e 23 C e livre de distrbios que possam excit-los.
[4,15]
Cada animal deve ser pesado e colocado em gaiola individual seguindo-se a
introduo do par termoeltrico para medio da temperatura retal. Determina-se a
temperatura corporal, de 40 a 90 minutos antes da injeo para selecionar os
coelhos que sero utilizados no ensaio. A disperso da temperatura de controle,
entre os animais de cada grupo, no deve ser maior que 1 C, embora sejam
valores compreendidos entre 38,0 e 39,8 C.[1,4]
As amostras so injetadas na veia marginal da orelha e a temperatura
corporal registrada durante pelo menos 3 horas. As determinaes, em caso
descontnuo, ao menos trs, devem ser realizadas a intervalos de uma hora aps a
inoculao da amostra, ou em maior nmero, a intervalos de tempo menor. O
registro grfico contnuo oferece melhores condies para a deciso final pela
anlise do perfil da curva.[1]
Pelo critrio de interpretao atualmente empregado em pases europeus,
cada amostra deve ser avaliada em um grupo de trs animais e quando a soma das
elevaes trmicas individuais mximas for inferior a 1,15 C a amostra ser
aprovada e caso seja superior a 2,65 C ser rejeitada. Quando o valor da
somatria estiver entre estes valores, a amostra ser injetada em outros trs
animais.[1]
Pelo critrio adotado pela USP, se nenhum coelho apresentar um aumento
individual de temperatura de 0,5 C ou mais, acima da respectiva temperatura de
controle, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio. Se o aumento
individual for 0,5 C, o ensaio deve ser repetido em outros cinco coelhos. Se no
mximo trs dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de
23
0,5 C ou mais, e se a soma dos oito aumentos mximos individuais no exceder
3,3 C, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio.[13,15]
O ensaio de pirognio em coelhos, embora seja utilizado quando a
metodologia do LAL no aplicada, ainda mantido porque tem a seu favor a
situao do envolvimento de toda a reao fisiolgica do animal, constituindo um
teste de segurana para os produtos injetveis, lquidos para infuso e perfuso,
materiais cirrgicos e descartveis em geral. (FIG. 2)[9]
FIGURA 2 Mtodo in vivo. (Fonte: Charles River Laboratories)
1.5.1 Histrico
A maior parte da informao cientfica sobre pirognio foi adquirida nos
ltimos 70 anos, mas o estudo da febre, suas causas, mecanismos e efeitos so to
antigos quanto a medicina, datando de mais de 2000 anos atrs com os primeiros
mdicos gregos.[1,11]
Em 1912, Hort e Penfold realizaram importantes investigaes sobre a ento
denominada febre da injeo e foram os primeiros a planejar e padronizar um
ensaio de pirognio em coelhos.[1,11]
24
Em meados de 1920, Seibert completou uma srie de estudos que
comprovou que febres ocasionadas por injees associadas terapia intravenosa
resultavam de substncias de origem bacteriana, termoestveis e filtrveis,
comumente chamadas de pirognios.[4]
A Segunda Guerra Mundial ocasionou uma grande demanda de parenterais
de grande volume, levantando a necessidade de um ensaio oficial da Farmacopia
Americana (USP). Em 1941, o Comit de Reviso da USP autorizou a realizao do
primeiro estudo colaborativo sobre pirognio na Diviso de Bacteriologia do FDA
(Food and Drug Administration), envolvendo rgos do governo e 14 indstrias
farmacuticas. Os resultados desse estudo levaram incorporao do primeiro
ensaio oficial de pirognio em coelhos na 12 edio da USP em 1942.[4]
1.6 Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodo in vitro

O procedimento mais simples e amplamente usado para deteco de
endotoxinas baseia-se na gelificao. Volumes iguais de reagente LAL e da soluo
a ser analisada so transferidos a tubos de ensaio. A mistura homogeneizada
incubada em banho de gua a 37 oC por uma hora. O ponto final da reao
facilmente verificado pela remoo dos tubos e inverso a 180. A presena do gel
que se mantm slido durante a inverso considerada positiva para endotoxinas.
O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em considerao a sensibilidade
do LAL empregado, que varia de 0,25 a 0,015 UE mL-1. (UE = Unidade de
Endotoxina)[1,16]
O mtodo se baseia na reao entre os amebcitos e a endotoxina,
produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.[1]
O reagente LAL um extrato aquoso dos amebcitos, que so as clulas
sanguneas da hemolinfa azul da espcie de caranguejo ferradura Limulus
polyphemus, composto de enzimas que reagem em presena de pequenas
quantidades de endotoxina.[2,16]
O Limulus habita em alguns locais na costa do Oceano Atlntico dos Estados
Unidos at o Golfo do Mxico.[2]
25
Na preparao do lisado do amebcito de Limulus (LAL), os caranguejos so
submetidos sangria introduzindo-se uma agulha atravs do msculo entre as
regies cefalo-torcica e abdominal. A hemolinfa ento submetida aos processos
de estabilizao e purificao para a obteno dos amebcitos.[11,17]
A FIG. 3 mostra a seqncia do processo de obteno do sangue do Limulus
polyphemus.
(a)
(b)
(c)
(d)
26
(e)
(f)
(g)
(h)
FIGURA 3 (a) Limulus em praia da costa leste dos Estados Unidos, (b) e (c)
lavagem dos animais, (d) preparao para extrao do sangue, (e) Limulus
polyphemus, (f) extrao da hemolinfa, (g) recolhimento da hemolinfa e (h)
tratamento do extrato. (Fonte: Charles River Laboratories)
Os trabalhos de Levin e Bang indicaram que a formao de gel ocorre

quando a enzima de coagulao dos amebcitos ativada pela endotoxina, na
presena de ctions divalentes, adicionada protena coagulante (coagulognio)
(Esquema 1).[2,18]
A reao entre o lisado de amebcito e a endotoxina dependente da
concentrao de endotoxina, temperatura e pH.[13,18]
27
Endotoxina (LPS) + Ca2+
(1-3)-glucano
Fator C
ativado
Fator C
Fator B
Fator B
ativado
Fator G
ativado
Enzima
Procoagulante
Fator G
Enzima
Coagulante
Coagulognio
Coagulina
(Gel)
Esquema 1 Representao da reao em cascata entre LAL e endotoxina.[2]
1.6.1 Histrico
Em 1885, Howell observou que o sangue do Limulus polyphemus, o
caranguejo ferradura, formava um gel slido quando retirado do animal. Um ano
mais tarde, Loeb relatou que quando as clulas sanguneas do Limulus eram
coletadas e expostas a uma substncia estranha, elas se liquefaziam e em seguida
coagulavam. Este foi o primeiro de uma srie de artigos que Loeb publicou
detalhando vrios aspectos da coagulao com referncia particular aos
amebcitos, a nica clula circulante encontrada no sangue do Limulus.[4,11]
Posteriormente, Shirodkar e col. informaram que uma bactria marinha gramnegativa no identificada causava uma doena fulminante no caranguejo ferradura
caracterizada por uma coagulao intravascular considervel e morte.[4,11]
28
Em 1964, Levin e Bang verificaram que preparaes de endotoxina

termoestveis isoladas de Escherichia coli e um Vibrio marinho induziam a
coagulao extracelular da hemolinfa (sangue) do Limulus. Embora a endotoxina
no causasse coagulao do soro livre, a atividade coagulante podia ser restaurada
pela adio de amebcitos ao soro. As seguintes concluses puderam ser tiradas
do estudo: amebcitos so necessrios para coagulao, o rompimento dos
amebcitos potencializava a reao e quantidades de endotoxinas eram
provavelmente inativadas pela reao de coagulao.[4,11]
A habilidade dos amebcitos de coagular na presena de bactrias Gramnegativas ou suas endotoxinas no restrita somente ao Limulus e foi demonstrado
na lagosta, caranguejo e ostra.[4,11]
Num estudo subseqente, Levin e col. desenvolveram um ensaio sensvel
para endotoxina em plasma humano usando material lisado dos amebcitos de
Limulus. Neste trabalho, conseguiu-se detectar 0,0005 g de endotoxina por mililitro
e verificou-se que a velocidade de reao era dependente da concentrao de
endotoxina. Yin e col. refinaram o ensaio de endotoxina original de Levin para
determinar picogramas de endotoxina e demonstraram que a poro do lipdeo A do
lipopolissacardeo era responsvel pela gelificao do lisado.[4,11]
A necessidade de um teste de pirognio apropriado para os radiofrmacos,

