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CURSO DE FARMCIA

RELATRIO AULA
PRTICA: CINTICA
MICROBIANA

Discentes: Fulano
Beltrano
Ciclano
Turma: FAN01S1
Professor: MSc. Francisco Neto
Disciplina: Processos Biolgicos

Manaus
2011

CURSO DE FARMCIA

RELATRIO AULA
PRTICA: CINTICA
MICROBIANA
Discentes:
Fulano
Beltrano
Ciclano
Trabalho
apresentado
ao
professor MSc. Francisco
Neto, como requisito para
obteno da nota na disciplina
de Processos Biolgicos.
Bioprocessos

Manaus
2015

Introduo

A determinao da evoluo ao longo do tempo da concentrao de um


componente celular, da concentrao de clulas ou da biomassa em suspenso em meio
de crescimento lquido, permite obter experimentalmente a curva de crescimento da
populao microbiana e calcular a taxa especfica de crescimento e o tempo de gerao
ou de duplicao do microrganismo em questo nas condies de crescimento testadas
(De Carvalho, 2006).
Segundo De Carvalho et al (2006), para acompanhar e traar a curva de
crescimento de uma populao microbiana necessrio fazer a avaliao quantitativa da
evoluo da concentrao de clulas ao longo do tempo. Esta pode basear-se em
mtodos diretos, como contagem de clulas totais, contagem de clulas viveis e
determinao da biomassa seca. Ou em mtodos indiretos, como o caso da Anlise
espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) da cultura. Embora, em teoria, quando
o crescimento de uma populao microbiana equilibrado, o seu acompanhamento
possa basear-se na quantificao de qualquer constituinte celular, o crescimento
usualmente

acompanhado

com

base

na

determinao

da

D.O da

cultura,

da concentrao de clulas ou da massa celular . A seleo do mtodo a utilizar depende


do tipo de microrganismo e do problema particular em causa.
Saccharomyces cerevisiae um organismo eucariota unicelular que pertence ao
Reino dos Fungos. A sua utilizao combina vrias vantagens: um organismo
unicelular e, ao contrrio dos organismos eucariotas complexos, pode crescer em meios
de cultura definidos, permitindo ao investigador o controlo dos parmetros ambientais
(E-escola.com, 2011)
uma levedura ascomictica gemulante tpica. Cepas desta espcie so
utilizadas no processo de fermentao para a produo de bebidas alcolicas. Na
presena de oxignio, as leveduras oxidam os acares a dixido de carbono que so
responsveis pelas bolhas de ar no po. As leveduras de cervejaria e padaria tm sido
utilizadas a milhares de anos, uma levedura de grande importncia econmica.As
clulas de so elpticas, medindo cerca de 6 a 8 mm de comprimento por 5 m de
largura, reproduzem-se assexuadamente por brotamento (De Carvalho, 2006).

Objetivo Geral
O objetivo da aula prtico foi verificar a cintica de crescimento de
Saccharomyces cerevisiae.

Objetivos Especficos

Determinar a concentrao de acares redutores no incio e no final do

experimento (tempo zero e tempo final);


Construir a curva de crescimento da levedura a partir dos valores de densidade
ptica.

Materiais e Mtodo
Material:
Fpram utilizados na aula prtica autoclave, espectrofotmetro, banho-maria,
balana analtica, agitador magntico, agitador tipo vrtex, pHmetro, micropipeta,
ponteiras, erlenmeyers de 125 mL, bquer de 500 mL, cubetas de 3 mL, basto de vidro,
tubos eppendorf, esptulas, provetas e filtro milipore 22 m.
Reagentes:
Como reagentes utilizamos a levedura seca de panificao, HCl 0,1 M e soluo
DNS.
Meio de Cultivo (pH 5,0):
Glicose (10 g/L), estrato de malte (3 g/L), extrato de levedura (3 g/L), peptona
bacteriolgica (5 g/L).
Procedimento:
1. Pesar os componentes do meio de cultura em um bquer e dissolv-los em gua
destilada utilizando o agitador magntico;
2. Ajustar o pH do meio de cultura com HCl utilizado o pHmetro;
3. Completar o volume utilizando uma proveta;

