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Testes Bioqumicos e Quantificao

Relatrio de Microbiologia

Componentes do grupo: Giuseppina Provenzano, Juliana Marinho, Letcia Ado, Stephanie


Medeiros e Victria Brbara.
Turma; QM 171
Professores: Brbara e Eliezer.
I) Introduo

A identificao e quantificao dos micro-organismos em determinado material de extrema


importncia, principalmente para a sade pblica. Os micro-organismos patognicos so
responsveis por diversas doenas, e, portanto, tal controle de qualidade deve ser usado para
impedir a propagao das mesmas para humanos e animais, atravs de alimentos, remdios etc,
alm de plantas.
O primeiro mtodo usado para identificao de micro-organismos a microscopia
eletrnica. Com isso, identifica-se a morfologia e fisiologia dos mesmos e selecionam-se testes
especficos para as possveis espcies, atravs de cultivos em determinados meios contendo
nutrientes previamente definidos. A partir destes testes possvel definir caractersticas metablicas,
e, consequentemente, fazer a identificao da espcie.
Com relao quantificao, os mtodos se dividem em duas classes: os que quantificam o
nmero total de clulas, ou seja, as mortas e vivas, e os que quantificam o nmero de clulas
viveis, ou seja, s as vivas. A microscopia tambm usada para quantificar os micro-organismos.
um mtodo de contagem do nmero de clulas totais, a no ser que seja utilizada uma tcnica de
colorao especial. Porm, para quantificar, a microscopia pode no ser confivel.
Para realizar os testes quantitativos, a amostra a ser contada deve ser diluda quase sempre,
pois, contam-se colnias, e, portanto, esse nmero no pode ser muito elevado nem muito baixo,
entre 30 a 300 colnias. Faz-se, ento, diluies seriadas da amostra, tendo cautela para se obter o
nmero de colnias apropriadas. Alguns mtodos no se utilizam da formao de colnias para
fazer a quantificao, mas sim uma relao mssica.
II) Objetivos
Inoculao de bactrias na placa de petri para fins de quantificao e realizao de testes
bioqumicos, comparando os resultados com os dados de literatura.
III) Materiais e Mtodos
Materiais
-

Ala bacteriolgica
Ala de drigaslki
Bquer com lcool 70%
5 placas de petri com gar
5 placas de petri sem meio
6 tubos pequenos vazios
Tubo com cultura da bactria Escherichia coli
Tubo com cultura da bactria Pseudomonas
2 tubos pequenos com meio contendo vermelho de metila(MR)

2 tubos pequenos com meio especfico para teste de fermentao voges-

proskauer(VP)
- 2 tubos pequenos contendo gar SIM
- 2 tubos pequenos com gar lisina de ferro(LIA)
- 4 tubos pequenos com
meio OF para glicose, estando dois dentre estes com
leo mineral
- 2 tubos pequenos com meio OF para manitol, estando um com leo mineral
Mtodos
Testes Bioqumicos
-

Ensaio de MR e VP

Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurana microbiolgica.
Flambou-se a ala bacteriolgica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de
cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de MR, com o auxlio do dedo mnimo, e passou para este tubo
a cultura. O mesmo procedimento foi feito para os tubos VP, a tcnica foi aplicada para ambas as
culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.
-

Ensaio com tubo gar SIM

Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurana microbiolgica.
Flambou-se a ala bacteriolgica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de
cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de gar SIM, com o auxlio do dedo mnimo, e passou-se a
alada com a cultura at o fundo do tubo. A tcnica foi aplicada para ambas as culturas de
Escherichia coli e Pseudomonas.

Ensaio com tubo gar LIA

Ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurana microbiolgica. Flambou-se a
ala bacteriolgica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em
seguida, abriu-se o tubo de gar SIM, com o auxlio do dedo mnimo, e passou-se a ala com a
cultura por cima do meio slido, e posteriormente, colocou-se a mesma alada dentro do gar. A
tcnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.