de meia vida curta, levou Cooper e colaboradores a utilizar o mtodo do LAL para
estudar outras drogas. Um estudo comparativo feito em 1970 demonstrou que a
intensidade de formao do gel estava diretamente relacionada concentrao da
endotoxina, porm, alguns cuidados deveriam ser observados: a reao do LAL
requer pH neutro e dependente do tempo e da concentrao, alm de ser limitada
s solues aquosas ou aos extratos aquosos de produtos descartveis.[1,2]
Em 1980, o Bureau of Drugs publicou um ensaio cujo ttulo era Guidelines for
Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End Product Test for Human
and Veterinary Injectable Drugs and Medical Devices.[5,19]
29
O manual do Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos, de
1987 e o Teste para Endotoxinas Bacterianas da USP descrevem recomendaes
sobre critrios necessrios no uso do LAL para a validao de produtos para o uso
humano, ou em animais, e equipamentos mdicos, em substituio ao ensaio de
pirognio realizado nos coelhos.[1]
Devido natureza crtica da deteco de endotoxinas pelo LAL em produtos
farmacuticos, o FDA Office of Biologics estabeleceu condies padronizadas para
a produo e ajuste da potncia de LAL. Desde setembro de 1997, obteve-se a
globalizao do padro internacional da endotoxina, e do padro de referncia de
endotoxina (PRE), contendo 10.000 unidades internacionais de endotoxina por
ampola. Conforme estudos colaborativos envolvendo teste animal e LAL, um
nanograma de endotoxina de E.coli 055:B5 similar em potncia a 5 Unidades de
Endotoxina (UE) do PRE da USP. Alm disso, quando um LPS padronizado em
UE com um lote especfico de LAL e PRE, torna-se um PE (do ingls Control
Standard Endotoxin (CSE)), o que permite correlaes entre PRE (UE mL-1) e PE
(mg mL-1).[1]
Como mtodo de deteco de endotoxinas bacterianas, o ensaio de LAL foi
pela primeira vez introduzido na USP XX (1980).[1,15] No Brasil, foi incluso na 4.
Edio da Farmacopia em 1996.[1]
A adoo do ensaio de LAL passou a permitir limites quantitativos de
endotoxina. O limite de endotoxina para liberao de produtos parenterais, com
base na dose, corresponde a K/M, onde K igual a 5 UE por Kg de peso corpreo,
e M igual dose mxima humana recomendada por Kg, que pode ser
administrada no perodo de uma hora. Conforme definido pelo Center for Devices
and Radiological Health (CDRH) do FDA, os limites atuais para dispositivos mdicos
so de 0,5 UE mL-1 e 0,06 UE mL-1 para aqueles em contato com o fluido
cerebrospinal. Os clculos de dose so baseados em peso corpreo humano de 70
kg.[1,14,19]
30
A Farmacopia Americana (USP) adotou limites especficos para diversos
produtos como, por exemplo, o de 175 UE por dose para os radiofrmacos.
[10,15,17]
A metodologia apresentada na Farmacopia Brasileira [20] admite o mtodo
de gelificao, turbidimtrico ou colorimtrico do tipo cintico ou leitura final para
determinao de pirognio/endotoxina. Para a tcnica de gelificao, exigida a
validao, incluindo o teste de sensibilidade do reagente LAL, utilizando srie de
diluio do Padro de Referncia de Endotoxina (PRE) ou Padro de Endotoxina
(PE), padronizado em relao ao PRE, com razo geomtrica igual a 2, para obter
as concentraes de 0,25, 0,5, e 2, em que a sensibilidade declarada do
reagente LAL em UE mL-1 (Unidade de Endotoxina por mililitro), e o ensaio de
inibio ou potencializao de resposta, executado para avaliar a compatibilidade do
produto. A validao dever ser repetida em caso de mudana de fornecedor do
LAL [1,20,21], ou de mudana significativa na formulao da amostra.[1,20]
1.7 Validao do Ensaio do LAL
Historicamente, fabricantes de parenterais de grande volume tm se
dedicado principalmente ao desenvolvimento de ensaios de endotoxina bacteriana
devido problemtica de concentraes mnimas de endotoxina bacteriana em
solues administradas em grandes quantidades. Porm, muitos dos problemas
atuais se referem recuperao do controle positivo do padro de endotoxina,
exacerbada pela natureza qumica dos materiais que esto sendo validados.[4]
Alguns tipos comuns de compostos que apresentam problemas nos ensaios
de endotoxina para parenterais de pequeno volume incluem drogas insolveis em
gua, drogas com atividade que simula a de endotoxina, drogas que contm
endotoxina (que deve ser removida antes da validao), drogas com potncias
variadas, drogas mltiplas num mesmo recipiente, e drogas com grande potencial
de interferncia como os quimioterpicos.[4]
31
O grande desafio de um laboratrio de anlise de parenterais o
desenvolvimento de um ensaio de LAL que seja robusto, reprodutvel e
automatizado para uso rotineiro.[4,22]
Sob o ponto de vista legal, o ensaio de LAL deve atender aos requisitos dos
compndios oficiais e no necessita ser quantitativo exceto na sua capacidade de
demonstrar a deteco da concentrao limite de endotoxina (mtodo de formao
de gel).[4]
As caractersticas de uma boa validao do ensaio de LAL que contempla em
termos gerais, os mtodos cinticos e de formao de gel, incluem ausncia de
interferncia (positivos so positivos e negativos so negativos), solubilidade
adequada do produto quando reconstitudo e diludo ou simplesmente diludo,
demonstrao de que o mtodo escolhido no reduz ou destri a endotoxina que
pode estar presente caso sejam empregadas condies drsticas ou solventes,
meio de pH neutro da amostra com o reagente LAL (6,0 a 8,0), documentao dos
artigos consumveis no ensaio atestando a condio livre de endotoxina, registros
apropriados dos equipamentos utilizados.[4]
Ao se estabelecer um mtodo para o ensaio de LAL para um frmaco devese identificar uma concentrao de amostra compatvel para a anlise de rotina. A
compatibilidade do LAL uma condio onde um padro de endotoxina detectado
com a mesma eficincia numa amostra de produto ou em gua para injeo.[23]
necessrio realizar a validao do Ensaio de Gelificao ou Formao de
Gel em radiofrmacos para administrao parenteral. Mtodos oficiais de vrios
pases e o Guia para o Ensaio de LAL do FDA (Food and Drug Administration)
requerem um mnimo de 3 lotes de cada produto para a validao com um
fornecedor especfico de reagente LAL.[19,24]
Uma validao deve demonstrar que as amostras no interferem no ensaio
de LAL considerando dois fatores importantes: (1) determinao da sensibilidade do
LAL e (2) determinao da potencializao ou inibio do teste de LAL.[12]
32
A validao do ensaio de LAL garante que independentemente do mtodo ou

lote, em determinadas diluies do produto no h interferncias e, portanto a
quantificao de endotoxinas em uma dada amostra confivel. [2,15,20] O que se
valida a amostra e a sua diluio, e no se trata, por exemplo, de realizar ensaios
de linearidade, exatido ou preciso como se descreve para a maioria dos mtodos
analticos.[2]
1.8 Interferncias
Dentre as fontes comuns de interferncia no ensaio de determinao de
endotoxina incluem-se condies em que se realiza a reao enzimtica de
gelificao, ou que alteram a disperso da endotoxina . Entretanto, alguns produtos
podem provocar a inibio ou a potencializao da reao. Muitas destas
substncias que causam interferncias so compostos de peso molecular
relativamente alto formados de unidades repetidas, com elevada incidncia de
polissacardeos. Por isso, a inibio ou a potencializao devem ser determinadas
para cada formulao.[25]
Podemos incluir tambm como fontes de interferncia: condies no timas
de pH, agregao ou adsoro da endotoxina, concentraes no adequadas de
ctions divalentes, modificao da enzima ou protena, ativao no especfica do
reagente LAL.[4,25]
A reao LAL-endotoxina otimizada na faixa de pH 6,4 a 8,0. Abaixo ou
acima da neutralidade, a reatividade do LAL diminui. A utilizao de tampes e
diluies minimiza esse problema.[4,25]
A endotoxina uma molcula grande com regies lipoflicas e hidroflicas
permitindo interaes com outras molculas de endotoxina e certas substncias
formando micelas. Com o aumento da agregao molecular, diminui a reatividade
do LAL. So utilizados agentes catinicos dispersantes em soluo a 2%, mas
geralmente, diluies minimizam os efeitos inicos a uma faixa permissvel.[25]
33
Os tubos de diluio da endotoxina devem ser de vidro borossilicato de alta
qualidade para evitar adsoro da endotoxina nas paredes e, em caso de lavagem e
reutilizao, deve-se tomar cuidado para remover todos os traos de detergente
para evitar formao de micela. O uso de tubos de plstico, principalmente de
polipropileno, no recomendado.[4,25,26,27]
Os ctions divalentes desempenham um importante papel na reatividade do
LAL e na disperso da endotoxina. A reatividade do LAL ser diminuda ou
aumentada se as concentraes de clcio e magnsio no estiverem otimizadas.
[25,28,29] Quelantes orgnicos esto em frmulas de medicamentos com o
propsito de complexar ctions de metais pesados que contribuem para a
instabilidade. Anticoagulantes tambm, como a heparina sdica e o citrato ligam-se
ao clcio por quelao e inibem o teste de LAL, havendo necessidade de reposio
de ctions divalentes. A melhor forma de corrigir a depleo de clcio calcular a
quantidade de clcio necessria e acrescentar cloreto de clcio livre de pirognio.
Ctions divalentes so adicionados aos lisados para aumentar a sensibilidade do
LAL.[25] Porm os nveis de clcio devem ser ajustados cuidadosamente para evitar
um clculo exagerado dos nveis de endotoxina quando analisar drogas que
contenham sais de Ca ou Mg.[25,30]
O fenmeno da gelificao baseado numa cascata de coagulao
enzimtica que envolve serina proteases (Esquema 1). A inativao da enzima
devido a oxidantes, antioxidantes, agentes proteolticos ou inativantes especficos
causar inibio. A propriedade desnaturante de lcoois e fenis limita seus nveis
no produto analisado. O caminho prtico para resolver esses problemas, mais do
que diluio aplicar tcnicas especficas, por exemplo, inativao qumica ou por
calor.[25]
Eluies ou extratos de certos materiais celulsicos podem conter traos de
um agente conhecido como material reativo do LAL ou (1-3) D-glucano. Esta
substncia aparentemente inicia a reao de gelificao do LAL por um caminho
enzimtico alternativo. Foi verificada a presena de glucanos em filtrados
provenientes de filtros de acetato de celulose. Esta interferncia pode ser evitada,
substituindo-se a fonte de glucano por outro tipo de filtro.[25,31]
34
1.9 Outros Mtodos para Determinao de Endotoxinas

Embora o ponto final de gelificao seja o mais amplamente usado dentre os
mtodos de LAL, apresenta a desvantagem de impedir a quantificao da
endotoxina em nveis abaixo daqueles em que se forma o gel consistente.[1,11]
Assim, existem outros mtodos, entre eles, turbimtrico quantitativo,
colorimtrico
de
protena,
nefelomtrico
cromognico
quantitativo
que
proporcionam informaes quantitativas e qualitativas acerca da concentrao de

