Apresentaçãp Cromatografia Liquida

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)

facebook.com/crqiv
twitter.com/crqiv
Princpios e Aplicaes da Cromatografia

Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Ministrante: Guilherme Julio Zocolo
Doutor em Qumica Analtica - Unesp/Araraquara
Contatos: gjzocolo1@gmail.com
Apoio
Araraquara, 15 de setembro de 2012

Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Princpios e Aplicaes da Cromatografia

Lquida
de Alta Eficincia (HPLC)
Dr. Guilherme Julio Zocolo

E mail: gjzocolo1@gmail
E-mail:
gjzocolo1@gmail.com
com
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta

Efi i i (HPLC)
Eficincia
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Toxicologia
Cosmticos
Frmacos
HPLC
P ti id
Pesticidas
Alimentos
Pr-requisito:
Pr
requisito: a amostra deve ser solvel
na fase mvel
Protenas
Aminocidos
Corantes
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Sistema de HPLC
Solvente
Coluna
Sistema
de dados
Injetor
Bomba
Detector
Descarte
Histrico
Mikhael Semenovich Tswett (1906)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Mikhael Semenovich Tswett (1906)

Cromatografia
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cromatograma
Mtodo cromatogrfico
B i ht der
Berichte
d Deutschen
D t h Botanischen
B t i h Gesellschaft
G ll h ft
Mtodo
componentes
distribuio
fsico-qumico
q
de
uma
diferencial
de
mistura,
destes
separao
p
que
em
envolve
um
de
a
sistema
heterogneo bifsico:
1 - FASE ESTACIONRIA;
2 - FASE MVEL.
Evoluo
das Tcnicas Cromatogrficas

g
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1906
Tswett CROMATOGRAFIAEMCOLUNA(CC)
( )
extratosvegetais;colunac/CaCO3;terdepetrleo
1938
IzmailoveShraiber CROMATOGRAFIAEMCAMADADELGADA(CCD,TLC)
extratosvegetais;placadevidroc/alumina
ERAdaCromatografiaModerna:PrmiosNobel 1937,1938,1939.
1941
MartineSynge CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)
1952
Martin e James CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

MartineJames
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG GC)
Dcadasde1960/1970
Karr,Jentoft,Gouwn,Huber,Hulsman,SnydereKirkiland
Karr
Jentoft Gouwn Huber Hulsman Snyder e Kirkiland
CROMATOGRAFIALQUIDADEALTAEFICINCIA(CLAE,HPLC)
Mecanismo de separao cromatogrfica

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
A separao cromatogrfica obtida a partir de interaes diferenciadas

entre os analitos componentes da mistura, fase estacionria e fase
mvel
mvel.
FM
FE
FASE MVEL
amostra
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

AMOSTRA
FASE
ESTACIONRIA
CROMATOGRAFIA:CLASSIFICAOPELAPOLARIDADEDA
FASE ESTACIONRIA
FASEESTACIONRIA
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar.

Ex.: slica gel
OR
RO Si OH
OR
Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa

polaridade.
Ex. slica de fase ligada C18
FASE NORMAL: fase estacionria polar
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
OR
RO Si OH
OR
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
X=Cl
R = CN, Diol, Fenila, NH2
Quando se utiliza
silica-gel
derivatizada
com
grupos
polares (fenila, ciano, amino,
diol), tais fases estacionrias
podem ser utilizadas tanto
para cromatografia em modo
normal (fase estacionria polar
eluente apolar) ou em fase
reversa
(fase
estacionria
apolar eluente polar).
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Eluem primeiro as substncias

apolares que possuem uma menor
interao com a fase estacionria
polar.
p
a anlise de substncias insolveis em gua:
g
leos,,
Aplicvel
gorduras, lipdios. Destaca-se na separao de ismeros.
Fonte: Waters corporation
Mecanismo de separao cromatogrfica

