Implementación de La Técnica de ELISA para La Detección de Virus y Otros Patógenos en Plantas en Venezuela

5/9/2015
ImplementacindelatcnicadeELISAparaladeteccindevirusyotrospatgenosenplantasenVenezuela
RevistaDigitaldelCentroNacionaldeInvestigacionesAgropecuariasdeVenezuela
CENIAPHOY
Nmero10eneroabril2006
ImplementacindelatcnicadeELISAparaladeteccindevirusyotros
patgenosenplantasenVenezuela
EzequielRangel,AlexandraSchmidtyFernandoCenteno
INIACENIAP
UnidaddeProteccinVegetal
SUMARIO
Introduccin
Importancia
AplicacindelatcnicadeELISAenalgunosrubrosagrcolas
Enelcontroldecalidadfitosanitariadelasemilla
Comoinstrumentoparaelmanejointegradodelcultivo
Fundamentosyutilidadprcticadelarespuestainmuneparaeldiagnstico
AnticuerposusadosenELISA
Inmunoensayosmsusadosactualmenteenladeteccindepatgenosenplantas
FactoresqueafectanlosresultadosenELISA
ProtocoloparaladeteccindelCTVconanticuerposmonoclonalesusandoensayo
DASIELISA
Sensibilizacindelaplaca
Adicindelasmuestras
Adicindelprimerconjugadooanticuerpossecundarios
Adicindelsegundoconjugado
Adicindelsustratodelaenzima
Lecturadelaplaca
Establecimientodelpuntodecorte
Consideracionesfinalesytendenciasfuturas
Bibliografaconsultada
Întroduccin
El uso de tcnicas de deteccin y/o diagnstico inmunoenzimticas como la prueba de
ELISA (del ingls: EnzymeLinked ImmunoSorbent Assays), tiene en Venezuela un
restringido mbito de difusin y aplicacin entre los productores agrcolas y
agrotcnicos (particularmente en el sector vegetal). Aunque esta tecnologa fue
desarrollada en la dcada de los setenta, sigue teniendo vigencia y aplicacin para el
diagnsticorpidoymasivodeenfermedadesenhumanos,animalesyplantasentodo
elmundo.
http://sian.inia.gob.ve/repositorio/revistas_tec/ceniaphoy/articulos/n10/arti/rangel_e/arti/rangel_e.htm
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Este trabajo no pretende ser una revisin exhaustiva sobre el tema y se limita a la
difusin de las bondades de la tcnica y su aplicacin en rubros como frutales y
hortalizas, donde la factibilidad de su aplicacin es elevada a corto plazo. Se
recomienda su abordaje, de manera progresiva y peridica, a travs de publicaciones
divulgativasrelacionadas.
Los objetivos de este artculo son: a) divulgar las ventajas del uso de la tcnica de
ELISA en el diagnstico de enfermedades virales en cultivos y promover su
incorporacin rutinaria en la planificacin y ejecucin de la actividad agrcola vegetal
en Venezuela b) esbozar las bases conceptuales de la tcnica de ELISA y sus
aspectos prcticos, para familiarizar a los usuarios potenciales de su empleo
(productores, empresas productoras e importadoras de semillas, asesores tcnicos,
pasantes, estudiantes) en la deteccin de enfermedades en semillas, esquejes y
plantas, como medio para mejorar el control de calidad del material de siembra y el
manejointegradodelcultivo.
Împortancia
La evolucin e introduccin de variantes de la tcnica de ELISA, as como la
disminucin progresiva de sus costos unitarios, le han convertido en una valiosa
herramienta para la deteccin y/o diagnostico de enfermedades en plantas. Su
aplicacin en puntos clave del sistema de produccin, en pases con una agricultura
ms tecnificada que la nuestra, ha permitido la elaboracin de estrategias de manejo
integrado de enfermedades, mejorando la calidad y sanidad de los cultivos as como
sucompetitividadyrentabilidad.
La aplicacin prctica de ELISA es relativamente fcil, pero la escasa informacin
disponibleenelpascreaunabrechatecnolgicaparalosdiferentes tipos de usuarios
potenciales, lo que restringe su adopcin en la planificacin y ejecucin del negocio
agrcola,porlasimplicacionesnegativasparalaproductividaddelsector.Asmismoel
hechodequelasenfermedades virales en plantas no inciden sobre la salud publica y
que la mayora de estas enfermedades ocasionan sntomas crnicos, sin eliminarlas
rpidamente, se ha extendido un razonamiento que minimiza su importancia
econmica.
EnVenezuela,latcnicadeELISAsehautilizadodesdehacemsde20aosen rubros
de inters alimentario como ctricos, y recientemente en cultivos como tomate y
pimentn, as como en cultivos ornamentales como orqudeas entre otros. Pero todos
los registros de su uso, estn asociados a la deteccin de enfermedades en proyectos
deinvestigacinporpartedepersonalespecializado,yconcontadasexcepcionespara
atender la demanda del sector productivo. Excepcin de esto fue, a mediados de la
dcadadelosochenta,elusodeELISAparaladeteccindelvirusdelatristezadelos
ctricos en la principal zona citrcola del pas, en un esfuerzo en el que participaron
muchasinstitucionesoficialesalserviciodelaagriculturaylainvestigacin.