endotoxina nas amostras.[1,11]
1.9.1 Mtodo Turbidimtrico Quantitativo
Este ensaio baseado no fato de que qualquer aumento na concentrao de
endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez devido precipitao de
protena coagulvel (coagulognio) no lisado. Procede-se leitura da densidade
ptica de vrias diluies da substncia a ser analisada contra curva-padro e so
obtidas medidas quantitativas de endotoxinas, em grande faixa de concentraes.
[1,11] Nesta tcnica cintica, mede-se o tempo necessrio para se atingir uma
absorbncia pr-determinada da mistura de reao ou a velocidade de
desenvolvimento da turbidez.[4,12]
Levin e Bang em 1968 foram os primeiros a propor um mtodo cintico
turbidimtrico para a determinao de endotoxinas com o reagente LAL.[18]
Inicialmente este mtodo era pouco empregado devido provavelmente carncia de
equipamentos capazes de manipular vrias amostras ao mesmo tempo. Algumas
modificaes foram feitas para simplificar e facilitar a aplicao desta metodologia, a
saber, o emprego de um leitor de microplacas de alta resoluo dotado de um
incubador a 37 C, o uso de um programa de computador para a aquisio e
processamento dos dados e uma formulao de reagente LAL mais sensvel.[2]
35
1.9.2 Mtodo Colorimtrico de Protena
Conforme o mtodo de formao do gel, quantidades da amostra e lisado so
misturadas em tubos, incubadas por 1 hora a 37 oC e ento centrifugadas. No
sobrenadante, a protena do coagulognio determinada pelo mtodo de Lowry,
com a utilizao de um espectrofotmetro, com leituras em 660 nm.[1,11]
1.9.3 Mtodo Nefelomtrico
Tem sido utilizado principalmente na determinao de endotoxinas em
solues parenterais de grande volume. baseado na disperso relativa de luz,
utilizando-se um nefelmetro a laser Hyland. Assim como o mtodo colorimtrico, o
mtodo nefelomtrico no tem se mostrado promissor.[1,11]
1.9.4 Mtodo Cromognico Quantitativo
Baseia-se na ao da endotoxina bacteriana para ativao da enzima de
coagulao, que reage com um substrato cromognico sinttico incolor. Este
substrato composto por um pequeno peptdeo ligado pela arginina C-terminal a
uma molcula do cromforo p-nitroanilina (pNA). Uma vez ativada a reao
enzimtica em cascata, a enzima de coagulao provoca a liberao da molcula
de pNA de cor amarela. O desenvolvimento da cor proporcional concentrao de
endotoxina na amostra.[2] A liberao do cromforo pode ser monitorada
espectrofotometricamente, em 405 nm.[1] Nesta tcnica cintica, mede-se o tempo
necessrio para se atingir uma absorbncia pr-determinada da mistura de reao
ou a velocidade de desenvolvimento da cor.[4,12]
O esquema que descreve o princpio do mtodo pode ser representado pelas
equaes 1 e 2:
36
Pr-enzima
Endotoxina
Enzima + substrato
cromognico
Enzima
(1)
Peptdeo + p-nitroanilina
(=405 nm)
(2)
Esquema 2 Fases envolvidas na determinao de endotoxina bacteriana,

pelo mtodo cromognico. (Fonte: Charles River Laboratories)
Embora pelo mtodo cromognico a faixa de concentrao de endotoxina
seja ampla, a velocidade da reao lenta e proibitiva quando necessrio realizar
grande nmero de amostras, o que pode ser superado com um sistema semiautomtico cintico, por exemplo, leitor de ELISA e programa especfico de
computador.[1]
Para assegurar a validao das tcnicas cinticas turbidimtricas e
cromognicas, so necessrios ensaios para verificar se os critrios para a curva
padro so vlidos e que a amostra no inibe ou potencializa a reao. Uma
revalidao do mtodo de ensaio necessrio quando as condies que
influenciam o ensaio so alteradas.[4]
37
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi validar o mtodo de determinao de endotoxina
bacteriana para os radiofrmacos m-iodobenzilguanidina-131I (MIBG-131I), citrato de
Glio-67 (67Ga), cloreto de Tlio-201 (201Tl) e reagentes liofilizados cido
Dietilenotriaminopentactico (DTPA), Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro
Albumina Humano (SAH) e Estanho Coloidal (Sn Coloidal).
38
3 REVISO DA LITERATURA
Zijlstra e col. (1997) [10] realizaram a validao em amostras de
radiofrmacos de meia vida curta, como o Fluordeoxiglicose-18F, Acetato-11C e
Amnia-13N, pelo mtodo cintico turbidimtrico do LAL. A sensibilidade do reagente
LAL utilizado foi de 0,03 UE mL-1 e o limiar da densidade ptica foi definido em 0,02
unidades de absorbncia. O tempo de reao foi calculado por anlise de regresso
e foi estabelecido em 1800 s. Os resultados demonstraram que o ensaio inibido
pelo pH e potencializado por nions para Amnia-13N.
McCullough e Weidner-Loeven (1992) [32] estudaram a variabilidade no
Ensaio do LAL comparando trs mtodos cinticos para avaliao de treze produtos
farmacuticos injetveis. Para todos os ensaios foi construda uma curva padro na
faixa de 0,05 a 5,0 UE mL-1. A sensibilidade lambda () ou o menor ponto da curva
padro foi 0,05 UE mL-1. Foram utilizados dois mtodos para o ensaio turbidimtrico
que diferiam somente na proporo de amostra e reagente LAL, com leitura
espectrofotomtrica em 340 nm, e o mtodo cintico cromognico com leitura em
405 nm. Cada produto foi analisado em trs concentraes: diluio da MDV
(Mxima Diluio Vlida), metade da MDV e 0,10 da MDV. Foi verificado que a
maioria das amostras foi inibitria e que a diluio simples com gua apirognica
mostrou-se maneira fcil e efetiva de minimizar as interferncias. Recuperaes
satisfatrias dos controles positivos dos produtos (RCPP) foram observadas para
cada um dos 13 produtos avaliados em no mnimo um dos trs mtodos cinticos
utilizados, sugerindo que problemas causados pela variabilidade da %RCPP podem
ser facilmente controlados no laboratrio pela flexibilidade na escolha do mtodo.
McCullough (1990) [33] observou que h diferenas na formulao de lisados
de diferentes fabricantes na capacidade tamponante, presena e concentrao de
agentes tensoativos e concentrao de ctions divalentes. Cada uma dessas
diferenas pode afetar os perfis de inibio/potencializao (interferncias)
observados durante a validao do produto. Foi tambm reconhecido que a
compatibilidade do lisado com o produto pode mudar de acordo com o mtodo
39
escolhido: formao de gel, turbidimtrico ou cromognico, e o Guia do FDA
recomenda que os produtos sejam revalidados sempre que o mtodo for alterado.
Podem ocorrer ainda, variaes de lote a lote no pH das solues parenterais,
concentrao do sal, concentrao de ction divalente, tampes, conservantes,
fonte da matria prima e mesmo outras possveis endotoxinas. Foram feitas vrias
consideraes para se evitar tais problemas.
Murata e col. (1976) [34] avaliaram a sensibilidade do ensaio do Limulus e os
fatores inibitrios em 21 radiofrmacos comumente utilizados no Japo. A
sensibilidade verificada foi de 1 g mL-1 para a endotoxina de E. coli, sendo cerca
de dez vezes a sensibilidade do ensaio em coelhos adotado pelas Farmacopias
Americana e Japonesa. O ensaio de LAL foi aplicvel sem reao inibitria na
avaliao de
131
99m
TcO4-, albumina -99mTc, MAA -99mTc, Sn Coloidal -99mTc, Hippuran-
I, Na131I, Na251CrO4, Citrato de
111
67
Ga e Bleomicina-57Co. Por outro lado, DTPA-
In, Fitato-99mTc, Pirofosfato-99mTc, PVP-99mTc,
FeCl3, Na332PO4,
59
198
Au Coloidal e
Selenometionina-75Se necessitaram de ajuste de pH com tampo Tris-HCl para

evitar inibio na reao de gelificao. A faixa tima de pH encontrada para a
reao foi 6,0-7,5. Para anlise de rotina, o ensaio do Limulus mostrou-se mais
simples, rpido e sensvel do que o ensaio em coelhos e 19 dos 21 radiofrmacos
estudados apresentaram condies para a sua utilizao.
Cooper e col. (1971) [13] estudaram os mtodos in vitro (LAL) e in vivo
(coelhos) para a deteco de endotoxina em radiofrmacos de meia vida curta,
comparando quantitativamente a sensibilidade endotoxina do ensaio de Limulus
com a resposta pirognica em coelhos usando lipopolissacardeos purificados de E.
coli e Klebsiella. A sensibilidade dos coelhos aos efeitos pirognicos de endotoxinas
purificadas foi avaliada com 4 diferentes doses. No ensaio LAL, foi observado que
foram necessrias quantidades menores da endotoxina de Klebsiella do que da
endotoxina de E. coli para provocar a formao do gel. A velocidade de gelificao
e/ou aumento da viscosidade foi proporcional concentrao de endotoxina. O
ensaio LAL detectou concentraes menores de endotoxina do que o uso dos
coelhos.
40
4 MATERIAIS E MTODOS
Os protocolos de validao foram estabelecidos para os radiofrmacos
m-iodobenzilguanidina-131I (MIBG-131I), citrato de Glio-67 (67Ga),
cloreto de
201
Tlio-201 (
Tl) e para os reagentes liofilizados cido Dietilenotriaminopentactico
(DTPA), Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro Albumina Humano (SAH) e

Estanho Coloidal (Sn Coloidal).
As frmulas dos produtos radioativos expressam a concentrao radioativa
da soluo (MBq mL-1) por lote. A composio dos reagentes liofilizados para
marcao com 99mTc apresentada por lote e por frasco analisado. (TAB. 1)
TABELA 1 Frmulas dos produtos

Produtos Radioativos
Produto
MIBG-
Reagente
131
pH final: 4,0-6,0
67
Ga
pH final: 4,5-8,0
201
Tl
pH final: 5,5-7,0
MIBG
131
Na
Quantidade/lote
2,0 14,0 mg
1295 - 16650 MBq
(NH4)2SO4
4,0 14,0 mg
Etanol:gua Purificada (1:1)
0,2 - 0,25 mL
CuSO4 1%
20,0 40,0 L
NaCl 0,9%-lcool benzlico 1%
40,0 50,0 mL
Cloreto de 67Ga
Citrato de sdio 3,8%
HCl 3,5 mol L-1
H2O2 30 %
gua purificada
Cloreto de 201Tl
NaCl 0,9%
Volume final da soluo
55500 MBq
47,0 mL
2,0 mL
1,0 mL
67,0 mL
11100 - 12950 MBq
120,0 mL
40,0 mL
Concentrao
radioativa/lote
51,8 1110 MBq mL-1
407 MBq mL
-1
111 MBq mL-1
41
Reagentes Liofilizados para Marcao com 99mTc
Quantidade/lote
Quantidade/
frasco
7,0 g
10,0 mg
0,700 g
1,0 mg
1,4 g
2,0 mg
q.s.
---
663,0 mL
---
700,0 mL (para 700

frascos de 1 mL)
1 mL
cido Ftico
14,0 g
20,0 mg
SnCl2.2H2O
0,700 g
1,0 mg
10,0 mL
---
HCl 2 mol L
28,0 mL
---
gua Purificada
662,0 mL
---
700,0 mL (para 700

frascos de 1 mL)
1 mL
8,0 g
100,0 mg
TINAST (ascorbato de estanho)
0,180 g
2,0 mg
NaCl 0,9%
80,0 mL
---
q.s.
---
80,0 mL (para 80
frascos de 1 mL)
1 mL
Soro Albumina Humano 20%
10,0 mL
10,0 mg
SnCl2.2H2O
0,133 g
0,04 mg
NaCl 0,9%
187,0 mL
---
q.s.
---
2,0 mL
---
200,0 mL (para 200

frascos de 1mL)
1 mL
Fluoreto de sdio (NaF)
0,700 g
1,0 mg
Fluoreto de Sn (SnF2)
0,0875 g
0,125 mg
Polivinilpirrolidona-40 (PVP-40)
0,318 g
0,5 mg
700,0 mL
---
700,0 mL (para 700

frascos de 1 mL)
1 mL
Produto
Reagente
DTPA
cido dietilenotriaminopentactico
pH final: 4,0
SnCl2.2H2O
cido para-aminobenzico (PABA)
NaOH 1 mol L
-1
gua Purificada
Fitato
pH final: 6,0
-1
HCl 0,1 mol L