4. Autoclavar o meio de cultura nos erlenmeyers e as ponteiras a 121C por 20


min.;
5. Deixar os frascos esfriarem e quando a temperatura for inferior a 30C,
acrescentar a levedura.
Experimento:
Frascos n 1 e 2: 100 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao;
Frascos n 3 e 4: 100 mL de meio de cultura e 2,0 g/L de levedura com agitao;
Frascos n 5 e 6: 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao;
Frascos n 7 e 8: 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura sem agitao;

Anlise de crescimento:
1. Retirar 1 mL de amostra a partir do tempo zero, de 2 em 2 horas;
2. Ler a absorbncia em 600 nm no espectrofotmetro, realizando as diluies
necessrias caso a absorbncia ultrapasse 0,0800.
Concentrao de acares redutores:
1. Adicionar a tubos de ensaio 500 L de amostra previamente filtrada e 500 L de
DNS;
2. Agitar os tubos em agitador tipo vrtex e levar ao banho-maria 100C por 5
minutos;
3. Resfriar a temperatura ambiente e adicionar 5 mL de gua destilada;
4. Ler a absorbncia a 540 nm;
5. A curva padro de glicose foi utilizada para determinar os valores de
concentrao de acares redutores, conforme mostrado na figura 1.

Figura 1

Resultados e Discusso
As fases de crescimento celular so mostradas na figura 2. Para os experimentos
de 1 a 4, visualiza-se a fase lag nas primeiras 2 horas de experimento. Passando as
primeiras 2 horas at a 6 hora percebe-se a fase de multiplicao celular, conhecida
como fase exponencial. A fase de esgotamento dos nutrientes, fase estacionria, quase
no percebida, pois em seguida inicia a fase de morte celular. Isso pode ser explicado
pela rpida capacidade se multiplicar da levedura.

Figura 2

Experimento 1 e 2:
Os experimentos 1 e 2 foram realizados com 100 mL de meio de cultura e 1,0
g/L de levedura com agitao. Os valores de concentrao de clula e substrato, tempo
de duplicao, consumo de substrato e produtividade so mostrados na tabela 1.

Tabela 1
tempo Concentra Concetra
ln
Tempo de
(h)
o de
o de
Concentrao Duplica
Celula
Glicose
de clula (g/l)
o (h)

Consumo Produtivid
de
ade
Substrato

(g/l)

(g/l)

0,47985

10,6585603
1

2
3
4
6
8

0,7343
0,7301
0,9653
1,463
1,2474

0,746

(g /g)
-0,734281724

3,0361243 0,07743206 0,1228937


13
4
5

-0,308837615
-0,314573768
-0,035316345
0,380489122
0,221061385

A velocidade de crescimento foi de 0.2283 h-1. A figura 3 mostra uma curva de


crescimento linear. Esse crescimento moderado pode ser justificado devido a grande
quantidade de meio de cultura no frasco e a pouca quantidade de levedura, que apesar
de estar sendo aerado, a quantidade de oxignio torna-se baixa.

lnX

t(h)

Figura 3
Apesar do baixo crescimento, a figura 4 mostra que houve um consumo de
glicose pela S. cerevisiae, pois a concentrao de glicose est diminuindo
concomitantemente com o aumento do crescimento celular . A determinao dos acares
redutores totais foi realizada pelo mtodo DNS.

g/L

t(h)

Figura 4

Experimento 3 e 4:
Os experimento 3 e 4 foram realizados com 100 mL de meio de cultura e 2,0 g/L
de levedura com agitao. Como se pode observar na figura 1 o crescimento foi maior.
Isso pode ser justificado devido o aumento da quantidade de levedura no meio. Na
figura 5 mostrado o crescimento exponencial, a velocidade do crescimento
exponencial de 0,1831 h-1.

lnX

t(h)

Figura 5
O tempo de duplicao celular foi de 3, 7856 h e a produtividade foi de 0,1797
conforme mostrado na tabela 2. Esse valores so maiores que dos experimentos 1 e 2 ,
mostrando assim que o aumento na quantidade de levedura no meio melhora a cintica
de crescimento da S. cerevisiae, pois o tempo de duplicao, consumo de substrato e
produtividade aumentaram.