ElInstitutoVenezolanodeInvestigacionesCientficas(IVIC)adelantunprograma para
la produccin de anticuerpos y estuches (kits) de ELISA para la deteccin en virus de
plantas, cuyos resultados estn reseados en diferentes publicaciones cientficas. En
el Instituto Nacional de Investigaciones Agrcola (INIA) se realizan esfuerzos para
promoverelusodeestayotrastcnicas,enbeneficiodelosproductoresagrcolas.
En el caso de las enfermedades de los animales, algunas de las cuales son de
denuncia obligatoria por el dao que causan a la pecuaria nacional y por su condicin
de afectar al humano (zoonosis) existen programas internacionales de vigilancia
epidemiolgica dirigidos a su control y/o erradicacin. Destacan entre ellas la
fiebre aftosa en bovinos, as como el monitoreo y estudio epidemiolgico del virus
causante del sndrome reproductivo y respiratorio porcino en cerdos (PRRS) y el
cleraporcino,endondeeldiagnsticoporELISAjuegaunrolimportante.
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De ocurrencia ms recientemente an, el estudio a escala mundial del virus de la

influenza o gripe aviar, el cual, por su fcil recombinacin con el virus de influenza
humana, que potencialmente podra causar una pandemia de gripe, tambin se apoya
enelusodetcnicasserolgicas,entrelascualesseencuentralatcnicadeELISA.
Es importante analizar el aspecto econmico y gerencia de costos, para entender que
elcontroldecalidadfitosanitariaprevioalasiembra,oeldiagnstico temprano en el
campo apoyado con el uso de ELISA y otras tcnicas, constituyen parte de las
estrategias de manejo integrado de enfermedades virales que pueden hacer la
diferenciaentreunaagriculturacompetitivaolaprdidadelacosecha.
ÂplicacindelatcnicadeELISAenalgunosrubrosagrcolas
Ênelcontroldecalidadfitosanitariadelasemilla
EjemplosprcticosyexitososdelaaplicacindelatcnicadeELISAparaelcontrolde
calidad(paraladeteccindevirus)enelmaterialdepropagacinvegetativo,se
evidencianenvariosprogramasdecertificacindectricosenEspaa,Italia,Sud
frica,BrasilyEE.UU.Enestospasesseanalizandecenasdemilesdemuestras
anualmenteparalaerradicacindevirusensusplantacionescitrcolas,yparala
produccincomercialdeplantaslibresdeestosyotrasenfermedadestransmisibles
porinjerto.
La enfermedad mas importante de la citricultura mundial durante el siglo XX, fue el
virusdelatristezadelosctricos(CTV),elcualdiezmdecenasdemillonesderboles
alrededordelmundoyenVenezuelaseestimaqueocasionlamuertedemasdeseis
millones de rboles en la dcada de los ochenta y primer lustro de los noventa. An
hoy, es una enfermedad que sigue ocasionando prdidas significativas en el mundo y
estincluidadentrodelgrupodeenfermedadesaserevaluadasperidicamenteenlos
programasdecertificacindelospasesantesmencionados.
LatcnicadeELISAtambinseusaenelcontroldecalidaddelaproduccinde semilla
depapaenlosgrandespasesproductores(CanadyHolanda)paraladeteccindelos
principales virus y bacterias, en las categoras de semilla gentica y bsica o de
fundacin, aunque tambin se ejerce el control de calidad por inspeccin visual por
partedepersonalaltamenteespecializado.
^Comoinstrumentoparaelmanejointegradodelcultivo
Laimportanciadelusodelatcnicaradicaensusensibilidad,quepermitedetectar la
presencia de patgenos importantes en especies o variedades de plantas que sean
tolerantes o resistentes, an cuando no muestren sntomas. Estas plantas tienen
especialimportanciaporquesonreservoriosyfuentesdeinculocuandosoncultivadas
cerca de especies susceptibles, favoreciendo la ocurrencia de epifitias que pueden
ocasionargrandesprdidaseconmicas.
Otros patgenos, como bacterias y hongos, causan diversas enfermedades y para su
control se usan productos qumicos o de origen biolgico que minimizan su dispersin
enelcampoyeventualmentelasplantasenfermaspuedenrecuperarse.
Esto no ocurre con los virus, ya que una vez que la planta es infectada, sta
permanece enferma de por vida. Adems, son parsitos intracelulares obligados, lo
cual dificulta la accin selectiva de algn compuesto antiviral que neutralice la
replicacindelvirussinafectarlaplanta.Enaquelloscasosdondesehandesarrollado
tales productos, stos resultan muy costosos y de limitada efectividad a escala
comercial.
