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Histologia e Embriologia

Histologia e Embriologia

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Arquivo PDF com resumo sobre os principais tópicos da Histologia Básica
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A histologia estuda as células e o material extracelular que constituem os tecidos
do corpo. O ME que é 1000 vezes mais potente que o MO ampliou bastante o campo de
estudo da histologia, assim como outros instrumentos e técnicas de estudo como a
cultura de células, as técnicas de radioautografia e de imuno-histoquímica.
Como são feitas as lâminas histológicas: o que se deseja é levar ao microscópio um
preparado no qual os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma
estrutura e composição química que possuíam quando vivos.
A fixação estabiliza os tecidos: para que a célula não se destrua (autólise), ou bactérias
não a destruam, os tecidos devem ser tratados imediatamente após sua retirada. Esse
tratamento é denominado fixação, cuja principal função é insolubilizar as proteínas do
tecido. Um dos melhores fixadores para o MO é o formaldeído a 4% em solução
tamponada. No ME são usadas duas fixações, primeiro em solução tamponada de
aldeído glutárico, e em seguida, em solução também tamponada, de tetróxido de ósmio.

Etapas

Finalidades

Durações

1. Fixação em fixador simples
ou em mistura fixadora
(liquido de Bouin, Helly etc.).

Preservar a morfologia e a
composição dos tecidos.

Cerca de 12 hs,
dependendo do fixador
do tamanho da peça.

2. Desidratação em álcool
etílico de concentrações
crescentes, começando com
álcool a 70% e terminando
com álcool absoluto.

Remover a água dos tecidos. 6 a 24hs, dependendo
do tamanho da peça.

3.

Clareamento

ou
diafanização em benzol, xilol
ou toluol, solventes do álcool
e da parafina.

Embeber a peça em substancia
miscível com a parafina.

1 a 6hs, dependendo o
tamanho da peça.

4. Impregnação pela parafina
fundida, geralmente realizada
em estufa a 60ºC.

A parafina penetra nos vasos,
nos espaços intercelulares e
mesmo no interior das células,
impregnando o tecido e
tornando mais fácil a obtenção
dos cortes no micrótomo.

30 min a 6hs,
dependendo

do

tamanho da peça.

5. Inclusão: a peça é colocada
num

molde

retangular

contendo parafina fundida.

Obtenção do bloco de parafina
de forma regular, para ser
cortado no micrótomo.

Após a fixação os tecidos são impregnados com parafina ou resinas sintéticas a fim
de que possam ser cortados em fatias finas:
para a obtenção dos cortes os tecidos tem
que ser embebido e envolvidos em substancias de consistência firme (parafinas ou
resinas plásticas). Há uma série de tratamentos que o tecido deve sofrer antes da
impregnação. Na primeira etapa, a desidratação, a água é extraída dos tecidos pela
passagem dos mesmos em banhos de concentrações crescentes de etanol, geralmente de
70% até o etanol absoluto (ou puro ou 100%). Em seguida, o etanol é substituído por
um liquido miscível como meio de inclusão. Para a inclusão em parafina usa-se o xilol
ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substancias tornam-se translúcidos, por isso
essa etapa é chamada diafanização ou clareamento. Mergulha-se o tecido em parafina a

60ºC. Devido ao calor o xilol ou benzol evaporam e os espaços anteriormente ocupados
por eles são ocupados pela parafina. Em seguida coloca-se o tecido num recipiente
contendo um pouco de parafina fundida e deixa solidificar em temperatura ambiente
formando um bloco de parafina como tecido no seu interior, que é seccionado pela
navalha de aço do micrótomo, obtendo-se cortes de 6 a 8 µm de espessura. Esses cortes
são estirados em água quente e colocados nas lâminas. A imersão dos tecidos em etanol
e xilol ou benzol retira os lipídios, quando são eles que se quer estudar usa-se o
micrótomo de congelação.
A coloração facilita a visualização dos componentes teciduais: a maioria dos tecidos
é incolor. A maioria dos corantes utilizados em histologia comporta-se como ácido ou
base e tende a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os
componentes basófilos têm caráter ácido e se ligam aos corantes com caráter básico, já
os acidófilos têm caráter básico e se ligam aos corantes com caráter ácido. Azul-de-
toluidina, azul-de-metileno e a hematoxilina são corantes básicos, enquanto orange G,
eosina e fucsina ácida são corantes ácidos. O núcleo celular é basófilo e o citoplasma é
quase sempre acidófilo. A coloração dupla pela hematoxilina e a eosina (HE) é a mais
utilizada na rotina em histologia, porem muitos outros corantes são usados. Além dos
corantes usa-se também a impregnação metálica com sais de prata e ouro.
Técnicas