Tabela 2
tempo
(h)
0
2
3
4
6
8

Concentra Concetra
Consumo
ln
Tempo de
o de
o de
de
Produtivid
Concentrao Duplica
Celula
Glicose
Substrato
ade
de clula (g/l)
o (h)
(g/l)
(g/l)
(g/g)
11,9509727
3,7856208 0,04321510
0,8666
-0,14317777
0,179725
6
66
9
1,2803
0,247094425
1,33
0,285178942
1,6002
0,470128621
2,3044
0,834820339
1,21167315
1,3307
0,28570512
2

Assim como nos experimento 1 e 2, houve um baixo crescimento porm a


figura 6 mostra que houve um consumo de glicose pela S. cerevisiae, pois a
concentrao de glicose est diminuindo concomitantemente com o aumento do
crescimento celular.

g/L

t(h)

Figura 6

Experimento 5 e 6:
Os experimento 5 e 6 foram realizados com 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L
de levedura com agitao. Houve ento uma reduo de 50% na quantidade de meio de

cultura. Essa reduo de nutrientes resultou em baixo crescimento da levedura. Porm


conforme a figura 7, houve um consumo de glicose. A produtividade foi de 0,057 e o
consumo de glicose foi de 0,042 g/g, conforme mostrado na tabela 3.

g/L

t(h)

Figura 7

Tabela 3
Concentra Concetra
Consumo
ln
Tempo de
tempo
o de
o de
de
Produtivid
Concentrao Duplica
(h)
Celula
Glicose
Substrato
ade
de clula (g/l)
o (h)
(g/l)
(g/l)
(g/g)
11,6007782
0,04205579 0,0573562
0
0,46515
-0,765395345
1
5
5
2
0,756
-0,279713903
3
0,6531
-0,426025022
4
0,8603
-0,150474113
6
0,6986
-0,358676947
0,69027237
8
0,924
-0,079043207
4

Experimento 7 e 8:

Os experimento 7 e 8 foram realizados com 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L


de levedura sem agitao. Portanto houve uma reduo de 50% de nutrientes e no
houve aerao, esses parmetros resultaram em uma produtividade de 0,0263, mais
baixa que a produtividade dos experimentos 6 e 7, que tinham os mesmos parmetros,
porm com aerao. Porm, assim como nos experimentos 6 e 7, houve um pequeno
consumo de glicose, conforme figura 8. Os resultados do crescimento esto mostrados
na tabela 4.

g/L

t(h)

Figura 7

Tabela 4

tempo
(h)
0
2
3
4
6
8

Concentra Concetra
Consumo
ln
Tempo de
o de
o de
de
Produtivid
Concentrao Duplica
Celula
Glicose
Substrato
ade
de clula (g/l)
o (h)
(g/l)
(g/l)
(g/g)
9,19669260
0,02458184 0,0263812
0,68985
-0,371281096
7
9
5
0,64505
-0,438427446
0,2996
-1,205307027
0,8484
-0,164403056
0,4837
-0,726290399
0,61108949
0,9009
-0,104361015
4

Concluso
Com a anlise dos dados obtidos pode-se concluir que o desenvolvimento da
S.accharomyces cerevisiae simples, por processos assexuais e, por isso, muito rpido
em condies ambientais favorveis. O crescimento influenciado por vrios fatores
ambientais, destacando-se o alimento e o oxignio. Cada um destes fatores importante
e pode limitar o crescimento, determinando o desenvolvimento da levedura
A elaborao de dados cinticos em forma de grficos facilitam o entendimento
da cintica microbiana, fornecendo dessa maneira parmetros para que diversos microorganismos possam ser utilizados em bioprocessos de mdio a grande porte.

Referencial Bibliogrfico
DE CARVALHO, Giovani B. M.; BENTO, Camila V.; SILVA, Joo B. A.Elementos
Biotecnolgicos Fundamentais no Processo Cervejeiro: 1 parte As Leveduras.
Revista Analytica: Outubro/Novembro 2006, N25.
Endereo Eletrnico: http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=235. Acessado em 29 de
Setembro de 2011.