Strain Improvement

of Microorganisms
Marlia Singgih Wibowo

Definition of
Strain Improvement
In the field of agriculture : recovery of
plants characters
In the fileld of microbiology : improve the
microbes productivities or characteristics

Purposes of
Strain Improvement

Increase productivities
To change unused co-metabolites
To improve the use of carbon and
nitrogen sources
To improve morphology of cells to be a
better cells in order to separate the cells
and its products

General Process

Induction of genetic variation in some cell

population of chosen microorganism
Fermentation Process in lab scale for
some cells
Analysis (assay) to check the
productivity of mutated strain

How to optimize miicrobes

productivity?

Optimize environmental condition

Optimize nutrition of microorganism
Genetic Modification : Mutation,
recombination, gene cloning

Optimize environmental
condition
Modification of physical parameter
(temperature, agitation, etc)
Modification of chemical parameter
(pH, O2 conc, etc)
Modification of biological parameter
(co-culture, enzym, etc)

Optimize nutrition of
microorganism

Carbon source
Nitrogen source
Mineral source and other sources
Precursor
Enzyme

Screening in Industry
Stage
1

Process
a.Mutation of wild type
b.Culture on agar
c.Selection of colonies
d.Fermentation
e.Selection of good strain

Amount
a.8 different doses
c.25 of each dose
d.200 strains
e.40 strains

a.Re test of selected strain (5 a.40 x 5 = 200 strains

replication)
b.Selection of best strain
b.8 strain for primary
metabolites, 40 strains for
2nd metabolites
Next screening

MUTAGENESIS
Mutagenesis is a process of mutation in
strain improvement of microorganism. A
treatment to microorganism will cause an
improvement in their genotipic and
fenotipic performances
Mutation can be random or direct

Procedure of mutagenesis
Mutation by : physical, chemical or
combination of physical and chemical
method
Protoplast Fusion
Recombination
Gene Cloning

Physical Mutation
X-ray
Chromosomal mutation
UV Radiation (250 270 nm)
DNA absorps uv pada 260 nm
Point mutation
Dimerization of thymine
Photo-repair : gain improvement of some
abilities
Radioisotop

Stages in Physical mutation

Wild-type of microbes is suspended in medium

Counting number of cells in medium and
concentration of cells is determined for
mutation process
Radiation is conducted in dark area with
certain distance for certain duration.
Exposed colonies are inoculated in growth
medium for several days
Check the growth and select some colonies for
further process

Chemical Mutation
Base analog : substance that similar to purine or

pirimidine, so transition will occured , example :

5-bromouracyl : substitute C (cytosine) with T
(thymin)
2-aminopurine : substitute A (adenine) with G
(guanine)
De amine and alkylating agent : transition,
example:
Nitrite (NaNO2) can cause de-amined A and C so
replication of AT will change to GC, or viceversa
EMS (Etil metil Sulfonat), MNNG (Metil-nitro-nitrosoguanidine)

 Intercalation
Dye acridine (proflavine) inserted between
base pair, will cause a frame-shift and will
misread its genetic information

Mutation of Monascus purpureus

using EMS

Albino mutant of Monascus purpureus

stable after 5 generation

PROTOPLAST FUSION
Protoplast fusion is a general technic to
induce genetic recombination in some
prokariot and eukariotic microorganisms
Protoplast : whole cell without cell wall

 Fusion has some benefits to improve

productivity of industrial microorganisms, e.g.
Actinomycetes.
The Method is easy, no transduction phage
needed, plasmid or competention development,
the only things is how to get the stable protoplast
In protoplast fusion will produce hybrid cells

Method of Protoplast Fusion

Protoplast is prepared by removing the cell wall
using lytic enzyme in a osmotic solution.
With the help of PEG (polyetilenglicol) at certain
conc. (fusogenic agent), the fusion can be done
and hybrid cells will produced (diploid)
During this stage , genome (or chromosom)
from both cells will be fused and mixed . The
genetic recombination will occured

Protoplast Fusion for microorganism

For prokariot Bacilli and Streptomycetes ,
recombination will occur in a very high frequency
because its chromosomes is free in the
cytoplasm
For eukariot microorganism, protoplast fusion
should be followed by fusion of nucleus to
obtain the real recombination
The important step in protoplast fusion is
REGENERATION of the cells after fusion
Protoplast fusion mostly done for the same
species to obtain the best strain with high
productivity