Constituintes Núcleos Citoplasma Fibras

colágenas

Fibras
elásticas

Fibras
reticulares

HE

Hemalúmen
(hematoxilina)

Azul

----

----

Irregular ----

Eosina

----

Róseo

Róseo

Irregular ----

Hematoxilina
férrica

Preto ----

----

----

----

Tricrômico
de Masson

Fucsina ácida
e ponceau de
xilidina

----

Vermelho ----

----

----

Verde-luz

----

----

Verde

----

----

Fucsina-
resorcina de
Weigert

Fucsina-
resorcina

----

----

----

Púrpura ----

Impregnação
argêntica
para fibras
reticulares

Soluções de
sais de prata

----

----

Castanho-
escuro

----

Preto

O microscópio óptico não permite o estudo de detalhes com menos de 0,2µm: a
parte óptica do microscópio consiste em três sistemas de lentes: condensador, objetiva e
ocular. A ampliação total dada pelo MO é igual ao aumento da objetiva multiplicado
pelo aumento da ocular. O fator mais significativo para uma boa imagem é a resolução,
que é a menor distancia para que duas partículas apareçam como objetos separados. O
limite da resolução dos melhores MO é 0,2µm e ele depende essencialmente da
objetiva, a ocular apenas aumenta de tamanho a imagem projetada de foco pela objetiva.

Os microscópios de contraste de fase facilitam a visualização das células e tecidos
vivos:
o estudo de tecidos vivos é difícil, pois a maioria dos seus componentes são
incolores e transparentes. O microscópio de contraste permite o estudo de muitos
detalhes celulares in vivo. A velocidade com que a luz atravessa um corpo transparente
depende da quantidade de matéria presente e determina o índice de refração desse
corpo. Quanto maior a densidade, maior o índice de refração e menor a velocidade da

luz no corpo. Como as diversas estruturas celulares têm índices diferentes, causam
atrasos diferentes nas ondas luminosas dando origem a diferenças de fase entre as ondas
luminosas emergentes, mas essas diferenças ao são visíveis. No microscópio de
contraste de fase existem dispositivos especiais que transformam essas diferenças de
fase em diferenças de amplitude, dando diferenças de intensidade luminosa, para as
quais a retina é sensível.
Cortes ópticos podem ser obtidos com o microscópio confocal: este tipo de
microscópio utiliza raios laser e gera imagens de planos ópticos do tecido em exame.
Isto torna possível imagens muito nítidas porque o material situado abaixo do plano de
foco não contribui para a formação da imagem e, assim, não compromete sua nitidez.