Ensaio com meio OF glicose

Trabalhando-se dentro da zona de segurana microbiolgica, flambou-se a ala bacteriolgica,


esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo

de meio OF glicose, com o auxlio do dedo mnimo, e passou-se a alada com a cultura at o fundo
do tubo. A tcnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.
-

Ensaio com meio OF manitol

Trabalhando-se dentro da zona de segurana microbiolgica, flambou-se a ala bacteriolgica,


esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo
de meio OF manitol, com o auxlio do dedo mnimo, e passou-se a alada com a cultura at o fundo
do tubo. Este teste foi realizado somente para a bactria Pseudomonas.
Quantificao Microbiana
Para as tcnicas que se seguem foi realizada, previamente, uma diluio do meio de cultura da
bactria. Foram feitas seis diluies a partir da soluo me. Pegou-se 1 mL da soluo-me passou
para o tubo de diluio 10-1 , avolumando o mesmo, e posteriormente agitando o tubo.
Para a segunda diluio de 10-2, retirou-se 1 mL da diluio de 10-1, e passou-se para outro tubo
avolumando o mesmo. Este procedimento foi repetido, at chegar na diluio de 10-6.
-

Tcnica de Pour-Plate

Tomou-se 1 mL da diluio de 10 -4 e passou-se para uma placa de petri; em seguida, pegou-se


duas placas de petri e colocou-se 1 mL da diluio de 10 -5. Fez-se o mesmo procedimento, porm
agora usando a diluio de 10-6.
Posteriormente, colocou-se o meio recm preparado com gar por cima das diluies de cada
placa, dando uma leve balanada na mesma antes do gar se solidificar.

Tcnica de Spread Plate

Em uma placa de petri com gar, colocou-se 0,1 mL da diluio de 10 -4. Pegou-se uma ala de
drigalski, que estava mergulhada em um bquer com lcool 70%, passou a mesma trs vezes no
fogo e espalhou o lquido por sobre o gar. O procedimento foi repetido, tomando 0,1 mL das
diluies de 10-5 e 10-6 e colocando em quatro placas com gar, sendo duas para cada diluio.
IV) Resultados e Discusso
Resultados: Quantificao Bacteriana
4.1) Resultados: Testes Bioqumicos
Meio

Bactria

Escherichia coli
MP - A parte superior do meio
MR VP

se tornou vermelho
VP - A parte superior do meio
se tornou preta

SIM

O meio tornou-se vermelho na


parte superior e ficou turvo

LIA

O meio tornou-se roxo

Pseudomonas
MP - No houve alteraes
VP - A parte superior do meio
se tornou preta

No houve alteraes
O meio tornou-se roxo

Com leo - O meio tornou-se Com leo - O meio tornou-se


Meio OF Glicose

laranja - amarelado

laranja - amarelado

Sem leo - O meio tornou-se Sem leo - O meio tornou-se


laranja - - amarelado

laranja - - amarelado
Com leo - O meio tornou-se

Meio OF Manitol

laranja
Sem leo - O meio tornou-se
laranja - - amarelado

4.1.1) Vermelho de Metila e Voges-Proskauer (MR VP)


Este teste avalia a via fermentativa realizada pela bactria e contm os testes vermelho de
metila e Voges-Proskauer.
O teste vermelho de metila um teste qualitativo para identificar se a bactria produz
cidos fortes (cido actico, frmico e ltico) a partir da glicose atravs da via de fermentao de
cido mista. Como produzido um cido, isso far que o pH do meio se torne cido. O vermelho de
metila, possui colorao vermelha em pH abaixo de 4,4 e colorao amarela em pH acima de 6,2.
Os meios em que foram inoculadas as bactrias possuam a colorao amarelo claro (figura
1) Portanto, o resultado positivo se houver a alterao da colorao do meio para vermelho e, a
permanncia da colorao, negativo.

Figura 1. Meio MR

Figura 2. MR Pseudomonas Figura 3. MR E. coli

Dessa forma a E. coli obteve um resultado positivo para o teste pois houve a mudana da
cor do meio para o vermelho(figura 3). Assim, a glicose inicialmente foi convertida a cido
pirvico e este sofreu uma fermentao cida mista, havendo assim a formao de cido. Desta
forma, o pH do meio diminuiu e houve a alterao da cor do indicador para o vermelho. J para a
Pseudomonas, o resultado foi negativo, uma vez que no houve a alterao da colorao(figura 2)
J o teste de Voges Proskauer diferencia os micro-organismos que realizam a fermentao
pela via butilenogliclica da glicose. Nesse teste, quando o cido pirvico passar pela fermentao
pela via butilenogliclica haver a formao de acetona (acetilmetilcarbinol).
Para revelar o resultado do teste, primeiramente, h a adio de KOH. Pois a acetona
oxidada a diacetil, pelo oxignio atmosfrico em ambiente constitudo basicamente por hidrxido
de potssio. Em seguida, h a adio de -naftol, e com isso o diacetil ser convertido h um
complexo vermelho. Dessa forma, o resultado positivo quando houver alterao da colorao do
meio para vermelho(figura 4).