-1

GHA
pH final: 5,06,0
Glucoheptonato de clcio
NaOH 1 mol L
-1

SAH
pH final: 5,0
-1
HCl 1 mol L
-1
HCl 0,1 mol L
Sn Coloidal
pH final: 4,06,0
gua Purificada
42
4.1 Materiais
4.1.1 Materiais utilizados no Mtodo in vitro de Determinao de Endotoxina
Bacteriana por Formao de Gel
No mtodo de formao de gel, foi utilizado Reagente do Lisado de

Amebcito de Limulus (LAL) com licena de registro no Ministrio da Sade,
combinado com o Padro de Endotoxina (PE) com Certificado de Anlise do
fabricante (LAL e PE da Endosafe, Charleston, EUA). A sensibilidade lambda () do
LAL declarada pelo fabricante foi de 0,125 UE mL-1. Todas as diluies foram feitas
em frascos de vidro despirogenizados no IPEN (tratados termicamente a 250 C por
30 minutos) com ponteiras estreis livres de pirognio (MLA) e gua livre de
pirognio (Sterile Water for Injection - Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC). Tubos
plsticos despirogenizados com tampa (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) contendo
0,1 mL de amostra e 0,1 mL de LAL foram incubados em banho-maria Eletrolab a
371 C, por 602 minutos.[4,15] Os dados dos materiais utilizados foram
registrados em ficha conforme modelo no Anexo 1.
4.1.2 Materiais utilizados no Mtodo Cromognico PTS de Determinao de

Endotoxina Bacteriana
Para os ensaios quantitativos cromognicos foram utilizados cartuchos

(Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) com 4 canais contendo o reagente LAL e um
substrato cromognico. Dois canais so os controles negativos do produto e dois
com endotoxina na concentrao de 0,3 UE mL-1 so os controles positivos do
produto (FIG. 4). As leituras das amostras foram feitas utilizando Sistema de Teste
Porttil (PTS) (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) a 371 C (FIG. 5).
43
FIGURA 4 - Representao do Cartucho PTS para Determinao de Endotoxina.

(Fonte: Alko do Brasil)
FIGURA 5 - Sistema de Teste Porttil (PTS). (Fonte: Alko do Brasil)
44
4.1.3 Materiais utilizados no Mtodo Turbidimtrico de Determinao de
Endotoxina Bacteriana
Para o ensaio quantitativo turbidimtrico, foram utilizados: reagente LAL KTS

(Kinetic Turbidimetric System) com sensibilidade de 0,05 UE mL-1 (Endosafe, Inc.TM,
Charleston, SC), Padro de Endotoxina utilizado no mtodo de formao de gel em
concentraes de curva padro de 5,0, 0,5 e 0,05 UE mL-1, placas apirognicas
descartveis de poliestireno com 96 poos para leitura dos padres e das amostras,
espectrofotmetro TECAN SUNRISE (FIG. 6) com programa Endoscan-V
(Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) para leitura em 340 nm.
FIGURA 6 - Espectrofotmetro TECAN SUNRISE. (Fonte: Charles

River Laboratories)
4.2 MTODOS
4.2.1 Mtodo de Formao de Gel
As amostras foram preparadas conforme o Teste de Endotoxinas Bacterianas
(TEB) descrito na Farmacopia Americana.[15]
45
O controle negativo do produto foi preparado adicionando-se gua em uma
proporo definida e conhecida, o controle positivo do produto foi preparado com o
dobro da concentrao do controle negativo mais a mesma quantidade de Padro
de Endotoxina (PE) em concentrao de 0,50 UE mL-1.
Nos ensaios de verificao de interferncias, o controle negativo do produto,
o controle positivo do produto e o controle negativo da gua foram realizados em
duplicata.
Em cada frasco dos reagentes liofilizados DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn
Coloidal, adicionou-se gua livre de pirognio para a reconstituio, diluio e
preparao dos controles negativo e positivo dos ensaios de inibio ou
potencializao. As sries de diluies sucessivas de cada produto com a
endotoxina tambm foram preparadas a partir de um nico frasco e a quantidade de
gua adicionada variou com o fator de diluio. Para uma diluio de 16 vezes,
acrescentou-se 4 mL de gua no frasco, retirou-se 1 mL para outro frasco e
adicionou-se 3 mL de gua.
O volume das amostras dos radiofrmacos MIBG-131I,
67
Ga e
201
Tl foi de 0,1
mL. Adicionaram-se 0,9 mL de gua em cada frasco, resultando um fator de diluio

de 1:10. A partir da, foram feitas diluies para o controle negativo e positivo do
produto para os ensaios de inibio ou potencializao. Para as sries de diluies
sucessivas do produto e endotoxina, o volume de gua acrescentado amostra
inicial foi 4,9 mL (Diluio 1:50).
Procedeu-se aos ensaios de inibio ou de potencializao e aos ensaios

para a determinao da sensibilidade do reagente LAL, em que os produtos foram
submetidos a ensaios em diluies seriadas, com a preparao das diluies
sucessivas de padro de endotoxina em gua e diluies sucessivas de padro de
endotoxina com o produto.[19]
O resultado interpretado como positivo ou negativo. Um resultado positivo
apresenta a formao de um gel firme capaz de manter a sua integridade aps
46
retirar cuidadosamente cada tubo do banho-maria e inverte-lo 180 (FIG. 7). O
resultado negativo para endotoxina quando no h formao de gel ou formao
de um gel que no adere ao fundo quando o tubo invertido.[1,4,15]
FIGURA 7 - Inverso a 180 do tubo de reao.
4.2.1.1 Preparao das Diluies Sucessivas de Padro de Endotoxina

Diluies do PE de 0,5 UE mL-1 em gua foram preparadas diluindo-se 1 mL
de PE de 1 UE mL-1 com 1 mL de gua. Para se obter a diluio de 0,25 UE mL-1, 1
mL do PE de 0,5 UE mL-1 foram posteriormente diludos com 1 mL de gua. Em
seguida, diluies dobradas sucessivas (0,125, 0,06 e 0,03 UE mL-1 de PE em
gua) foram feitas conforme Esquema 3 e as amostras foram incubadas em
quadruplicata.
4.2.1.2 Preparao das Diluies Sucessivas do Produto com Padro de

Endotoxina
De modo semelhante ao item anterior, diluies sucessivas do produto com
endotoxina foram preparadas com quantidades iguais de amostra do produto em
uma diluio definida e concentrao em dobro do PE (Esquema 3). 0,1 mL de cada
uma das diluies foi incubado em quadruplicata com 0,1 mL de LAL.
47
Foram observadas as menores concentraes de endotoxina em que ocorreu

a formao de gel firme em duas sries paralelas de diluies sucessivas de Padro
de Endotoxina em gua e de Padro de Endotoxina no produto na diluio definida.
Os resultados em 3 lotes consecutivos de cada produto foram registrados.[15]
1 mL gua
PE
1 mL
1 UE mL -1
s/A
1 mL gua
1 mL
0,5UE mL-1
0,5 mL A
1 mL
s/A
1 mL
1 mL gua
s/A
1 mL
1 mL gua
s/A
0,25UE mL-1 0,125UE mL-1 0,06UE mL-1 0,03UE mL-1
0,5 mL
0,5UE mL-1
s/A
1 mL gua
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,25UE mL-1 0,125UE mL-1 0,06UE mL-1 0,03UE mL -1
0,5 mL A
0,5 mL A
0,5 mL A
0,5 mL A
Diluies
Sucessivas do
Padro de
Endotoxina
Diluies
Sucessivas do
Produto com
Padro de
Endotoxina
A dobro da concentrao da amostra do controle negativo

Esquema 3 Representao das Diluies da Curva Padro em gua e no Produto
4.2.1.3 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL

Os reagentes LAL foram padronizados quanto sensibilidade para
endotoxina de E. coli (concentrao de endotoxina detectada pelo reagente).[1]
A sensibilidade do reagente LAL (em UE mL-1) foi calculada pela mdia
geomtrica da menor concentrao de endotoxina em que ocorreu a gelificao,
conforme a equao 3:
48
Mdia Geomtrica da Concentra o do Ponto Final = antilog
onde
e
f
(3)
o log das concentraes do ponto final de gelificao das sries de
diluies e f o nmero de replicatas.

A sensibilidade do lisado foi obtida a cada novo lote de Reagente LAL ou
quando ocorreu alterao nas condies experimentais.[15]
4.2.2 Mtodo Cromognico - PTS
Introduziu-se volume de 25 microlitros (L) de amostra na diluio do ensaio
nos quatro reservatrios de cada cartucho que foi inserido no PTS. As amostras
foram aspiradas e misturadas com os reagentes, sendo ento incubadas.
Cada lote de cartucho possui um cdigo de calibrao que est relacionado
com uma curva padro do log do tempo de reao pelo log da concentrao de
endotoxina, construda na faixa de 2 log. Depois que a reao ocorre, a intensidade
da cor medida e a densidade ptica comparada com a curva padro arquivada
internamente especfica para cada lote de cartucho. O tempo de cada anlise foi de
15 a 20 minutos, com leitura da intensidade de cor em 405 nm.
Pela interpolao do tempo de reao necessrio para alcanar determinada
densidade ptica foram calculados a Concentrao de Endotoxina no Produto (CEP)
e o Controle Positivo do Produto (CPP).[1] Os critrios para a validao em uma
determinada diluio so: Coeficiente de Variao (CV) e Recuperao do Controle
Positivo do Produto (RCPP). O coeficiente de variao (CV) a diferena percentual
de leitura entre as amostras. A porcentagem de recuperao do controle positivo do
produto (RCPP) representa a relao entre a concentrao de endotoxina do
controle positivo do produto e uma concentrao especfica de endotoxina (0,3 UE
mL-1).[15]
49
4.2.3 Mtodo Turbidimtrico

