11.

Separacin de aminocidos por cromatografa

en capa fina y deteccin mediante reaccin
con ninhidrina
Jess V. Jorrn Novo, M Nieves Abril Daz,
Jos A. Brcena Ruiz
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en

la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de
solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema
cromatogrfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase
mvil o eluyente (disolvente B). Es una tcnica simple en cuanto al
equipamiento necesario (placa y tanque cromatogrfico) y de fcil
desarrollo. El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf
(coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un
compuesto entre la fase estacionaria y fase mvil, y que depende de su
estructura qumica y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de
ejemplo, y dentro de la presente prctica, se llevar a cabo la separacin
de una mezcla de aminocidos, que se revelarn e identificarn mediante la
reaccin con la ninhidrina.

Palabras clave: anlisis cualitativo, biomolculas, coeficiente de reparto,

reacciones coloreadas.
Abreviaturas empleadas. CCF: cromatografa en capa fina; TLC: thin layer
chromatography.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
1.1. Separacin de molculas por cromatografa
El estudio y caracterizacin de las distintas biomolculas (azcares, lpidos,
protenas, cidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y
purificacin a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier
material biolgico. Una de las tcnicas bioqumicas ms clsicas y utilizadas
para dicho fin es la cromatografa. La cromatografa incluye una amplia gama de
tcnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento fsico-qumico en el
que se basa la separacin (cromatografa de adsorcin, de reparto, de cambio
inico, de filtracin molecular, hidrofbica y de afinidad), o al material sobre el
que se lleva a cabo (cromatografa en papel, capa fina, en columna y de gases).

Todas las tcnicas intentan explotar las diferencias fsicas, qumicas y biolgicas
de las distintas biomolculas para llevar a cabo su separacin y aislamiento.
Entre dichas propiedades podramos citar:
i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgnicos como
acuosos.
ii) Diferencias en tamao y forma.
iii) Diferencias en carga.
iv) Diferencias en afinidad por otras biomolculas.
Todas estas propiedades y, por tanto, la separacin de diferentes compuestos
estn influenciadas por las condiciones del medio de separacin, pH,
temperatura, fuerza inica e hidrofobicidad.
De forma general, en las tcnicas cromatogrficas existe una distribucin de
las molculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador
que permanece fija en el espacio, y la fase mvil que circula sobre la fase
estacionaria en ntimo contacto con sta.
1.2. Cromatografa de reparto
En la presente prctica llevaremos a cabo una cromatografa de reparto, en
capa fina, para la separacin de aminocidos. En la cromatografa de reparto los
componentes de una mezcla se separan en base a una distribucin diferente
entre la fase mvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las molculas
a lo largo del sistema cromatogrfico es el resultado de un equilibrio entre las
fuerzas de transmisin o arrastre ejercido por la fase mvil en su desplazamiento
sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho
desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en
criterios de solubilidad) como de adsorcin.
La teora de la cromatografa de reparto se basa en que, en general, si dos
fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos
fases contiene un soluto, ste se distribuir entre ambas de acuerdo con sus
solubilidades relativas. Dicho fenmeno se denomina reparto y viene
determinado por el coeficiente de reparto, que es la relacin entre las
concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatografa
de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria
lquida. La mezcla a separar junto con la fase mvil se hace avanzar a lo largo
de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase mvil arrastrar
consigo un porcentaje de molculas de cada componente a separar de acuerdo
con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno
de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o
eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si
stos son diferentes aqulla tambin lo ser, siendo posible la separacin si se
utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las molculas
de soluto se distribuirn no puntualmente, sino formando un rea debido a que
son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenmenos tales como la
difusin.
En la cromatografa de reparto se suelen utilizar diversos materiales como
soportes: almidn, celulosa, gel de slice, xido de aluminio, etc. Aunque en
2