Figura 4. meio VP

Figura 5. VP E. coli

Figura 6. VP Pseudomonas

Com a anlise dos resultados, poderia-se concluir que para ambas as bactrias o resultado
foi negativo, uma vez que no houve a formao da colorao vermelha, a colorao gerada
resultado da mistura dos reagentes utilizados(figuras 5 e 6).
Porm o resultado do teste inconclusivo uma vez que no se h certeza de que os reagentes
estavam em condies adequadas para o uso. Mas na literatura dito que ambas bactricas possuem
resultados negativos, como foi obtido no teste. Porm se a bactria analisada possusse resultado
positivo, poderia se obter atravs do teste um resultado errneo devido condio do reagente.
4.1.2) Meio SIM
O Meio SIM um teste bioqumico com base na motilidade dos micro-organismos e
produo de sulfeto e indol.
A produo de sulfeto permite verificar se a bactria capaz de degradar tiossulfato devido
possuir a enzima tiossulfato redutase. Nesta reduo dos compostos de enxofre, haver a formao
de cido sulfdrico, que incolor, porm este reagir com o indicador que o ferro, formando um
precipitado preto, devido produo de sulfato ferroso. Como pode se observar nas reaes abaixo:

Desta forma, o resultado positivo para a produo de sulfeto o aparecimento de precipitado


preto no meio. Assim, ambas bactrias analisadas possuem resultado negativo, uma vez que em
ambos os teste no houve a formao de precipitado(figuras 8 e 9).
O meio SIM tambm permite verificar se h produo de indol. A produo de indol ser
decorrente da ao da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio, que pode ser
observado na reao abaixo:

Para ser identificada a produo de indol adicionado o reagente de Kovacs, e o resultado


positivo ser o aparecimento de uma colorao avermelhada.
Assim, a E. Coli possui resultado positivo (figura 8), uma vez que, o meio se tornou vermelho, o
que no ocorre com a Pseudomonas que teve o resultado para o teste negativo (figura 9).
A motilidade observada atravs do aspecto do meio, em que verifica se a bactria cresceu
apenas no local em que foi inoculada ou por todo o meio. Esse teste verificado atravs da turbidez
do meio. A E. coli apresentou o meio turvo e a bactria foi capaz de crescer por todo o meio,
possuindo portanto motilidade. J a Pseudomonas teve resultado negativo, pois houve o
crescimento apenas no local aonde foi inoculada.

Figura 7. gar SIM


4.1.3) LIA (Lysine Iron Agar)

Figura 8. E. coli Figura 9. Pseudomonas

O meio LIA permite verificar se a bactria possui a lisina descarboxilase (LDC). Esta enzima
atua descarboxilando a lisina presente nos aminocidos. O meio contm o indicador prpura de
bromocresol que apresenta colorao amarela em pH abaixo de 5,2 e roxo em pH acima de 6,8.
O meio inicialmente apresenta a colorao amarela, isso ocorre pois o meio contm glicose e com
isso h a fermentao da glicose e consequentemente a produo de cido. Isso far com que o pH
diminua e o meio apresente a colorao amarela.
Para a ao da enzima lisina descarboxilase necessrio que o meio esteja cido, e isso obtido
pela fermentao da glicose. As bactrias que possuem a enzima descarboxilam a lisina com a
formao de amina (cadaverina) que tornar o meio bsico como se pode observar pelo esquema
abaixo:

Como o meio se tornar basico, haver a viragem do indicador e o meio apresentar a colorao
roxa. Portanto, o resultado ser positivo quando o meio apresentar a colorao roxa e negativo
quando este possuir a colorao amarela.

Figura 10. gar LIA

Figura 11. E. coli Figura 12. Pseudomonas

Dessa forma pde-se observar que ambas as bactrias testadas conseguem descarboxilar a lisina, ou
seja, resultado negativo, pois ambas possuam o meio com colorao roxa.
4.1.4) OF Glicose

O teste de fermentao de glicose tem por objetivo fazer a diferenciao bioqumica de


baseada na metabolizao de carboidratos por via oxidativa ou fermentativa em sistema fechado
(com leo, figura 14).
No tubo contendo E.coli (figura 15 e 16) a cor amarela do meio indica a mudana de pH do
meio de neutro (verde) para cido (amarelo). A mudana no meio indica a formao de cido
proveniente da degradao da glicose. A E.coli degradou a glicose tanto no tubo aberto quanto no
tubo selado com leo impedindo a entrada de ar (figura 15 e 16). A partir destes resultados concluise que a E.coli anaerbia facultativa, pois seu metabolismo funciona em ambientes com ou sem
oxignio.
No tubo contendo a bactria Pseudomonas observou-se o mesmo resultado, indicando que
esta tambm possui um metabolismo anaerbio facultativo (figura 15 e 16).