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fonte: Adaptado de Waters corporation
Caractersticas das FASES NORMAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Vantagens
Desvantagens
1. Versatilidade na mudana de
seletividade alterando as fases mveis e
estacionrias
1. Amostras inicas so de difcil separao

e so mais viveis de se separar por fase
reversa
2. Colunas estveis quando se utiliza

solventes no aquosos
2. Controle da fora de eluio menos

previsvel e mais demorado que em fase
reversa
3. Uma grande variedade de substncias

orgnicas so mais solveis nos solventes
usados em fase normal (til em LC
preparativa)
3 Pior resoluo
3.
4. Decrscimo de p
presso menor devido
baixa viscosidade dos solventes
4. Ponto de ebulio
reduzido p
pode gerar
g
bolhas
5. til para amostras que possam se

decompor em solues aquosas.
aquosas
5. Alto custo dos solventes orgnicos
Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO
Ganhos e Perdas em
FASE NORMAL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fases mveis em Fase Normal

Fora de Eluio
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Baixa (solvente A)
Mdia
Hexano
Clorofrmio, acetonitrila, tetrahidrofurano
Forte (solvente B)
Isopropanol, metanol
Reteno aumenta com aumento da polaridade dos solutos.

Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica
cido actico ou frmico para cidos.

Picos assimtricos
Amnia ou trietilamina para bases.
EFEITOS DA FASE MVEL EM FASE NORMAL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Solvente fraco (A): no-polar
0 5 < k < 20
0,5
Solvente forte (B): polar
Seletividade () fortemente influenciada pela proporo do

solvente B utilizado na fase mvel.
Seletividade () ainda mais fortemente influenciada pelo tipo do
solvente
l
t B utilizado
tili d na fase
f
mvel.
l
F.E.s
F E s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano
F.E.s
F E s (poder de separao): ciano > slica > diol > amino
Efeitos da variao de solvente POLAR na separao

cromatogrfica
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Condies
cromatogrficas
B: Acetato de etila
A Ciclohexano
Coluna de silica
150x4,6 mmx5 m
Vazo de 2 mL min-1
Desenvolvimento de mtodo em FASE NORMAL

Estratgias
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
A. Coluna Ciano (solvente A:

hexano;; solvente B:
propanol).
B. Verifique a presena de
cauda
d nos picos.
i
C. Mudar a proporo do
solvente B; substituindo
o tipo de solvente B
(diclorometano, ACN) e
sua proporo.Em ltimo
caso substitua o tipo de
caso,
coluna (diol, amino,
slica).
D Oti
D.
Otimize
i as condies
di da
d
coluna (L; diametro da
particula e vazo da fase
mvel.))
Fase ligada amino (NH2)

Anlise de esterides em sangue
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fase ligada amino (NH2)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Amostra de suco de frutas:

uva, tomate laranja...
l
j
FASE REVERSA
Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Mecanismo de Interao em Fase Reversa
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Interaes ANALITO X FE e FM X FM
(em ordem decrescente de intensidade):
Van der Waals
Dipolo dipolo
Dipolo dipolo induzido
Dipolo induzido dipolo induzido
Interaes residuais: pte. H
FASE REVERSA:
Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18
R = C2, C4, C8 E C18
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
C2=
C4=
X=Cl
C8=
C18=
Modo de HPLC mais utilizado (~80%): compostos no inicos,

compostos polares a mediamente apolares.
Cromatografia de Fase Reversa (FR)*

FE menos polar que FM.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
C l
Coluna
F
Fase R
Reversa C18
C18:
Aplicao quase universal
((~ 70% das aplicaes
p
na literatura))
Permite anlise desde substncias hidrossolveis
e/ou inicas at substncias lipoflicas.
*Vantagens:
Vantagens:
- Equilbrio mais rpido
- Menor adsoro irreversvel
-gua
g no influi na reprodutibilidade
p
-Stios de adsoro mais homogneos
-Eluio em gradiente facilitada
Cromatografia de Fase Reversa (FR)

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
ODS, RP-18, C-18
Si O Si
RP-8,
RP
8, C
C-8
8
Si O Si
Fenil
Si O Si
TMS C
TMS,
C-1
1
Si O Si
SOLVENTES MAIS COMUNS:

- gua
- Acetonitrila (ACN)
- MeOH
- Tetraidrofurano (THF)
ORDEM DE ELUIO
(crescente)
POLAR APOLAR
Cromatografia de Fase Reversa (FR)