O microscópio de polarização revela a presença de moléculas alongadas e
orientadas:
ao atravessar um filtro polariode a luz torna-se polarizada. Colocando-se
um segundo filtro no microscópio, acima do primeiro e com seu eixo perpendicular, a
luz não atravessa o conjunto. O primeiro filtro é colocado no condensador e recebe o
nome de polarizador. O segundo filtro, ou analisador, é colocado entre a objetiva e a
ocular. Quando o polarizador e o analisador estão com seus eixos perpendiculares, o
campo do microscópio aparece escuro, mas se entre os dois filtros existirem estruturas
contendo moléculas orientadas (anisotrópicas ou birrefringentes, modificam o eixo da
luz recebida do polarizador), estas estruturas aparecerão brilhantes contra um fundo
escuro.
Microscopia de fluorescência: quando excitadas por certos comprimentos de onda,
algumas substâncias absorvem energia e emitem luz de maior comprimento de onda.
Em microscopia utiliza-se a citação com radiação ultravioleta, para que a radiação
emitida caia na faixa de luz visível. As substancias fluorescentes aparecem como
substancias brilhantes contra um fundo escuro.
Microscopia eletrônica: os elétrons são produzidos graças ao aquecimento no vácuo de
um filamento que então emite elétrons. Essas partículas são aceleradas devido a uma
ddp de 60 a 100 kV existente entre o filamento e o anodo. Devido ao fato de serem
elétrons facilmente desviados pelo objeto, torna-se necessário utilizar cortes muito finos
de tecido (20 a 100 nm de espessura). Para isso foi necessário desenvolver métodos
especiais de microtomia, os cortes são feitos em um ultramicrótmo, nos quais são
utilizadas navalhas de vidro ou diamante. Enquanto no MO a luz é absorvia pelas
estruturas coradas, no ME os elétrons são desviados por porções do objeto que
contenham átomos de elevado peso atômico. O resultado é que as estruturas que
desviam elétrons aparecem escuras na tela fluorescente e são chamadas de elétron-
densas. A capacidade de desviar os elétrons depende do numero atômico, por isso se
costuma impregnar os cortes de tecidos com metais pesados a fim de aumentar o
contraste, resultando assim uma imagem nítida e bem visível.

A analise dos elétrons refletidos permite o estudo da superfície de células e tecidos
especialmente preparados:
alem do ME já descrito, chamado de transmissão, existe
outro tipo, denominado microscópio de varredura aqui, entre lente eletromagnética e o
objeto é interposta uma bobina de varredura que provoca um desvio no feixe de
elétrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobe o objeto ponto por ponto, numa
seqüência determinada. O objeto não se deixa atravessar pelo feixe eletrônico, devido a
sua espessura e a uma cobertura feita por evaporação de metal pesado sobre a sua
superfície. Desse modo, o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (feixe primário)
sofre reflexões, originando elétrons secundários, os quais são captados por detectores
especiais que geram um sinal elétrico, transferido para um tubo de vídeo.

O uso combinado de moléculas radioativas e suspensões de brometo de prata em
gelatina (emulsões fotográficas) é a base da técnica radioautográfica:
essa técnica

torna possível a localização de substancias radioativas nos tecidos. Cristais de brometo
de prata agem como microdetectores da radioatividade, pois atingidos pela radiação,
depois de revelados, transformam-se em grãos de prata metálica, que aparecem negros
ao microscópio, denunciando a presença de radioatividade nas estruturas com as quais
estão em contato. Esse método tem sido utilizado para o estudo de fenômenos
biológicos. Por exemplo, a síntese de proteínas pode ser estudada pela injeção de
aminoácidos marcados com carbono 14 e hidrogênio 3, as moléculas que se formarem
serão radioativas e poderão ser encontradas pela radioautografia.

A separação , em quantidade, dos componentes celulares é possível pela técnica de
centrifugação fracionada:
é um processo físico que aplica a força centrifuga para
separar organelas celulares, de acordo como coeficiente de sedimentação de cada uma,
esse depende do tamanho, forma e densidade da partícula e da densidade e viscosidade
do meio. Submetendo-se uma célula à ação de uma força centrifuga adequada, suas
organelas se distribuirão em diferentes camadas. Utilizando essa técnica pode-se isolar
qualquer organela celular, determinar sua composição química e estudar suas funções in
vitro. Após a homogeneização, inicia-se a centrifugação d sobrenadante, utilizando-se
forças centrífugas cada vez maiores. As partículas mais densas sedimentam primeiro. O
sobrenadante de cada centrifugação é submetido a uma força centrífuga maior, obtendo-
se, desse modo, a separação dos diversos componentes celulares.
Histoquímica e citoquímica: esses termos são usados para indicar os métodos para a
localização de diferentes substancias nos cortes de tecido e eles têm por base reações
químicas especificas, ou a interação macromolecular de alta afinidade. Nos dois casos, o
resultado final é a produção de compostos insolúveis, coados, ou eletrón-densos, que
possibilitam a localização de sustâncias específicas nos cortes de tecidos através do uso
do MO ou ME. Para os lipídios os corantes mais usados são: o Sudan IV e o Sudan
negro, que coram os lipídios respectivamente em vermelho e preto; para os ácidos
nucléicos: a reação de Feulgen; para o RNA: azul-de-toluidina ou azul-de-metileno
(precisa de lâmina controle com ribonuclease); para polissacarídeos: PAS (reação do
acido periódico de Schiff, precisa de lâmina controle com amilase); para enzimas:
produzir um precipitado fortemente corado ou elétron-denso no local da atividade
enzimática.