Exampe of Protoplast Fusion :

Aspergillus terreus

Strain 1

Strain 2

Fusant after fusion

Genetic Engineering

Genetic Engineering
Rekayasa genetik adalah salah satu cara pembuatan
DNA baru, biasanya melalui rekombinasi DNA dari
organisme yang berbeda dan meproduksi banyak
kopi dari DNA rekombinan tersebut melalui proses
yang disebut KLONING
Kloning adalah suatu proses dimana suatu urutan
DNA tertentu disisipkan ke dalam suatu vektor
(berupa plasmid atau kromosom faga) dan
selanjutnya direplikasi sebanyak mungkin. Replikasi
terjadi di dalam suatu inang (host) yang
memungkinkan replikasi itu terjadi

Prinsip mutasi dengan

rekayasa genetik
Informasi genetik yang dituju, diisolasi dari
organisme donor dan dipotong menjadi bagian
tunggal menggunakan enzim restriksi
Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA
pembawa (vektor) dan selanjutnya bersama
vektor tersebut ditransfer ke dalam suatu sel
inang (host)
Sel inang akan bereplikasi dan mensekresi
metabolit yang sesuai dengan informasi genetik
yang ditransfer sebelumnya.

Syarat untuk vektor

Memiliki Selectable markers

(penanda selektif)
Memiliki Restriction sites
(situs restriksi)
Berat molekul serendah mungkin

Plasmid
Plasmid adalah suatu molekul DNA sirkular
(BM 106 2 x 108) dari bakteri, yang
membawa 1-3% genom sel dan mengkode
suatu sifat genetik penting yang tidak dikode
secara normal oleh kromosom bakteri
tersebut
Sifat yang banyak digunakan : resistensi
antibiotik, produksi antibiotik, degradasi
senyawa aromatik, dll.

Faga (bakteriofaga)
suatu sub-kelompok virus yang menginfeksi
bakteri dengan cara menyisipkan asam
nukleat nya ke dalam bakteri host nya.
Faga terkecil hanya mengandung 3 gen
pengkode ss RNA
T4, suatu faga bakteri yang mengandung lebih
kurang 60 gen pengkode ds genom DNA faga
tersebut

Cosmid
Cosmid adalah partikel sintetik yang dapat bereplikasi
sendiri
Berasal dari plasmid yang mengandung fragmen
lambda-DNA (DNA-) yang mengkode urutan cos site
(situs pengenalan) untuk sistem yang akan
membentuk struktur sirkular.
DNA faga ini bereplikasi melalui suatu mekanisme
khusus yaitu rolling circle yang yang selanjutnya
membentuk struktur concatemer (berulang secara linear)
setelah disisipkan DNA asing.
Bentuk linear ini merupakan substrat untuk reaksi
packaging secara in-vitro membentuk partikel.
Selanjutnya partikel tersebut digunakan untuk
menginfeksi sel inang, dan bentuk linear cosmid akan
membentuk sirkular kembali pada sisi cos site

Prinsip kloning gen menggunakan

plasmid E.coli pBR 322
Plasmid yang mengandung gen resistensi
thp ampisilin dan tetrasiklin dipotong pada
sisi tetrasiklin dengan enzim restriksi
DNA asing di sisipkan pada plasmid dengan
enzim ligase
Plasmid yang telah mengandung DNA
asing tsb ditransfer ke dalam sel bakteri

Pembiakan

Seleksi sel yang hanya

mengandung gen
resistensi ampisilin
dan DNA asing

Jenis Mutan

Mutan Aukosotrof (Auxotrophic mutan)

Mutan Resisten (Resistant)
Mutan yang sensitif terhadap temperatur
Mutan Konstitutif katabolik
Mutan Konstitutif anabolik

 Mutan aukosotrof adalah mutan yang tidak dapat

mensintesis suatu molekul organik yang sebenarnya
sangat diperlukan untuk salah satu jalur biosintesis
metabolit nya. Misalnya : nitrat, antibiotik

Mutan resisten adalah mutan dari organisme yang

sebelumnya sensitif terhadap suatu senyawa

Mutan yang sensitif terhadap temperatur

adalah mutan dari oraganisme yang semula tidak sensitif

terhadap temperatur

Mutan yang memiliki enzim konstitutif

katabolik : antiinduksi, limiting factor, dll.
Mutan yang memiliki enzim konstitutif
anabolik : antimetabolit