FE menos polar que FM
FM.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fraco (solvente A)
gua
Forte (solvente B)
Metanol, Acetonitrila,
Tetrahidrofurano
Nomograma
Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica

R-COO- + H+ pKa 4-5
R-COOH
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
-OH
-O- + H+
cido actico ou frmico para cidos.

trietilamina para bases.
Picos assimtricos
Amostras de cidos carboxlicos fenlicos
Coluna:
BONDAPAK C18
30 cm X 3,9 mm
FM: gua, com 5% HOAc
Deteco: UV 254nm
Tempo: 30 min.
pKa 10-12
OH
9. c. ferlico
OH
OH
OH
OH
HO
OH
OH
8. c. o-coumrico
OH
4. d-Catequina
OH
OMe
10. c. cinmico
1. cido glico 2. c. protocatecuico 3. c. p-OH-benzico
OH
OH
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
6. c. saliclico
5. c. cafeico
OH
7. c. p-coumrico
Aplicao: antidepressivos tricclicos

FASE REVERSA ((C18))
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm

FM: ACN/Tampo 30:70 + 0,2% TEA e
0,2% TFA
Tampo Fosfato 25 mM pH 2,5
Fluxo: 1,0 mL/min
Detector: UV
O
CH3
NH
H3C
H3C
CH4
N
CH3
3
N
CH3
H3C
4
N
H3C
CH3
Aplicao: anlise de tocoferis

FASE REVERSA (C18)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm

FM: MeOH a 1,0 mL/min
Detector: UV (e: 295 nm)
HO
CH3
CH3
CH3
O
CH3
tocoferol
-tocoferol
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
CH3
CH3
O
CH3
-tocoferol
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
H3C
CH3
CH3
O
CH3
CH3
CH3
-tocoferol (vitamina E)
CH3
H3C
O
CH3
CH3
O
H3C
CH3
O
CH3
CH3
Vitamina E - acetato
Vitamina
CH3
Aplicaes das Principais Fases Estacionrias

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
FASEESTACIONRIA(NormaiseReversas)
COLUNASCROMATOGRFICAS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tubo:aoinoxidvel316tratado;contmFE
*colunascapilaresenano:tubosdeslicafundida
Coluna guarda (pr-coluna): C18 (5 m)
Coluna analtica:
C-18 250 x 4,6mm x 5m
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10m
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1/37
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
Otimizao dos parmetros envolvidos na

separao
p cromatogrfica
g
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
CLCULO DO FATOR DE RETENO
((k))
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Equao de Purnell:
A Equao Fundamental da Resoluo em HPLC
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Resoluo (Rs)
N ( 1) k '2
Rs
.
.
4
(k '2 1)
EFICINCIA
Depende da
configurao
do sistema
FATORES FSICOS
SELETIVIDADE
RETENO
Dependem das caractersticas da

FM e FE do sistema
FATORES QUMICOS
1/37
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Efeito da concentrao de metanol no tempo de reteno de

compostos analisados
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
EfeitodaSeletividade()sobreRs
2.MudanasnaFE
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
geralmenteacompanhadapormudanasnaFM
Ex.FEinicial =Metil;FEalternativas =C8,C18
EfeitodaSeletividade()sobreRs
3 Mudanas na temperatura
3.
1 C k de 1-2%
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Journal of Chromatography A Volume 814, Issues 12, 24 July 1998, Pages 97104
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Volume de Injeo x Mxima Resoluo
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Para evitar a saturao dos stios de interao da coluna, o que pode

causar uma piora na resoluo cromatogrfica , no se deve injetar um
volume
l
maior
i que 1% d
do volume
l
d
da coluna
l
vazia.
i
Clculo do volume mximo
dxL, onde d=dimetro em mm e L=comprimento da

coluna
l
em cm
Otimizao Cromatogrfica
Modos de eluio em Cromatografia Lquida
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
%B
Isocrtico
%B
Gradiente
Teq.
tempo
k = (tR tm)/tm
%B k
k tR
tR W e Int.
Teq.
tempo
k* = (20.F)/(Vm.%/min)
%/min k*
k* tR
tR W e Int.
Otimizao Cromatogrfica
M d Isocrtico
Modo
I
ti ou Gradiente?
G di t ?
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:

Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 mm
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN,
ACN 60
60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Amostra: < 50 uL; 50-100 mg
(0 5 - 1 mg/mL)
(0,5
Modo Isocrtico possvel
tr/tg < 0,25
0 25
1 < k < 10
Modo gradiente ser

necessrio
i se:
tr/tg < 0,40
tr/tg > 0,40
0,5 < k < 20
Onde tr = tr do ltimo pico - tr do primeiro pico

/tg = tempo total de gradiente exploratro
FASE REVERSA C-18 - AVALIAO DA AMOSTRA

GRADIENTE EXPLORATRIO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Modo Isocrtico possvel

tr/tg < 0,25
1 < k < 10
tr/tg < 0,40 0,5 < k < 20
Amostra muito retina, muito apolar

Usar THF ou fase reversa no
no-aquosa
aquosa (NARP).
(NARP)
Usar coluna menos lipoflica.
Modo gradiente ser necessrio

tr/tg > 0,40
Amostra muito polar.
cidos/Bases/Aucares
Controlar pH, fora inica.
on-par. Troca nica.
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 m

Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Detetor: DAD ou 254 nm
Amostra: < 50 L; 50-100
50 100 g
(0,5 - 1 mg/mL)
Amostra complexa

Amostra fcil modo isocrtico possvel

tR/tG = (24 19)/60 = 0,083 < 0,25
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 19 min.
i
tRu = 24 min.
i
Gradiente Exploratrio
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2 0 mL/min
2,0
mL/min.
Eluio isocrtica possvel

1 < k < 10
ku = 7 % ACN = 1,7.t
k
1 7 tRu
1 7 24 = 40,8
40 8 %
R = 1,7.24
ku = 20 % ACN = 1,7.t
k
1 7 tRu
30 8 %
R - 10 = 30,8
ACN/gua 40:60
ACN/gua 30:70
Resoluo satisfatria
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - I

tR/tG = (24 9,5)/60 = 0,24 < 0,25
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 9,5
9 5 min.
min
tRu = 24 min.
min
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2,0 mL/min.
El i iisocrtica
Eluio
ti possvel
l
1 < k < 10
ku = 7 % ACN = 1,7.tRu = 1,7.24 = 40,8 %
ku = 20 % ACN = 1,7.tRu - 10 = 30,8 %
ACN/gua 40:60
ACN/gua 30:70
Resoluo insatisfatria
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - II

Otimizao da FM
1
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1 Gradiente Exploratrio
ku= 7
ACN
ku= 20
8
ACN/gua 30:70
3
6
ACN/MeOH
ACN/gua 40:60
MeOH 4
10
ACN/MeOHgua
20:25:55
MeOHgua
50:50
ACN/MeOHgua
15:20:65
MeOHgua
40:60
ACN/MeOHgua
23:30:47
%MeOH = 1,22 + 1,37(%ACN) - 0,004(%ACN)2
J. Chromatogr. A, 721:15 1996.
Amostra mais difcil modo gradiente - I

tR/tG = (23 2)/60 = 0,35 < 0,40
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 2 min.
tRu = 23 min.
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2,0 mL/min.
Eluio isocrtica possvel

0,5 < k < 20
Modo gradiente
%IACN = 1,65.tRp 9 = 1,65.2 9 = -5,7 0%
%FACN = 1,65.tRp + 10,3 = 1,65.23 +10 = 48%
%ACN/min
/ i = 48/10 = 44,8
8 k* 20.F/(V
20 F/(Vm.%min)
% i ) 8,3
83
%ACN/min
/ i = 48/30 = 1,6
1 6 k* 20.F/(V
20 F/(Vm.%min)
% i ) 12,5
12 5
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30o C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60o C

Resoluo insatisfatria
Amostra mais difcil modo gradiente - II

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1 Gradiente Exploratrio
Ajustar % I e % F
k* = 5
5 %/min
35o C 2
65o C 4
10
k*= 17
1,6 %/min
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30o C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60o C
0 a 47 % de ACN, 10
2,0
, mL/min. - 60o C
0 a 47 % de ACN, 36
2 0 mL/min.
2,0
mL/min - 60o C
0 a 47 % de ACN, 72
2,0 mL/min. - 60o C
Col. 30 cm - 3,5 m

