3/19/2013

Metode Isolasi Mikroorganisme Laut

Elin Julianti, Ph.D

Sekolah Farmasi ITB

Pendahuluan
70% permukaan bumi adalah laut
Makroorganisme laut : Alga, sponges,tunicates, coral dll.
Mikroorganisme Laut
Bakteri, Aktinomicetes dan Jamur
metabolit sekunder secara struktur unik dan bioaktif
Sumber pencarian obat baru

3/19/2013

Contoh Makroorganisme Laut

http://oceanexplorer.noaa.gov/explorations/04etta/logs/aug25/media/sargassum.html
http://www.oceanlight.com/lightbox.php?x=sponges__marine_invertebrate__animal
http://en.wikipedia.org/wiki/Tunicate
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Brain_coral.jpg

Contoh Mikroorganisme Laut

Kwon H. C., et al. J. Nat. Prod. 2010, 73, 2047-2052

Park, H. B., et al. Org. ett. 2012, 14, 5002-5005
Asolkar, R. N., et al. J. Nat. Prod. 2009, 72, 396-402
Zheng, J. et al. Org. Lett. 2009, 22, 5262-5265

3/19/2013

Contoh Struktur dan aktivitas biologi dari mikroorganisme laut

Bhatnagar, I.; Kim, S. K., Mar. Drugs 2010, 8, 2673-2701

Bhatnagar, I.; Kim, S. K., Mar. Drugs 2010, 8, 2673-2701

3/19/2013

Bhatnagar, I.; Kim, S. K., Mar. Drugs 2010, 8, 2673-2701

Bhatnagar, I.; Kim, S. K., Mar. Drugs 2010, 8, 2673-2701

3/19/2013

Status klinis senyawa dari mikroorganisme laut

Phase II clinical trials, anticancer

NPI -2358
Phase II clinical trials, anticancer

Phase III clinical trials, anticancer

Bhatnagar, I.; Kim, S. K., Mar. Drugs 2010, 8, 2673-2701

Metode Isolasi
Sumber : Sedimen Laut
1. Dry/stamp
Sedimen di keringkan di laminar air flow
Setelah kering, di haluskan menggunakan mortar-pestel yg steril
Sumbat busa steril ditekankan pada sedimen yg sudah dihaluskan,
kemudian secara berulang di tempelkan pada media agarsearah jarum jam
menghasilkan suatu seri pengenceran.
2 Dry/dilute
Sedimen yg telah dikeringkan (0.5 g) diencerkan dengan 5 mL air
laut steril
Di aduk menggunakan vortex, kemudian biarkan beberapa menit
Bagian supernatan di ambil 50 uL, kemudian di inokulasikan ke media
agar (spread method)

3/19/2013

3. Dilute/heat
Sedimen yg telah dikeringkan diencerkan air laut steril (1:3 atau 1:6)
dipanaskan pada suhu 55 oC selama 6 menit
50-75 ul suspensi diinokulasikan ke dalam media agar
4. Freeze/dilute
Sedimen basah dibekukan pada suhu -20oC
dicairkan, kemudian diencerkan dengan air laut steril
diinokulasikan ke dalam media agar

Media
DDM-1

Mannitol 2 g, kelp meal 2 g, fish meal 2 g, peptone 1 g, yeast

extract 1 g, starch 2 g, agar 16 g, artificial seawater 1 L.

YPMBFe

Yeast extract 2 g, peptone 2 g, mannitol 4 g, KBR 5 mL/L of

20 g/L in purified H2O, FePO4 5 mL/L of 8 g/L in purified H2O,
agar 16 g, artificial seawater 1 L.

YPM

Yeast extract 2 g, peptone 2 g, mannitol 4 g, crab meal 2 g,

agar 16 g, artificial seawater 1 L.

YPM2

Yeast extract 2 g, peptone 2 g, mannitol 4 g, crab meal 2 g,

YPG

Yeast extract 5 g, peptone 5 g, glucose 10 g, agar 16 g,

MB 2216

calcium carbonate 1 g, agar 16 g, artificial seawater 1 L

artificial seawater 1 L.
Marine broth 2216 37.4 g, glycerol 20 g, agar 16 g, purified
H2O 1 L.
Isolasi jamur : kedalam media ditambahkan inhibitor bakteri
(cth : natrium penisilin G, sterptomycin sulfat
Isolasi bakteri/aktinomicetes : ditambahkan inhibitor jamur ( cth : Amfoterisin, nistatin)

3/19/2013

Sumber : makroorganisme laut

Potong sampel ukuran sekitar 1 cm x 1 cm, cuci dengan air steril (3 kali)
Masukkan sampel ke dalam etanol 70% (60-120 detik) untuk sterilisasi
permukaan
Keringkan potongan sampel dengan kain steril atau di cuci dengan air steril
untuk menghentikan proses sterilisasi dengan etanol
Goreskan potongan sampel tersebut pada permukaan media cawan petri
pertama, kemudian letakkan kembali sampel pada kain steril dan
potong menjadi bagian yg lebih kecil (negative control)
Letakkan segmen yg lebih kecil pada media cawan petri ke dua, dengan
bagian yg baru dipotong kontak langsung dengan media
Seal cawan petri dengan parafilm, beri label dan simpan pada suhu 20-25 oC
Jamur biasanya tumbuh pada bagian yg di potong setelah 2-14 hari.
Proses pemurnian dilakukan dengan mentransfer hifa ( jamur) atau koloni
(bakteri/aktinomicetes) yg tumbuh ke dalam media yg baru sampai diperoleh
strain yg murni.
Jensen, P. R.; Gontang, E.; Mafnas, C.; Mincer, T. J.; Fenical, W., Environ. Microbiol. 2005, 7, 1039-1048.
Kjer, J.; Debbab, A.; Aly, A. H.; Proksch, P., Nat. Protoc. 2010, 5, 479-490.