teora se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorcin,

por lo que la separacin ocurrir tambin, en parte, debido a la interaccin entre
las molculas a separar con dicho soporte, la cual actuara como fuerza de
frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte
con el solvente adecuado; ste recubre las partculas del soporte y es retenido
por adsorcin y/o capilaridad. El espacio entre las partculas del soporte ser
utilizado por la fase mvil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta
que como fase mvil se suelen utilizar solventes hidrfobos cuando haya que
separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar
sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos
parcialmente inmiscible con la mvil, suele ser por lo general hidroflica, aunque
tambin pueden utilizarse compuestos hidrfobos.
1.3. Cromatografa en capa fina
En la cromatografa en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en
la terminologa inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que
pueda dividirse en partculas finas y distribuirse uniformemente en forma de
lminas. Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de slice, xido de aluminio,
tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgnicas (celulosa, poliamida,
polietileno, etc). La utilizacin de soportes hidrfobos facilita la separacin de
compuestos no polares (lpidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es
una lmina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la
superficie de una placa de vidrio o plstico. Aunque muchas casas comerciales
suministran placas ya preparadas, stas pueden hacerse en el laboratorio con
aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plstico la
papilla formada por la suspensin del material en un disolvente adecuado
(generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilizacin.
Para el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolvente
adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o
capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crtico,
ya que va a afectar a la resolucin (separacin de los componentes de una
mezcla compleja), y depende de la concentracin del compuesto o compuestos
de inters en la muestra. Para soluciones concentradas bastar una cantidad
muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a
separar sin llegar a saturar la capacidad de resolucin de la placa
cromatogrfica. Para soluciones muy diluidas, deber aplicarse un volumen
suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o
solutos de inters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeos
volmenes fraccionarios, no procedindose a una nueva adicin hasta haberse
secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicacin se
hara muy grande, distando mucho de la situacin ideal de concentracin de la
muestra en un solo punto de aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la
placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque cromatogrfico) y uno de los
extremos (el ms prximo a la lnea de aplicacin) se sumerge en un disolvente
apropiado (fase mvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo
de la lnea de aplicacin. El solvente se desplaza a travs del soporte por
capilaridad provocando un reparto de los solutos entre l y la fase estacionaria
de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que
el solvente haya alcanzado un punto prximo al otro extremo de la placa, sta se
saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si
3

no son visibles, se pueden revelar mediante tcnicas analticas concretas. Se

determina la posicin de cada mancha relativa al frente alcanzado por el
solvente, calculndose el correspondiente valor de Rf. La deteccin de los
compuestos una vez realizada la cromatografa se puede llevar a cabo en base a
sus propiedades espectroscpicas, fluorimtricas, hacindolos reaccionar con
reactivos especficos, radioisotpicamente, etc. La identificacin de tales
compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de
referencia (patrones) de naturaleza qumica conocida. Alternativamente, los
diferentes compuestos, una vez localizada su posicin por un mtodo no
destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y
extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado.
Uno de los factores ms crticos en este tipo de cromatografas es la eleccin
de la fase mvil, que, bsicamente, suele estar formada por una mezcla de un
solvente orgnico con agua y algunas sustancias adicionales tales cmo cidos,
bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la
solubilidad de algunos compuestos. Adems de en una sola direccin, la CCF
puede tambin realizarse bidimensionalmente. En este caso slo se aplica una
nica muestra, que se dispone en uno de los vrtices de la placa y se eluye dos
veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares.
La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografas
alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes:
i) Una mayor resolucin, obtenindose por lo general manchas ms
pequeas.
ii) Una mayor velocidad de separacin.
iii) Pueden utilizarse un gran nmero de materiales como soportes y
disolventes.
iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperacin
es muy simple.
La mayor resolucin obtenida por CCF se debe a que pueden formarse
partculas muy finas del soporte, por lo que la relacin superficie/volumen es muy
elevada, proporcionando una gran rea superficial por unidad de longitud. Esto
se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la
difusin es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografa en papel es
que ste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende
a aumentar la difusin de las molculas.
1.4. Reacciones coloreadas de aminocidos
Los mtodos colorimtricos de determinacin de aminocidos se basan en la
reaccin especfica de stos con determinados compuestos, dando derivados
coloreados. La formacin de color se toma como resultado positivo e indica su
presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no est
presente. Para cada prueba se utilizar un control negativo, tambin denominado
blanco de la reaccin, en el que el reactivo se aadir a agua destilada (o
solvente adecuado). Aunque en la presente prctica se llevar a cabo la
determinacin cualitativa de aminocidos (ausencia o presencia de dichos
compuestos), las reacciones coloreadas pueden tambin ser utilizadas para la
determinacin cuantitativa de dichas biomolculas.
4