Gradiente - Otimizao
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
1
2.
3.
4.
5.
6
6.
Ajustar % Inicial
Aj
i i e % Final
i
de B
Otimizar k* (considerar tG)
Verificar influncia do solvente B
Avaliar influncia da temperatura
Ajustar configurao da coluna
O t
Outras
variveis
i i
Ajustar % Inicial e % Final de B
Mistura de Herbicidas: 9 fenilurias e 6

s-triazinas (J. Chromat. , 261:329 1983)
0-100% MeOH
50 min. (2%/min.)
40-100% MeOH
30 min. (2%/min.)
60-100% MeOH
20 min. (2%/min.)
50-100% MeOH
25 min. (2%/min.)
50-70% MeOH
10 min. (2%/min.)
50-80% MeOH
15 min. (2%/min.)

M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
2
2.
3.
4.
5.
6.

Oti i
Otimizar
k* ((considerar
id
tG )
Outras variveis
Col.: C18 - 10 m
30 x 0,42 cm
1 mL/min - t.a.
Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)

% ACN
100
% MeOH
100
10
% MeOH
20
% ACN
60 min.
tempo
0
60 min.
tempo
60 min.
tempo
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
2.
3.
4.
5.

Otimizar k* (considerar tG)
Aj t configurao
Ajustar
fi
d
da coluna:
l
comprimento, partcula, fluxo
Rs = 1,1
25 cm - 10 m
2 mL/min - 1040 psi
Rs = 1,3
25 cm - 10 m
1 mL/min - 520 psi
Rs = 1,5
50 cm - 10 m
2 mL/min - 2080 psi
Coluna C18 d.i. 0,46 cm

FM: 40 a 77% MeOH a 0,7%/min
Rs = 2
Mistura de Herbicidas:
9 fenilurias e 6 ss-triazinas
triazinas
(J. Chromat. , 261:329 1983)
25 cm - 5 m
1 mL/min - 2080 psi
BOMBASDEALTAPRESSO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
PermitemvenceraresistnciapassagemdaFMexercidapelaspartculasdaFE.
u o p p
p
Funo:proporcionarfluxoconstanteereprodutveldeFMatodoosistema.
CARACTERSTICASDESEJVEIS:
composiodaFMefluxoprecisoseexatos
vazocontnuaelivredepulsaes
respostarpidaaalteraesnofluxoecomposiodaFM gradientedeeluio!!
pressomxima:700atm(10.000psi)
maiorparteconstrudaemaoinox316;outrosmateriais:titnio,peek,teflon
inrciaqumicaasolventescomuns
manutenosimples
reservatriodesolventeilimitado
BOMBASDEALTAPRESSO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTE
BombasmaisutilizadasemCLAE
Vantagem:
Capacidadederepetiodosvolumesoufluxose,consequentemente,das
reasdospicos,mesmocommudanasnaviscosidadedaFMoubloqueioda
colunaporpartculas.
p p
BOMBASDEALTAPRESSO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBADOTIPOSERINGA
Collins;Braga;Bonato,2006
Lanas,2009
BOMBASDEALTAPRESSO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBA DO TIPO PISTO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
BOMBADOTIPOPISTORECIPROCANTEOUALTERNANTE
pistoconectadoaomotorpormeio
deengrenagense1EXCNTRICO
escoamvolumesconstantesdeformanocontnuaoupulsante
bombamaisempregadaemCLAEatualmente
bomba mais empregada em CLAE at almente
adequadaparapresseselevadas
reservatriodeFM:ilimitado
movimentosdopistonacmarageramPULSOS
aplicaes:CLAEanalticaepreparativa
Lanas,2009
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
INJETORES MANUAIS
INJETORESMANUAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
amostradeveseraplicadanacolunapressurizadanaformadeumabandaestreita
vlvuladeintroduodeamostramaiscomum:vlvulade6prticos(orifcios)
loop para escala analtica
aladeamostragemouloop:comprimentoedimetrointernodefinemseuvolume
(L))
(
loop para escala preparativa