Foram introduzidos em duplicata, nos poos de uma placa de poliestireno,
0,1 mL de cada concentrao do Padro de Endotoxina, 0,1 mL de amostra diluda
para o controle negativo do produto, 0,1 mL de amostra contaminada com
endotoxina na concentrao de 0,5 UE mL-1 para o controle positivo do produto, e
0,1 mL de gua para o controle negativo da gua. A seguir, pipetou-se rapidamente
0,1 mL de LAL KTS reconstitudo com gua, iniciando pelo controle negativo em
direo concentrao mais alta de endotoxina. A placa foi colocada na cmara do
espectrofotmetro para dar incio reao.
Os parmetros de ensaio foram definidos em: tempo de coleta 3600
segundos, intervalo de tempo para obteno de leitura 30 segundos, temperatura da
placa 371 C.
Foram obtidos os valores de: Tempo Mdio de Reao (s), %CV e Valor
Calculado (UE mL-1) para cada uma das concentraes de endotoxina (5,0; 0,5 e
0,05 UE mL-1). Foi construda a curva padro do log do tempo de reao pelo log da
concentrao de endotoxina, na faixa de 2 log e foram calculados os parmetros de
coeficiente angular, coeficiente linear e coeficiente de correlao (R) da curva
padro.
Pela interpolao do tempo de reao necessrio para alcanar determinada
densidade ptica foram calculados a Concentrao de Endotoxina no Produto (CEP)
e o Controle Positivo do Produto (CPP).[1] Os critrios para a validao do produto
em uma determinada diluio so: Coeficiente de Variao (CV) e Recuperao do
Controle Positivo do Produto (RCPP).[15]
50
5 RESULTADOS E DISCUSSO
Para evitar interferncias devido s condies do teste e reduzir a

probabilidade de se detectar nveis de endotoxina clinicamente insignificantes,
podem ser feitas diluies do produto. So utilizados limites para se determinar a
extenso da diluio (Mxima Diluio Vlida MDV) que pode ser aplicada para
evitar um problema de interferncia, e cujo resultado de concentrao de endotoxina
no produto no exceda a concentrao limite de endotoxina.[15,19]
O limite de endotoxina estabelecido para radiofrmacos 175 UE por dose,
onde a dose (volume mximo recomendado) 7,0 mL.[10,15,17]
5.1 Validao dos Produtos pelo Mtodo de Formao de Gel

5.1.1 Clculo de MDV
A MDV a mxima diluio vlida permitida de um produto, na qual o limite
de endotoxina pode ser determinado. A equao geral para determinar a MDV [19]
MDV =
(4)
Limite de Endotoxina x Potncia do P roduto

sensibilidade declarada (UE por mL) do Reagente LAL
Para MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl, DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal, a
concentrao limite de endotoxina (L.E.) 175 UE por dose, resultando em limite de

endotoxina de 25 UE mL-1 . Aplicando na Equao 4 onde a potncia 1,00 mL por
mL para drogas administradas em volume por quilograma e a sensibilidade
declarada do Reagente LAL utilizado ( = 0,125 UE mL-1) obtm-se o fator de MDV.
[19] O fator o limite de diluio do produto para o ensaio ser vlido.
O resultado do clculo de MDV para os radiofrmacos MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl,
DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal pelo mtodo de formao de gel, utilizando a
sensibilidade declarada do LAL de 0,125 UE mL-1, foi 200, isto , os produtos
51
podem ser diludos at 200 vezes de modo que a endotoxina ainda pode ser
detectada.
Para produtos que no tm uma concentrao limite de endotoxina oficial
publicada (USP ou FDA), a equao de MDV considera a Mnima Concentrao
Vlida (MCV). A MCV a menor concentrao da amostra que pode ser analisada e
ainda possuir a sensibilidade adequada.
XM
K
(5)
Potncia do produto
MCV
(6)
MCV =
MDV =
onde M a dose humana mxima por kg no perodo de uma hora (dose de 7 mL

para radiofrmacos e considerando 70 kg o peso mdio de um homem adulto) e K
5,0 UE kg-1 para drogas parenterais.[19]
Considerando K = 2,5 EU kg-1 para radiofrmacos conforme a Farmacopia
Europia [12], utilizando as equaes 5 e 6, o resultado de Mxima Diluio Vlida
para os radiofrmacos 200, confirmando o valor obtido atravs da Equao 4.
5.1.2 Inibio ou Potencializao

Para que o mtodo de formao de gel seja considerado vlido, deve ser
confirmado se o produto inibe ou potencializa a reao de LAL para a deteco de
endotoxinas. Vrios lotes de MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl, DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn
Coloidal foram submetidos ao teste USP realizando-se diluies seriadas para

verificao de interferncias de inibio ou potencializao.
Ocorre inibio quando h quantidade suficiente de endotoxina para a
formao de gel, porm a amostra impede a sua formao. Ocorre potencializao
quando h formao de gel mesmo sem haver quantidade suficiente de endotoxina.
[35]
A TAB. 2 apresenta os resultados dos ensaios de interferncia nas diluies
seriadas dos produtos DTPA, GHA, Fitato, SAH e Sn Coloidal.
52
TABELA 2 - Resultados dos Ensaios de Interferncia nas Diluies Seriadas
de DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal
Produto
DTPA
Fitato
GHA
SAH
Sn Coloidal
+ = Gel firme
Diluio do
Produto
Controle Negativo
Controle Positivo
pH
1:4
7,0
1:8
7,0
1:16
++
++
7,0
1:32
++
++
7,0
1:64
++
++
7,0
1:100
++
++
++
++
7,0
1:120
++
++
++
++
7,0
1:150
++
++
++
++
7,0
1:200
++
++
7,0
1:240
++
++
7,0
1:2
++
++
++
++
7,0
1:4
++
++
7,0
1:6
++
++
7,0
1:8
++
++
7,0
1:16
++
++
7,0
1:32
++
++
7,0
1:4
++
++
7,0
1:8
++
++
7,0
1:16
++
++
7,0
1:32
++
++
7,0
1:64
++
++
7,0
1:4
7,0
1:8
++
++
7,0
1:16
++
++
7,0
1:32
++
++
7,0
1:64
++
++
7,0
= Nenhum gel ou gel no firme
As diluies que no apresentaram interferncia para DTPA, Fitato, GHA,

SAH e Sn Coloidal foram a partir de, respectivamente, 1:16, 1:200, 1:4, 1:4 e 1:8.
53
McCullough [33] recomendou que a concentrao de escolha para o teste
seja abaixo da MDV, mas acima da concentrao no interferente definida porque
permite uma maior flexibilidade.
A TAB. 3 apresenta os resultados dos ensaios de interferncia nas diluies
seriadas de MIBG-131I, 67Ga e 201Tl.
TABELA 3 - Resultados dos Ensaios de Interferncia nas Diluies Seriadas

de MIBG-131I, 67Ga e 201Tl
Produto
MIBG-
Diluio do
Produto
131
67
Ga
201
Tl
+ = Gel firme
MIBG-131I e
Controle Negativo
Controle Positivo
pH
1:10
++
++
7,0
1:50
++
++
7,0
1:100
++
++
7,0
1:10
++
++
++
7,0
1:50
++
++
++
7,0
1:100
++
++
7,0
1:10
++
++
7,0
1:50
++
++
7,0
1:100
++
++
7,0
= Nenhum gel ou gel no firme
201
Tl atenderam individualmente os requisitos para o teste sem
ajuste de pH a partir da diluio 1:10.
67
Ga atendeu os requisitos para o teste na
diluio 1:100.
Como as preparaes de amostras nessas diluies no so de fcil
aplicao na rotina de controle de qualidade, foi definido o fator de diluio 1:100
para a validao dos produtos (com exceo do Fitato) pela praticidade.
Recomenda-se que os procedimentos de operao padro (POP) sejam
padronizados o mximo possvel considerando os esquemas de diluies e etapas
do teste para evitar variaes excessivas.[33]
54
Twohy e col. [36] avaliaram os radiofrmacos citrato de Glio-67, 99mTc-DTPA,
Gerador de 99mTc e cloreto de Tlio-201 e as diluies no interferentes encontradas
foram 2, 8, sem diluio e 2 vezes, respectivamente.
5.1.3 Sries de Diluio do Padro de Endotoxina

A Srie de Diluio do Padro de Endotoxina com o produto foi feita em 3
lotes consecutivos no fator de diluio 1:100 para MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl, DTPA,
GHA, SAH e Sn Coloidal, em paralelo com a Srie de Diluio do Padro de

Endotoxina em gua, conforme mostrado na TAB. 4.
5.1.3.1 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL

A USP estabelece que a sensibilidade declarada do lisado vlida quando o
resultado da Mdia Geomtrica do Ponto Final de Gelificao (equao 3) estiver
entre 0,5 (0,06 UE mL-1) e 2 (0,25 UE mL-1).[15] Utilizando os resultados (TAB. 4)
das sries do Padro de Endotoxina em gua, foi calculada a sensibilidade do LAL e
o valor obtido foi =0,06 UE mL-1, dentro da faixa aceitvel.
A proposta inicial do trabalho era realizar a validao de SAH-131I, porm

devido pequena demanda comercial, no houve produto suficiente para o ensaio
como havia sido programado, sendo assim, foi substitudo pelo reagente liofilizado
SAH.
A validao para o produto em uma determinada diluio considerada
vlida quando:
O resultado para a menor concentrao das solues padres (0,03 UE mL-1)
for negativo em todas as replicatas.[12,15]
A diferena entre o ponto final de gelificao das sries de diluies em gua
e no produto for de, no mximo, um fator de diluio.[4,19]
O pH da mistura amostra-lisado estiver na faixa de 6,0 a 8,0.[4]
55
Tabela 4 - Resultados dos Testes de Formao de Gel para MIBG-131I, 67Ga, 201Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn Coloidal
UE mL-1 de PE no produto
Produto
MIBG131
I
67
Ga
201
Tl
DTPA
GHA
SAH
Sn
Coloidal
UE mL-1 de PE em gua sem pirognio
Contr.
Neg.
gua
Ponto final de
gelificao
Sensibilidade
do LAL (UE
-1
mL )
----------
----------
0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
++++
++++
++++
----------
----------
0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
++++
++++
++++
++++
++++
++++
----------
----------
0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
-------------------
-------------------
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
-------------------
-------------------
0,50
0,25
0,125
0,06
0,03
0,50
0,25
0,125
0,06
0,03
/2
/4
/2
/4
Lote 1
Lote 2
Lote 3
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
----------
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Lote 1
Lote 2
Lote 3
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
----------
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Lote 1
Lote 2
Lote 3
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
----------
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Lote 1
Lote 2
Lote 3
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
+ -+ ++++
++++
++++
++++
---------++++
---++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
-------------------
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Lote 1
Lote 2
Lote 3
0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
0,03; 0,06; 0,03
Antilog -1,42 =
log 0,03; log 0,06; log 0,03
0,04
-1,52; -1,22; -1,52