Hay una amplia gama de mtodos colorimtricos que permiten la

determinacin cuali- y cuantitativa de aminocidos. Aunque son mtodos muy
generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos
compuestos. As, hay mtodos de determinacin de aminocidos con el grupo
amino libre (mtodo de la ninhidrina), de aminocidos con ncleos aromticos
(reaccin xantoproteica), de los que poseen un grupo indlico (triptfano;
reaccin con el cido glioxlico), un anillo fenlico (tirosina; reaccin de Millon),
de aminocidos azufrados (cisteina; reaccin con nitroprusiato sdico). En todos
los mtodos, el aminocido reacciona con otro compuesto formando derivados
coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopa
visible.
De todos los mtodos reseados, el ms general y utilizado es el de la
reaccin con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona
con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de
amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a
hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y
otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que
presenta una coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una
coloracin amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino est sustituido).
El derivado coloreado presenta mximo de absorcin en torno a 570 nm. La
reaccin se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8.
Las aminas primarias (R-CH2-NH2) dan tambin positiva la prueba de la
ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2. La tcnica es muy sensible,
por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminocidos,
utilizndose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones
procedentes de otras tcnicas de separacin. La presencia de aldehdos
resultantes de la degradacin de la ninhidrina por reaccin con los aminocidos
modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar
el tipo de aminocido.

Figura 1. Reaccin de aminocidos con la ninhidrina.

1.5. Objetivos

i) Separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina sobre gel de

slice.
ii) Revelado de los aminocidos mediante la reaccin coloreada con la
ninhidrina.
iii) Clculo del valor de Rf para cada uno de los aminocidos. Justificacin de
las diferencias en Rf de los distintos aminocidos.
iv) Identificacin de la naturaleza de aminocidos desconocidos.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

Se incluye tanto el material de uso particular para cada grupo como el de
uso general, as como reactivos. En la Figura 2 se muestra una fotografa del
material de uso particular y en la Figura 3 la frmula de los aminocidos
empleados.
2.1. Equipamiento
Secador de pelo.
Placa de silicagel para cromatografa en capa fina.
Agitador de tubos.
Tanque cromatogrfico.
2.2. Material
Gradillas con tubos de ensayo.
Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 y 25,0 ml).
Propipetas.
Probetas (100 y 250 ml).
Vasos de precipitado (100 y 500 ml).
Frasco lavador con agua destilada.
Recipientes de muestras biolgicas de 50 ml.
Papel de filtro.
Capilares para aplicar muestras.
Papel de parafilm.
Rotulador de vidrio.
Pipetas Pasteur de plstico.
Guantes de ltex.
Frascos pulverizadores.
Tijeras.
2.3. Reactivos
Glutamato.
Glicina.
Lisina.
Prolina.
Leucina.
Solucin problema de aminocidos.
Etanol.
Hidrxido amnico.
Ninhidrina.
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Figura 2. Material empleado en la prctica.

Leucina
Prolina
Glicina
Figura 3. Frmula de los aminocidos empleados.