(mL)
http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
INJETORESMANUAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
VISOESQUEMTICADOFUNCIONAMENTODAVLVULADE6PRTICOS
POSIODECARGA
LOAD
sada da amostra
entrada da amostra
ala de amostragem (loop)
2
3
coluna
entrada do eluente
2
6
5
POSIODEINJEO
INJECT
1/37
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Funo do detector: identificar a presena de substncias de

interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica.
cromatogrfica
Caracterstica desejveis:
- alta sensibilidade e baixo limite de deteco
- ampla faixa de linearidade
- confivel e reprodutvel
-fcil de operar e manter
-informao
informao qualitativa e quantitativa
-no destruio do soluto
-insensibilidade a mudanas na FM e de T
- resposta
t rpida
id e lilinear a alteraes
lt
d
das concentraes
t d
dos solutos
l t
-baixo nvel de rudo
CLASSIFICAO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
De acordo com as propriedades medidas:

Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de
propriedades do eluente (ex. constante dieltrica)
Detectores de propriedades do analito: medem propriedade fsica ou
qumica do analito (ex
(ex. fluorescncia)
De acordo com o tipo de resposta:
Detectores
etecto es se
sensveis
s e s co
concentrao:
ce t ao resposta
esposta p
proporcional
opo c o a
concentrao de um componente no eluente (ex. UV, fluorescncia).
Detectores sensveis ao fluxo de massa: resposta proporcional
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
por unidade de tempo (ex. eletroqumico, espalhamento de luz).
De acordo com a seletividade:
Detectores universais
Detectores seletivos
Detectores especficos
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORESBASEADOSNAABSORODELUZ
C O S S
OS
SO O
U
UV/VIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Faixas de utilizadas:
Ultravioleta: 190 - 400 nm
Visvel: 400 - 800 nm
Espectro eletromagntico
1/37
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1/37
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
LEI DE LAMBERT-BEER
Leitura = Unidade de Absorbncia (UA)

1 UA = Depreciao da luz incidente em 90 %
Comprimento de onda
mximo
S l
Solvente
t
mximo
pH
Temperatura
> Sensibilidade
DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODEONDAFIXO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODE
ONDAVARIVEL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Lmpadas: deutrio UV
tungstnio - visvel
DETECTORNOUV/VISCOMARRANJODE
/
FOTODIODOS(DAD)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
arranjo de diodos: srie de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal de

silcio de modo que cada difratado pela grade atinja um diodo.
a absorbncia de uma amostra pode ser determinada em todos os de modo
simultneo.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTOR -UV/VIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Qual o comprimento de onda ideal para a

anlise quantitativa ?
mAU
OH
500
OH
215 nm
223 nm
252 nm
300
100
250
300
350
nm
max = >
> sensibilidade
280 nm
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DetectorEletroqumico
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORES
Espectrmetrosdemassas(HPLCMS/MS)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Comparaodarespostadealgunsdetectores
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
TAMPES EM CLAE
Tampo
pKa
Faixa
UV limite
cido Trifuoractico (TFA)

H3PO4/KH2PO4 ou K2HPO4
>> 2
1,5-2,5
210 nm (0,1%)
2,1
7,2
12,3
< 3,1
6,2-8,2
11,3-13,3
< 200 nm (0,1 %)
cido ctrico/K3 citrato
3,1
4,7
5,4
2,1-6,4
230 nm (10 mM)
cido frmico/Formiato de K
cido actico/Acetato de K
KHCO3 ou K2CO3/cido actico
3,8
2,8-4,8
210 nm (10 mM)
4,8
3,8-5,8
210 nm (10 mM)
6,4
6
4
10,3
5,4-7,4
5
474
9,3-11,3
< 200 nm (10 mM)
Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano
6,8
9,0
5,8-7,8
8,0-10,0
215 nm (10 mM)