0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
0,06
Antilog -1,22 =
Log 0,06 = -1,22
0,06
56
Considerando que a sensibilidade calculada do reagente LAL foi 0,06 UE
mL-1, e substituindo-se esse valor na Equao 4, obtm-se MDV igual a 400. No
caso do Fitato, diluies maiores que 200 at 400 vezes apresentaram interferncia
na Srie de Diluio do Padro de Endotoxina (dados no apresentados).
O GHA no apresentou resultados satisfatrios porque o valor calculado foi
menor que 0,5 (TAB. 4).
Os produtos MIBG-131I, 67Ga, 201Tl, DTPA, SAH e Sn Coloidal foram validados
no mtodo de formao de gel, na diluio 1:100, porque atenderam aos requisitos
descritos.
O controle negativo e o controle positivo do produto devem ser realizados
diariamente. Qualquer alterao na formulao, reagente ou mtodo de produo
necessita ser avaliada quanto aos nveis de endotoxina.[17,20]
Para o mtodo de formao de gel com critrio de aceitao passa ou no
passa, estudos de estimativa da incerteza de medio so importantes para a
verificao das probabilidades de respostas falsas, particularmente falsos-positivos
e falsos-negativos.[35]
Todos os lotes com resultados vlidos para o mtodo de formao de gel
foram analisados pelo mtodo cromognico e alguns tambm foram submetidos ao
ensaio turbidimtrico. Entre os reagentes liofilizados, o Fitato e o GHA apresentaram
interferncia com resultados no vlidos no mtodo de formao de gel e foram
avaliados nos mtodos cinticos cromognico e turbidimtrico para verificar a
influncia das diluies nos resultados.
5.2 Validao pelo Mtodo Cromognico PTS

O mtodo cromognico usado para medir a liberao do cromforo de um
peptdeo cromognico adequado pela reao da endotoxina com o lisado e baseia-
57
se na relao quantitativa entre a concentrao de endotoxina e a quantidade de
cromforo liberado no final de um perodo de incubao (Esquema 2).
Como existe uma relao linear entre o log da concentrao de endotoxina e
o log do tempo de reao, medido o tempo necessrio para a mistura de reao
atingir uma absorbncia pr-determinada ou a velocidade do desenvolvimento da
cor.[12] Desta forma, as concentraes de endotoxina no produto (CEP) e no
controle positivo do produto (CPP) na diluio analisada so obtidas pela
interpolao da curva padro arquivada. A curva arquivada vlida apenas para a
mesma combinao de endotoxina e LAL.
Os critrios de aceitao para o mtodo cromognico esto expressos na
TAB. 5.[12]
TABELA 5 - Critrios de Aceitao para o Mtodo Cromognico [12]
Parmetro
Critrio de Aceitao
Coeficiente de Correlao da Curva Padro Arquivada (R)
-0,980
Recuperao do Controle Positivo do Produto (RCPP)
50 a 200%
Coeficiente de Variao (CV)
< 25%
A porcentagem de recuperao do controle positivo do produto (RCPP)

representa a relao entre a concentrao de endotoxina do controle positivo do
produto e uma concentrao especfica de endotoxina (0,3 UE mL-1). Se o valor de
% de recuperao estiver fora da faixa de 50 a 200, significa que, na diluio
estudada, est ocorrendo interferncia do produto. Para ser considerada livre de
fatores interferentes sob as condies do ensaio, a concentrao medida da
endotoxina adicionada soluo da amostra deve estar entre 50 e 200% da
concentrao conhecida de endotoxina adicionada.[4] O coeficiente de variao
(CV) a diferena percentual de leitura entre as amostras. A durao do ensaio o
tempo necessrio para que se atinja um valor de densidade ptica pr-estabelecido.
[4,15]
58
5.2.1 Clculo de MDV
Os clculos de MDV para o mtodo cromognico so feitos conforme a
equao 4, considerando a sensibilidade do LAL como o menor ponto da curva
padro arquivada ( = 0,05 UE mL-1).[33] Como a sensibilidade do LAL menor,
pode-se utilizar uma diluio 2,5 vezes maior que no mtodo de formao do gel, ou
seja, 500 vezes.

Foram feitos ensaios nas diluies 1:5, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300 e 1:400 em
4 lotes de Fitato, para verificar em qual diluio no ocorre interferncia. Os
resultados esto relacionados na TAB. 6 e representados no Grfico 1.
200
Limite superior
% Recuperao
175
150
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Lote 4
125
100
75
50
Limite inferior
25
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
fator de diluio
Grfico 1 - Efeito da Diluio de Fitato na % de RCPP no Mtodo Cromognico.
59
TABELA 6 - Resultados dos Testes de Interferncia em Fitato pelo Mtodo

Cromognico-PTS.
Fitato
Lote
CEP
CPP
(UE mL )
%CV
Produto
(UE mL-1)
%CV do
CPP
% RCPP
1:5
0,595
2,9
0,344
14,0
111
1:100
<5,00
0,0
0,137
9,9
44
1:150
<7,50
2,9
0,174
3,1
56
1:200
<10,0
0,0
0,092
4,9
30
1:300
<15,0
0,0
0,216
11,7
70
1:300
<15,0
0,0
0,155
1,3
50
1:400
<20,0
26,8
0,407
1,0
66
1:300
<15,0
2,9
0,158
3,0
51
1:400
<20,0
0,0
0,614
1,7
99
1:5
0,321
6,1
0,194
28,4
62
1:100
<5,00
35,0
0,104
7,2
33
1:150
<7,50
0,0
0,218
3,3
70
1:200
<10,0
0,0
0,216
6,6
70
1:300
<15,0
0,0
0,351
0,4
133
1:400
<20,0
0,0
0,520
7,3
84
Diluio
-1
Observa-se no Grfico 1 e na TAB. 6 que nos lotes estudados no ocorreu

interferncia, isto , % RCPP maior ou igual a 50 na diluio de 1:300.
A concentrao de endotoxina (CEP) encontrada em todos os produtos nas
diluies estudadas (exceo na diluio 1:5) foi menor que a menor concentrao
da curva padro multiplicada pelo fator de diluio (TAB. 6).
60
A TAB. 7 mostra os resultados obtidos no mtodo cromognico dos produtos
MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn Coloidal na diluio 1:100, que foi
estabelecida no mtodo de formao de gel.

TABELA 7 - Resultados de MIBG-131I,
67
Ga,
201
Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn
Coloidal na Diluio 1:100 no Mtodo Cromognico-PTS.
Lote
67
Ga
201
Tl
DTPA
GHA
SAH
Sn Coloidal
CPP
-1
Produto
MIBG-131I
CEP
-1
% CV do
CPP
% RCPP
(UE mL )
(UE mL )
<5,0
0,658
2,3
106
<5,0
1,070
9,7
173
<5,0
0,813
1,2
131
<5,0
0,391
1,3
126
<5,0
0,374
7,9
83
<5,0
0,257
0,4
120
<5,0
0,260
3,1
84
<5,0
0,327
7,1
105
<5,0
0,333
6,3
107
<5,0
0,192
6,0
62
<5,0
0,243
3,8
78
<5,0
0,255
5,4
82
<5,0
0,369
1,8
60
<5,0
0,339
7,2
109
<5,0
0,546
7,9
88
<5,0
0,271
0,4
87
<5,0
0,218
10,6
70
<5,0
0,285
1,2
92
<5,0
0,480
1,4
155
<5,0
0,339
4,6
109
<5,0
0,417
5,4
134
61
Os resultados de % RCPP dos trs lotes de cada produto esto entre 50 e

200%, e % CV do CPP < 25, e por isso foram validados no mtodo cromognico.
A % CV do CEP foi menor que 0,1 em todas as amostras analisadas.
O mtodo cromognico bastante interessante pela rapidez dos ensaios com
tempo total de anlise de cerca de 20 minutos, por isso foi tambm desenvolvida a
metodologia para determinao de endotoxina em radiofrmaco de meia-vida fsica
curta utilizado em Tomografia por Emisso de Psitron (PET), como o FDG-18F.
Na TAB. 8 esto descritos os resultados de interferncia em FDG-18F. Foram
analisados trs lotes de FDG-18F utilizando fatores de diluio: sem diluio, 1:5,
1:10, 1:20 e 1:50.
TABELA 8 - Resultados dos Testes de Interferncia em FDG-18F no Mtodo
Cromognico-PTS.
18
FDG- F
Diluio
CPP
-1
Lote
CEP
-1
%CV do
CPP
% RCPP
(UE mL )
(UE mL )
1:1
<2,50
0,082
10,5
26
1:5
<2,50
0,374
16,6
120
1:10
<2,50
0,241
0,4
78
1:20
<2,50
0,229
6,3
74
1:50
<2,50
0,302
6,5
98
1:1
<2,50
0,0
0,0
0,0
1:5
<2,50
0,264
2,3
85
1:10
<2,50
0,374
2,6
120
1:20
<2,50
0,262
3,5
84
1:50
<2,50
0,292
8,0
94
1:1
<2,50
0,074
4,9
24
1:5
<2,50
0,229
2,6
74
1:10
<2,50
0,572
13,7
185
1:20
<2,50
0,205
3,9
66
1:50
<2,50
0,387
8,0
125
62
O grfico 2 mostra a variao da % de RCPP nas diluies: sem diluio, 5,
10, 20 e 50 vezes em 3 lotes de FDG-18F.
200
185%
Limite superior
180
1 Teste
2 Teste
3 Teste
160
Recuperao (%)
140
125%
120% 120%
120
98%
100
85%
80
78%
74%
60
84%
66%
40
20
94%
74%
Limite inferior
26%
24%
<0%
10
20
30
40
50
60
Diluio
Grfico 2 - Efeito da Diluio de FDG-18F na % de RCPP no Mtodo

Cromognico-PTS.
Os melhores resultados foram obtidos a partir da diluio 1:5, mas foi

escolhida a diluio de 1:50 para analisar mais nove lotes de FDG-18F (TAB. 9).
A concentrao de endotoxina (CEP) encontrada foi menor que a menor
concentrao da curva padro multiplicada pelo fator de diluio.
63
TABELA 9 - Resultados dos ensaios para determinao de endotoxina em 9

lotes de FDG-18F pelo mtodo cromognico-PTS, utilizando diluio 1:50.
FDG-18F
CEP
CPP
-1
%CV do CPP
% RCPP
-1
Lote
(UE mL )
(UE mL )
<2,50
0,178
8,2
58
<2,50
0,243
4,5
78
<2,50
0,330
2,5
106
<2,50
0,534
5,9
172
<2,50
0,098
7,0
32
<2,50
0,436
8,8
141
<2,50
0,198
6,0
64
<2,50
0,377
6,6
122
<2,50
0,336
5,1
108
Observou-se que, com exceo do lote E de FDG-18F, todos os demais

apresentaram % RCPP dentro da faixa especificada e % CV menor que 25.
Como os reagentes liofilizados para radiodiagnstico marcados com
99m
Tc
so amplamente utilizados para obteno de imagens cintilogrficas em Medicina

Nuclear, foram feitos ensaios em eludos de trs lotes de geradores de
99m
Tc para
verificao de interferncias pelo mtodo cintico cromognico-PTS.