Figura 13. meio OF

Figura 14. OF com leo

Figura 15. OF E. coli Figura 16. OF com leo


e Pseudomonas
respectivamente

E. coli e Pseudomonas
respectivamente

4.1.4) OF Manitol
O meio OF contendo manitol, tem por objetivo observar a capacidade de uma determinada
bactria degradar este carboidrato tanto em ambiente aerbio quanto anaerbio (figuras 17 e 18).

A Pseudomonas apresentou capacidade de degradar este carboidrato tanto no tubo aberto


quanto no tubo selado com leo, indicado pela cor amarela do meio indicando formao de cido
(figura 19). Este resultado indica que a mesma anaerbia facultativa.

Figura 17. OF manitol

Figura 18. OF Manitol com leo

Figura 19. Pseudomonas

4.2) Quantificao
A tcnica de quantificao visa efetuar a contagem total de bactrias numa amostra. Para isto
so feitas diluies em srie da amostra a ser inoculada no meio. No mtodo Pour-Plate uma
alquota de 1ml da amostra com os microrganismos adicionada uma Placa de Petri sem, o meio
de cultura, que ser posteriormente por cima dos microrganismos na placa. Este mtodo favorece o
crescimento de bactrias anaerbias. J na tcnica Spread-Plate uma alquota da amostra
contendo os microrganismos adicionada ao meio de cultura e espalhada com o auxlio de uma ala
de Drigalski.
No mtodo Pour-Plate realizado no foi possvel quantificar o nmero de clulas
microbianas, uma vez que o estas cresceram muito prximas e aglomeradas, sendo portanto
considerado <300.
No mtodo Spread-Plate tambm no foi possvel quantificar o nmero de clulas
microbianas, pelo mesmo motivo citado acima. Portanto, o nmero considerado foi <300.
V) Concluso
No foi possvel obter colnias isoladas em nenhum dos mtodos aplicados e em nenhuma
das diluies efetuadas, sendo assim necessrio mais cuidado em relao a inoculao das placas,
evitando carregar e espalhar excesso de material microbiolgico nesta.

Em relao aos testes bioqumicos, muito importante correlacionar os dados experimentais


com os dados catalogados, para identificar se o microorganismo em questo. Todavia, alguns erros
podem ocorrer, uma vez que nem sempre os dados toricos e experimentais vo coincidir. Caso isso
ocorra, deve-se averiguar a procedncia dos reagentes e dos demais materiais e refazendo o teste
para tomar alguma concluso.
VI) Bibliografia
ANVISA. Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos.
Disponvel em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf>.
Acesso em: 27 mar. 2015.
KASVI. Instrues de uso: Caldo MR-VP.
Disponvel em: <http://www.kasvi.com.br/pdf/80429e18829d7472bbd18262ff38a228_arquivo.pdf>
Acesso em: 04 abril 2015
ANVISA. Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica. Disponvel em:
<http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/1d5166804e2574a3b08db3c09d49251b/6+
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BECTON DICKINSON.Voges Proskauer Reagent Droppers.
Disponvel em: <https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/L001126(0306)_PT.pdf>
Acesso em: 04 abril 2015
KASVI. Instrues de uso: Meio SIM. Disponvel em:
<http://www.kasvi.com.br/pdf/ff9093c3823fb783c4fb4626431dd964_arquivo.pdf> Acesso em: 04
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LABOR. Agar Lisina Ferro (LIA). Disponvel em: <http://www.splabor.com.br/meios-decultura/meios-para-testes-bioquimicos/agar-lisina-ferro-lia-modelo-m377.html> Acesso em: 04
abril 2015

Microbiologia: Atividades Prticas. Disponvel em:


<http://www3.fsa.br/localuser/Biologia/arquivos%20pdf/micro%20-%202006%20-%20pr
%C3%A1tica.pdf> Acesso em: 04 abril 2015