225 nm (10 mM)
Tris.HCl/Tris
NH4Cl/NH3
1-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina
Et3N.HCl/Et
N HCl/Et3N
8,3
7,3-9,3
205 nm (10 mM)
9,2
8,2-10,2
200 nm (10 mM)
10,1
9,1-11,1
215 nm (10 mM)
11 0
11,0
10 0-12 0
10,0-12,0
< 200 nm (10 mM)
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Gradiente otimizado
T
Tempo
(min)
( i )
% H2O
%M
MeOH
OH
70
30
15
35
65
17
100
20
70
30
25
70
30
Tempo de equilbrio de 8 min
Tempo de equilbrio de 3 min
Fique atento ao tempo

de equilbrio da sua coluna
cido cetico 0,1 % foi usado como
supressor inico
O que voc
no
deve
d
fazer
f
em HPLC
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Agradecimentos
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Ao Conselho Regional
g
de Qumica - CRQ-IV
Aos Participantes do Curso
Contato
Guilherme Julio Zocolo
E-mail: gjzocolo1@gmail.com
Quaisquer dvidas estarei sempre a
disposio
Minicursos CRQIV Princpios da HPLC

Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Dinmica 1
1. O entendimento do processo cromatogrfico e dos fatores de reteno (k), seletividade () e
eficincia (N) fundamental para o desenvolvimento racional de um mtodo cromatogrfico.
Assim sendo, explicar objetivamente:
a) O que fora de eluio e qual a sua influncia na distribuio de cada componente
de uma mistura de substncias orgnicas entre as fases estacionria (FE) e mvel
(FM);
b) O que seletividade cromatogrfica? Cite exemplos de solventes e adsorventes com

seletividades diferentes.
c) O que eficincia cromatogrfica?
2. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos modos de eluio isocrtico e gradiente?
3. Para avaliar a qualidade de uma coluna de CLAE, quais parmetros (cite pelo menos trs)
devem ser freqentemente monitorados e o que eles podem indicar?
Apoio Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQIV Princpios da HPLC

Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Dinmica 2
1. a. Qual a caracterstica mais importante de um detetor em sistema de cromatografia

lquida? Por que? Quais detetores satisfazem essa caracterstica?
b. Considerando sensibilidade e seletividade, que detetores seriam mais indicados

para analise quantitativa em CLAE das misturas abaixo:
I.
lcoois e aminas saturados industria de alimentos.
II. Antioxidantes polifenlicos presente em medicamentos fitoterpicos.
III. Hidrocarbonetos policclicos aromticos presentes na fuligem resultante

da queima da cana-de-acar amostra ambiental concentraes
na ordem de ng mL-1 (ppb)
Apoio Caixa Econmica Federal

Apresentaçãp Cromatografia Liquida

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Apresentaçãp Cromatografia Liquida

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

CONSELHO REGIONAL DE

QUMICA - IV REGIO (SP)

Princpios e Aplicaes da Cromatografia

Araraquara, 15 de setembro de 2012

Princpios e Aplicaes da Cromatografia

Dr. Guilherme Julio Zocolo

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Mikhael Semenovich Tswett (1906)

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

das Tcnicas Cromatogrficas

Martin e James CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Mecanismo de separao cromatogrfica

A separao cromatogrfica obtida a partir de interaes diferenciadas

CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar.

Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

FASE NORMAL: fase estacionria polar

Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

FASE NORMAL: fase estacionria polar

FASE NORMAL: fase estacionria polar

Eluem primeiro as substncias

Mecanismo de separao cromatogrfica

Caractersticas das FASES NORMAIS

1. Amostras inicas so de difcil separao

2. Colunas estveis quando se utiliza

2. Controle da fora de eluio menos

3. Uma grande variedade de substncias

5. til para amostras que possam se

5. Alto custo dos solventes orgnicos

Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Fases mveis em Fase Normal

Reteno aumenta com aumento da polaridade dos solutos.

cido actico ou frmico para cidos.

EFEITOS DA FASE MVEL EM FASE NORMAL

Solvente fraco (A): no-polar

Solvente forte (B): polar

Seletividade () fortemente influenciada pela proporo do

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Efeitos da variao de solvente POLAR na separao

Desenvolvimento de mtodo em FASE NORMAL

A. Coluna Ciano (solvente A:

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Fase ligada amino (NH2)

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Fase ligada amino (NH2)

Amostra de suco de frutas:

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Mecanismo de Interao em Fase Reversa

Modo de HPLC mais utilizado (~80%): compostos no inicos,

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Cromatografia de Fase Reversa (FR)*

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Cromatografia de Fase Reversa (FR)

ODS, RP-18, C-18