Na TAB. 10 esto relacionados os resultados dos ensaios em trs lotes do
produto nos fatores de diluio: sem diluio, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 e 1:200.
64
Tabela 10 - Resultados dos Testes de Interferncia em Geradores de 99mTc pelo

Mtodo Cromognico.
Gerador
Diluio
CPP
-1
Lote
CEP
-1
%CV do
CPP
% RCPP
(UE mL )
(UE mL )
1:1
<0,050
0,020
5,1
1:5
<0,250
0,382
4,4
55
1:10
<0,500
0,476
1,9
69
1:20
<1,00
0,692
1,1
100
1:50
<2, 50
0,560
4,6
81
1:100
<5,00
0,678
3,3
98
1:200
<10,00
0,565
82
1:1
<0,050
0,026
2,9
1:5
<0,250
0,414
3,2
60
1:10
<0,500
0,624
3,2
90
1:20
<1,00
0,795
4,1
115
1:50
<2,50
0,849
3,0
123
1:100
<5,00
0,560
2,6
81
1:200
<10,00
0,576
1,0
84
1:1
<0,060
0,082
0,9
12
1:5
<0,250
0,533
77
1:10
<0,500
0,560
1,5
81
1:20
<1,00
0,582
3,6
84
1:50
<2,50
0,940
5,0
136
1:100
<6,46
0,807
1,2
117
1:200
<10,00
0,729
0,6
106
65
Nos trs lotes analisados, o produto no diludo apresentou % de RCPP
abaixo do limite estabelecido, mas a partir do fator de diluio 1:5 at 1:200, a %
RCPP mostrou resultados satisfatrios. Em todas as amostras a % CV foi menor
que 25.
O grfico 3 mostra a variao da % de RCPP no mtodo cromognico nas
diluies: sem diluio, 5, 10, 20, 50, 100 e 200 vezes em trs lotes consecutivos de
geradores de 99mTc.
G ERA D O R
200
180
645
646
647
% de Recuperao
160
136%
140
123%
115%
120
117%
106%
100%
100
98%
84%
80
84%
81%
82%
81%
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Diluio
Grfico 3 - Efeito da Diluio em Eludos de Geradores de 99mTc na % de RCPP

no Mtodo Cromognico-PTS.
Observa-se pelo grfico 3 que os trs lotes de geradores de
99m
apresentaram perfil de % de RCPP semelhante nas sries de diluies estudadas.
Tc
66
5.3 Validao pelo Mtodo Turbidimtrico
A tcnica
turbidimtrica
baseia-se
na
relao
quantitativa
entre
concentrao de endotoxina e a turbidez (absorbncia ou transmitncia) da mistura

de reao no final do perodo de incubao.[12]
Como existe uma relao linear entre o log da concentrao de endotoxina e
o log do tempo de reao, medido o tempo necessrio para a mistura de reao
atingir uma absorbncia pr-determinada ou a velocidade do desenvolvimento da
turbidez.[12] Desta forma, utilizando concentraes conhecidas de endotoxina
obtm-se a curva padro em que as concentraes de endotoxina no produto (CEP)
e no controle positivo do produto (CPP) na diluio analisada so determinadas pela
interpolao da curva padro.
Os critrios de aceitao para o mtodo turbidimtrico so: R -0,980, RCPP
de 50 a 200% e CV < 10%.
5.3.1 Clculo de MDV

Os clculos de MDV para o mtodo turbidimtrico so feitos conforme a
equao 4, considerando a sensibilidade do LAL como o menor ponto da curva
padro ( = 0,05 UE mL-1), similar ao mtodo cromognico. Como a sensibilidade do
LAL menor, pode-se utilizar uma diluio 2,5 vezes maior que no mtodo de
formao do gel, ou seja, 500 vezes.

Para clculo da CEP e do % RCPP em diluies do produto, foi necessria a
obteno da curva padro com 3 concentraes conhecidas de endotoxina (5; 0,5 e
0,05 UE mL-1). A TAB. 11 apresenta os dados da curva padro no ensaio
turbidimtrico, com os quais foi construdo o grfico log da concentrao do padro
de endotoxina versus log do tempo (Grfico 4).
67
O Tempo Mdio de Reao o tempo necessrio para o produto atingir uma
absorbncia pr-determinada.
Tabela 11 - Dados da Curva Padro no Mtodo Turbidimtrico.
Concentrao do Padro
(UE mL-1)
Tempo Mdio de
Reao (s)
% CV
Valor Calculado
445,3
2,72
>5,2730
0,5
1030,1
2,44
0,4496
0,05
2137,8
4,85
<0,0527
(UE mL-1)
A quantidade de endotoxina presente na amostra inversamente

proporcional ao tempo de reao.
A partir do grfico 4, foram obtidos os parmetros R igual a -0,9992,
coeficiente angular -0,03407 e coeficiente linear 2,8946. Como o coeficiente de
variao para cada uma das concentraes foi < 10% e R < -0,980, a curva padro
foi considerada vlida.
Tempo
Log (s)
Log [End]
Grfico 4 - Curva Padro (log-log) de Endotoxina nas Concentraes de 5; 0,5

e 0,05 UE mL-1 pelo Tempo de Reao.
68
Na TAB. 12 esto relacionados os resultados dos ensaios realizados em
vrias diluies de 67Ga, Fitato, GHA e SAH pelo mtodo turbidimtrico.
TABELA 12 - Resultados dos Testes de Interferncia de
67
Ga, Fitato, GHA e
SAH no Mtodo Turbidimtrico.
Produto
67
Diluio
CEP
-1
(UE mL )
Tempo
Mdio de
Reao
(s)
CPP
-1
(UE mL )
Tempo
Mdio de
Reao
(s)
% CV
do
CPP
%
RCPP
Resultado
1:100
<5,00
>2249,0
0,1953
1368,5
1,15
58
Vlido
1:150
<7,50
>2249,0
0,2216
1310,9
0,52
69
Vlido
1:100
<5,00
>2249,0
0,2095
1336,1
2,96
64
Vlido
1:150
<7,50
>2249,0
0,1654
1448,2
0,56
46
No Vlido
1:200
<10,00
>2249,0
0,2093
1256,5
3,02
64
Vlido
1:100
<5,00
>2249,0
0,1929
1374,3
1,84
57
Vlido
1:150
<7,50
>2249,0
0,2149
1324,6
1,09
66
Vlido
1:150
<7,50
>2249,0
0,2431
1270,1
0,14
77
Vlido
1:200
<10,00
>2249,0
0,2569
1246,4
0,88
83
Vlido
1:300
<15,00
>2249,0
0,2406
1274,7
0,05
76
Vlido
GHA
1:100
<5,00
>2249,0
0,1781
1412,1
0,91
51
Vlido
Lote 5
1:150
<7,50
>2249,0
0,1767
1416,1
0,10
51
Vlido
SAH
1:100
<5,00
>2249,0
0,2342
1286,4
0,78
74
Vlido
Lote 4
1:200
<10,00
>2249,0
0,2170
1320,3
1,46
67
Vlido
gua
----
<0,0500
>2249,0
<0,0500
----
0,00
----
Vlido
Ga
Lote 7
67
Ga
Lote 8
67
Ga
Lote 9
Fitato
Lote 5
Tempo Mdio de Reao do Produto
Tempo Mdio de Reao do Controle Positivo do Produto
69
Pelo mtodo turbidimtrico, foi verificado que para
67
Ga, GHA e SAH, o
ensaio na diluio 1: 100 foi vlido. O Fitato, diferentemente do mtodo de formao

de gel, no apresentou problemas de interferncia nas diluies estudadas.
Os resultados de validao dos produtos nos mtodos de formao de gel,
cromognico-PTS e turbidimtrico esto apresentados na TAB. 13.
TABELA 13 - Resultados de Validao dos Produtos nos Mtodos de Formao
de Gel, Cromognico-PTS e Turbidimtrico.
Mtodo
Formao de Gel
Cromognico-PTS
Vlido*
Vlido*
Turbidimtrico
-------
Vlido*
Vlido*
Vlido*
Vlido*
Vlido*
DTPA
Vlido*
Vlido*
-------
Fitato
--------
Vlido**
Vlido**
GHA
--------
Vlido*
Vlido*
SAH
Vlido*
Vlido*
Vlido*
Sn Coloidal
Vlido*
Vlido*
-------
FDG-18F
--------
Vlido***
-------
Gerador de 99mTc
--------
Vlido****
-------
Produto
MIBG-131I
67
Ga
201
Tl
* Diluio 1:100
** Diluio 1:300
*** Diluio 1:50
-------
**** Diluio 1:5
Os resultados da TAB. 13 mostram que os produtos com resultados vlidos

no mtodo de formao de gel confirmaram a validao quando foram submetidos
ao cromognico-PTS, enquanto que Fitato e GHA apresentaram no mtodo
turbidimtrico a confirmao dos resultados vlidos obtidos no mtodo cromognicoPTS.
70
A concentrao de endotoxina em todos os lotes de produtos estudados
estava abaixo do limite de endotoxina especificado nos compndios oficiais.
A TAB. 14 apresenta um estudo comparativo entre os mtodos de formao
de gel, cromognico-PTS e turbidimtrico.
TABELA 14 - Estudo Comparativo dos Mtodos de Formao de Gel,
Cromognico-PTS e Turbidimtrico para Determinao de Endotoxina.[1,4]
Formao de Gel
semi-quantitativo
simples, rpido (60
minutos)
100 L amostra
no necessita de
equipamento especializado
(banho-maria)
para radiofrmacos de
meia-vida fsica curta,
anlise de gua, produto
em processo e acabado
sensibilidade do LAL 0,25
a 0,015 UE mL-1
requer preparao de 5
concentraes de padro
de endotoxina
curva padro 0,50; 0,25;
0,125; 0,06; 0,03 UE mL-1
critrio de aceitao:
passa/no passa
ponto final de gelificao