Interações de alta afinidade entre macromoléculas servem para a realização de
técnicas importantes como a imunocitoquímica, a citoquímica com lectinas e a
hibridização in situ:
essas interações são muito especificas, localizando as moléculas
com muita precisão, o exemplo mais bem estudado é a interação antígeno-anticorpo. A
técnica da imunocitoquímica baseia-se no seguinte fato: quando uma macromolécula
estranha denominada antígeno é introduzida em um organismo, este reage produzindo
uma proteína chamada anticorpo, que por sua vez combina-se especificamente com o
antígeno. A técnica consiste em acoplar sustâncias marcadoras a anticorpos sem que
estes percam a capacidade de se combinar como antígeno. Isto é utilizado de duas
maneiras, denominadas técnicas direta e indireta de imunocitoquímica. Três métodos
são muito utilizados para marcar os anticorpos: (1) conjugação com composto
fluorescente; (2) conjugação com uma enzima e (3) conjugação com uma substancia que
não se deixa atravessar pela luz e que dispersa elétrons. TÉCNICA DIRETA: para um
antígeno x tirado de um animal é feito um anticorpo em outro animal, que depois de
purificado e acoplado com um composto fluorescente volta para o animal que tinha o
antígeno X e se liga a ele formando uma estrutura acoplada fluorescente, ficando visível
a localização do antígeno X. TÉCNICA INDIRETA: na primeira etapa faz-se a imersão
do corte histológico em solução com anticorpo não marcado, obtido do sangue de um
animal no qual foi injetado o antígeno cuja localização se deseja determinar. O

anticorpo fixa-se ao antígeno, mas isso não pode ser observado ao microscópio, por isso
o anticorpo não está marcado. Na segunda etapa, imerge-se o preparado em solução
com antigamaglobulina marcada. Esta ultima é, portanto, um anticorpo. A
antigamaglobulina marcada fixa-se à gamaglobulina que já está ligada ao antígeno,
revelando a localização dele. TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU: para
entender como a célula funciona é necessário entender o fluxo de informações entre o
DNA e as proteínas sintetizadas na célula. Dentre as técnicas com essa finalidade
encontra-se a técnica de análise Southern, que possibilita caracterizar e quantificar o
DNA de um gene; análise Northern, que identifica e quantifica um RNAm mesmo na
presença dos numerosos outros RNA’s; e a análise Western, para detecção de uma
proteína especifica, dentre as que existem numa célula ou tecido. As análises Southern e
Northern se baseiam na alta afinidade que existe entre segmentos complementares de
ácidos nucléicos, o que torna possível a hibridização. A análise Western se baseia na
alta afinidade e especificidade entre antígenos e respectivos anticorpos.
HISTOQUÍMICA COM LECTINAS: as lectinas são proteínas obtidas de sementes de
vegetais, que se ligam com alta afinidade e especificidade a carboidratos da superfície
celular. As diferentes lectinas ligam-se a segmentos específicos de certos hidratos de
carbono. Caracterizam moléculas da membrana que contêm certos carboidratos, e
geralmente, é marcada com peroxidase, para tornar possível sua localização através da
técnica histoquímica para peroxidase.

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