Glutamato

Lisina

3. PROTOCOLO A REALIZAR
Los distintos pasos del procedimiento se ilustran en la Figura 4.
3.1. Paso primero
Sobre una placa de silicagel de 20 x 20 cm se traza con un lpiz una recta
paralela a uno de los bordes y a una distancia de ste de 2 cm. Sobre esta lnea
se pone 6 puntos equidistantes entre si y sobre los bordes.
ADVERTENCIAS: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las
manos, ya que la contaminaramos con aminocidos procedentes de nuestras
manos. No utilizar nunca bolgrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la
marquis.
3.2. Paso segundo
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En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminocidos)

se aplicarn tres gotas de la solucin de aminocidos y solucin problema (un
aminocido en cada punto y en el ltimo la solucin problema). Se utiliza un
capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca
con un secador de pelo despus de haber aplicado cada gota. Se marca con
lpiz, y en el extremo opuesto de la placa, algn indicativo del grupo que realiza
la cromatografa.
3.3. Paso tercero
Se aade al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1
cm y sin que ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. Se mete la
placa en el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografa hasta que el
eluyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (2-3 h
aproximadamente).
ADVERTENCIA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el
eluyente es txico.
3.4. Paso cuarto
Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida
por el eluyente, se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un
secador de aire y se roca con un pulverizador que contiene la solucin
reveladora (en la campana de gases). La placa se secar hacindole llegar aire
caliente con el secador.
ADVERTENCIA: Esta operacin debe de hacerse en la campana extractora
de gases.

Figura 4. Desarrollo de la prctica.

4. RESULTADOS
4.1. Se representan en una figura, similar a la de la Figura 5, los resultados
obtenidos.
4.2. Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los
aminocidos en una tabla y se calculan los correspondientes valores de Rf.
4.3. Se indica la composicin de la solucin problema, justificando la
conclusin a la que se ha llegado.

Figura 5. Esquema de los resultados de una cromatografa en capa fina y clculo del Rf.
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Tabla 1. Distancia recorrida por cada uno de los aminocidos y clculo del Rf
Aminocido
Distancia recorrida
Rf
(cm)
Glutamato
Glicina
Lisina
Prolina
Leucina

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
Se deben justificar las diferencias en los valores de Rf para cada uno de los
aminocidos, as como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A
partir de la estructura qumica hay que relacionar el mayor o menor valor de Rf
con la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria y mvil.
A tenor de los resultados obtenidos, se deben responder las siguientes
cuestiones:
Qu se podra decir de la resolucin de la tcnica y cmo podra aumentarse
sta?
Qu ocurrira si la longitud de la placa se incrementara de 20 a 100 cm si
se aumentara el tiempo cromatogrfico de 2 a 20 horas?
Aadir los comentarios adicionales que se crean convenientes y procedentes.

6. BIBLIOGRAFA COMENTADA
Es importante hacer hincapi en la importancia de consultar la bibliografa
recomendada con el fin de un mejor aprendizaje y para presentar y discutir
correctamente los resultados obtenidos en el cuaderno de prcticas. Es
importante, as mismo, conocer la estructura y propiedades qumicas de los
compuestos que se van a utilizar, en este caso los aminocidos, por lo que se
recomienda consultar las notas de clase o algn libro de texto de bioqumica
general.
Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC.
Excelente libro de bioqumica estructural. En el captulo de aminocidos se
describen con detalle sus propiedades fsicas y qumicas.
Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and
Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd.
Desarrollo histrico de la tcnica y aplicaciones.
Bermdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceo I, Prieto JC, Arrieta L
Propuesta para un protocolo de diagnstico de homocistinuria.
http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v44n3/0023%20propuesta
.pdf

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ANEXO 1: SOLUCIONES
1. Soluciones de los distintos aminocidos (glutamato, glicina, lisina,
prolina y leucina) al 1%
Solucin de aminocido al 1 %
100 ml
Aminocido
1g
n-Propanol
10 ml
Agua destilada
Hasta 100 ml

2. Solucin de eluyente
2.1. Solucin de hidrxido amnico al 34 %
Solucin de hidrxido amnico
100 ml
Hidrxido amnico
34 g
Agua destilada
Hasta 100 ml

2.2. Solucin de eluyente (etanol: hidrxido amnico, en una proporcin 7:3)

Solucin de eluyente
200 mL
210 mL
90 mL

Etanol
Solucin de hidrxido amnico

3. Solucin reveladora (se prepara el da de uso)

Solucin de ninhidrina
100 ml
0,2 g
Hasta 100 ml

Ninhidrina
Agua detilada

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