leitura e registro manual
fatores interferentes
Cromognico-PTS
quantitativo (densidade
ptica a 405 nm)
simples, mais rpido (15 a
20 minutos), porttil
25 L amostra
fotomtrico (PTS)
para radiofrmacos de
meia-vida fsica curta,
anlise de gua, produto
em processo e acabado
UE mL-1
no requer preparao de
padro de endotoxina
Turbidimtrico
quantitativo (densidade
ptica a 340 nm)
Rpido (60 minutos)
100 L amostra
fotomtrico (TECAN
SUNRISE)
no caso de radiofrmacos,
impossibilidade de
acmulo de amostras (96
poos por placa)
UE mL-1
requer preparao de 3
concentraes de padro
de endotoxina
curva padro arquivada
curva padro 5,0; 0,5; 0,05
5,0; 0,5; 0,05 UE mL-1
UE mL-1
critrio de aceitao:
critrio de aceitao:
coeficiente de correlao coeficiente de correlao
-0,980, recuperao do
-0,980, recuperao do
controle positivo do
controle positivo do
produto (RCPP) de 50 a
produto (RCPP) de 50 a
200% e Coeficiente de
200% e Coeficiente de
Variao (CV) < 25%
Variao (CV) < 10%
desenvolvimento de cor
desenvolvimento de
turbidez
automatizado,
automatizado,
armazena os dados
armazena os dados
eletronicamente
eletronicamente
limitao de amostras limitao de amostras
opacas ou coloridas
opacas ou coloridas
71
Em vista da necessidade de realizao de muitos ensaios de rotina no
controle de qualidade, foi feito um levantamento de custos dos materiais utilizados
nos trs mtodos estudados para comparar o custo por lote de produto em cada
mtodo.
Na TAB. 15 esto discriminados os materiais, os custos individuais e o custo
por lote de produto.
TABELA 15 - Comparao dos Custos dos Materiais utilizados nos Ensaios de
Formao de Gel, Turbidimtrico e Cromognico-PTS (Base outubro de 2007).
Reagente/Material
R$
Formao de gel
Turbidimtrico
Cromognico-PTS
LAL 50 testes
410,00
430,00 x 2
---
Endotoxina
310,00
310,00
---
gua apirognica
205,00
205,00
---
50 tubos de reao
280,00
---
---
Placa 96 testes
---
65,00
---
Cartucho
---
---
157,00
Custo Total
1.205,00
1.440,00
---
Custo/teste
24,10
14,40
---
08
12
01
192,80
172,80
157,00
N testes/lote
Custo/lote
O clculo do nmero total de testes realizados para cada lote de produto em

procedimento de rotina :
mtodo de formao de gel duplicatas de controle positivo do produto,
controle negativo, controle positivo da gua e controle negativo da gua,
totalizando 8 testes;
72
mtodo turbidimtrico - duplicatas de 3 concentraes da curva padro,
controle positivo do produto, controle negativo do produto e controle negativo
da gua totalizando 12 testes;
mtodo cromognico-PTS - um cartucho para cada lote de produto.
Analisando os custos apresentados na TAB. 15, embora o mtodo de
formao de gel apresente o maior custo por lote analisado, deve-se levar em
considerao que somente a cada novo lote de Padro de Endotoxina e Reagente
LAL a sensibilidade do reagente deve ser confirmada com quadruplicatas de 5
concentraes de padro de endotoxina. No mtodo turbidimtrico, a placa de
incubao pode ser utilizada a cada 96 testes e a curva padro obtida a cada novo
lote de Padro de Endotoxina e Reagente LAL. As consideraes feitas tornam os
custos dos ensaios de formao de gel e turbidimtrico menores do que os descritos
na TAB. 15 quando se analisa concomitantemente vrios lotes utilizando parte dos
mesmos materiais.
73
6 CONCLUSES
O Ensaio do LAL mostrou-se sensvel, prtico e de fcil utilizao em
Medicina Nuclear devido aos pequenos volumes de anlise, menor tempo e
simplicidade quando comparado com o Ensaio USP de Pirognio in vivo. Para
radiofrmacos de meia vida fsica curta os quais devem ser produzidos prximo ao
local de uso e preparados em pequenos volumes com alta atividade especfica,
particularmente adequado.[13,17]
O fato de que alguns produtos propostos neste trabalho, como o Fitato e
GHA, no apresentaram bons resultados no mtodo de formao de gel, requer
uma investigao para a determinao das causas da interferncia. O reagente LAL
utilizado em todos os ensaios era tamponado e as medidas de pH estavam dentro
da faixa especificada, descartando a possibilidade da interferncia do pH. Ctions
divalentes, como o clcio, tambm podem influenciar no teste, mas alguns estudos
realizados no comprovaram, de forma definitiva, essa interferncia.
Algumas questes de interferncia foram evitadas de maneira simples, como
diluio da amostra, utilizao de LAL tamponado e recipientes adequados,
amostragem, calibrao e qualificao de equipamentos, calibrao de micropipeta
e treinamento em pipetagem.
A flexibilidade na escolha de um mtodo adequado para determinao de
endotoxina bacteriana uma alternativa para solucionar ou reduzir problemas de
interferncia.[32] Em vista dos resultados obtidos neste estudo, o mtodo
cromognico-PTS pode ser aplicado para o Fitato e o GHA em substituio ao
mtodo de formao de gel.
A simplicidade dos mtodos de determinao de endotoxinas bacterianas in

vitro encoraja seu uso em solues utilizadas em processo, matrias-primas, assim
como em produtos finais de drogas e materiais descartveis. A aplicao se estende
tambm avaliao de procedimentos de limpeza, objetivando minimizar
concentraes de endotoxina nos produtos acabados.[1,11]
74
ANEXO 1 Modelo de Ficha para Validao do Teste de Endotoxina Bacteriana
pelo Mtodo de Formao de Gel para Produto Acabado
LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE (LAL) VALIDAO DO TESTE DE ENDOTOXINA BACTERIANA PARA
PRODUTO ACABADO
Produto:
Lote:
Potncia endotoxina:
Limite endotoxina:
MDV:
Reagente
Fabricante
Lote
Concentrao teste:
Data
Reidratao
IPEN
Data
Validade
LAL 0,125 UE/mL

Padro de Endotoxina
gua apirognica
Tubos apirognicos
Ponteiras 1mL
Condies do teste
Hora incio:
Hora final:
pH
Temperatura Incio: .......C

Fim : .......C
Preparao da amostra
RESULTADOS
Concentrao
de endotoxina
UE/mL
0,50
0,25
0,125
0,06
0,03
Controle
negativo
da gua
Ponto final
gelificao
Padro de
Endotoxina em
gua
Mdia
Geomtrica
Log 10
Antilog 10
Controle
positivo do
produto
+ = GEL FIRME
- = NENHUM GEL OU GEL NO FIRME
VLIDO
NO VLIDO
Obs.:
Tcnico Operador:....................
Data:..../...../......
Gerncia do Controle de Qualidade:___________________________________________
75
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36. TWOHY, C. W.; DURAN, A. P.; MUNSON, T. E. Endotoxin Contamination of
Parenteral Drugs and Radiopharmaceuticals as determined by the Limulus
Amebocyte Lysate Method. J. Parent. Sci. Tech., v. 38, n. 5, p. 190-201,
1984.

2008 Fukumori Determinacao

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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada Universidade de So Paulo

DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM

NEUZA TAEKO OKASAKI FUKUMORI

Dissertao apresentada como parte dos

Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares, IPEN-CNEN/SP, por possibilitar

Luzia de Fatima Pereira, funcionria da Alko do Brasil, fornecedora da maior parte

"...se buscares a sabedoria como a prata e como a tesouros escondidos a

DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM

Neuza Taeko Okasaki Fukumori

Antes do Ensaio do Lisado de Amebcitos do Limulus (LAL), a nica forma de se avaliar a

DETERMINATION OF BACTERIAL ENDOTOXIN (PYROGEN) IN

I- m-iodobenzylguanidine; the radioisotopes Gallium-67 and

I-m-iodobenzylguanidine, Gallium-67, Thallium-201, DTPA, HSA and Colloidal

1.4 Processos de Despirogenizao .......................................................

1.5 Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo .......................................... 22

1.6.1 Histrico ......................................................................................... 27

1.9 Outros Mtodos para Determinao de Endotoxina ......................... 34

1.9.3 Mtodo Nefelomtrico .................................................................... 35

4.2.1 Mtodo de Formao de Gel ........................................................... 44

4.2.2 Mtodo Cromognico - PTS ...........................................................

4.2.3 Mtodo Turbimtrico ...................................................................... 49

5.1 Validao dos Produtos pelo Mtodo de Formao de Gel .............

5.1.1 Clculo de MDV ............................................................................. 50

5.1.3 Sries de Diluio do Padro de Endotoxina ................................

5.1.3.1 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL ......................

5.2 Validao pelo Mtodo Cromognico PTS ..................................... 56

5.3 Validao pelo Mtodo Turbimtrico ................................................

5.3.1 Clculo de MDV ............................................................................. 66

ANEXO 1 - Modelo de Ficha para Validao .......................................

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS

Bacilo de Calmette e Gurin

Boas Prticas de Fabricao

Center for Devices and Radiological Health

Concentrao de Endotoxina no Produto

Controle Positivo do Produto

Food and Drug Administration

Health Industry Manufacturers Association

Sistema Cintico Turbidimtrico

Lisado do Amebcito de Limulus

Mnima Concentrao Vlida

Mxima Diluio Vlida

Tomografia por Emisso de Psitron

Padro de Referncia de Endotoxina

Sistema de Teste Porttil

Recuperao do Controle Positivo do Produto

Resoluo da Diretoria Colegiada

Soro Albumina Humano

Para garantir que os produtos farmacuticos tenham e mantenham as

pureza, concentrao, potncia e

inocuidade requeridas para o seu uso existe um conjunto de normas e atividades

Tc sem uma dose de radiao significativa ao paciente. Os ftons

monocromticos de 140 keV so colimados e fornecem imagens com boa resoluo

Tc est disponvel facilmente em um estado livre de

carregador, estril e apirognico a partir dos geradores de 99Mo-99mTc.[7, 9]

nas radiofarmcias hospitalares por causa do prazo de validade, podendo ser

disponvel no gerador, empregado na cintilografia de glndulas salivares e de

Tc so usados, respectivamente, para

cintilografia renal (estudo do fluxo renal e medida da velocidade de filtrao

O pirognio endgeno, entretanto, produzido internamente pelo hospedeiro

Os nveis de pirognio tornaram-se cruciais na liberao de produtos

endotoxina. A denominao de lipopolissacardeo (LPS) aplicada endotoxina