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Algunasmanerasdeprotegerloscultivoscontralosvirusconsistenenusarsemillao
propgulos comprobadamente sanos, cultivares resistentes o tolerantes a
enfermedades, y/o con factores que limiten la alimentacin de plagas transmisoras o
vectoresdevirus.Tambinserecomiendaelusodeambientesqueprotejanal cultivo
delaexposicindirectaa los vectores, en umbrculos o invernaderos con plsticos o
mallasapruebadeinsectos.Suusoestaralimitadoarubroscuyoaltovaloragregado
compenseelelevadocostodeesteesquemadeproduccin.
En ambientes protegidos hay que ser especialmente cuidadosos, ya que tambin se
restringeelaccesodelosenemigosnaturalesdelosvectores,yencasodefallasenel
controldeaccesoorupturadelabarrerafsica,sepuededesatarunaepidemiadentro
del ambiente protegido, debido al crecimiento desmesurado del vector en ausencia
delcontrolador.
Como puede observarse, varias de las estrategias para producir cultivos de calidad,
son controlables en mayor o menor grado por el productor, o dependen de la oferta
tecnolgicaocomercialdelasmismas.Entodocaso,si se est cultivando variedades
susceptiblesavirusquetienenvectoreseficientesenlanaturalezaynosedisponede
ambientes controlados, la mejor defensa consiste en estar debidamente informado
acerca de la calidad del material de siembra y, si es o no resistente frente a
enfermedades, usar semilla certificada y/o plntulas provenientes de semilleros o
viverosconcontroldecalidadconfiable.
Serecomiendaevaluar,conciertafrecuenciayrepresentatividad,elcultivoen etapas
tempranas (antes de floracin) y si se observa la ocurrencia de sntomas tpicos tales
como mosaico, amarillamiento, encrespado o ampollamiento de hojas, enanismo,
clorosis o necrosis en una pequea proporcin de plantas, la tcnica de ELISA resulta
de utilidad prctica en el manejo del cultivo, ya que se puede realizar un diagnstico
temprano que permite tomar decisiones adecuadas en funcin de los resultados del
anlisis,almenorcostoposible,manteniendoelpotencialproductivoylarentabilidad
delaplantacin.
Esto es particularmente til, sobre todo si se sospecha de la relacin de los sntomas
con un mecanismo o agente transmisor eficiente, como el simple contacto con
herramientascontaminadasenelcasodevirusrelacionadosconelmosaicodeltabaco
(TMV) en solanceas, as como otros virus que son transmitidos por fidos y que
causanmosaicos,deformacionesfoliaresyreduccin del rendimiento (e.g., potyvirus,
cucumovirus), o el caso de moscas blancas que transmiten begomovirus que causan
grandes prdidas en solanceas y cucurbitceas. En este ltimo caso, se est
comenzandoatrabajar en algunos laboratorios del pas para el desarrollo de mtodos
molecularesdediagnstico.
Entre las medidas que se pueden aplicar como consecuencia de un anlisis oportuno,
seencuentraeldescartedelotesdesemillaodesemilleros,laerradicacindeplantas
enfermasylaaplicacinoportunadebiocidasenlosfocosdeinfeccin.
^ Fundamentosyutilidadprcticadelarespuestainmuneparaeldiagnstico
A continuacin se esbozan una serie de conceptos o trminos que ayudan a
entender las razones por las cuales es posible desarrollar las tcnicas
serolgicas (incluida ELISA), y darles uso prctico para la deteccin o
diagnsticodeenfermedades.
Elsistemainmunolgico,caractersticodeanimalessuperiores,esuncomplejo
mecanismo de defensa por medio del cual, stos se defienden de infecciones
causadaspordiferentesmicroorganismos.Lasreaccionesdedefensaocurrende
diversas formas, empleando numerosos mecanismos, y a los efectos del
desarrollo de varias tcnicas serolgicas, los aspectos claves son el
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reconocimientodelagenteinvasorcomouncuerpoextrao, y la produccin de
anticuerposespecficosparasueliminacinoneutralizacin.
Cualquier sustancia, molcula o microorganismo que entra en el torrente
sanguneodeunanimal,yqueescapazdeinducirenelorganismoinvadidouna
reaccindedefensaorespuestainmune,esconsideradocomounantgenoo
inmungeno. Esta respuesta puede ser variada, y uno de esos mecanismos
consiste en que, cuando el antgeno entra en el torrente sanguneo, es
procesado y reconocido por grupos de clulas guardianas conocidas como
glbulos blancos o linfocitos del tipo B y T, de cuya interaccin son
producidoslosanticuerposque reconocen el antgeno de manera especfica. El
sitio del antgeno que es reconocido por un anticuerpo es denominado
determinante antignico o eptope, pudiendo tener el antgeno ms de un
eptope.
Losanticuerpospoliclonalessonobtenidosdelsuerodeunanimalinoculadocon
un antgeno que presenta uno o varios sitios antignicos, y consisten en una
poblacindeanticuerposquereaccionanoreconocenmsdeuneptope.Segn
el tipo de antgeno y la tecnologa utilizada para la produccin de mtodos de
diagnstico, stos pueden ser considerados de mayor o menor especificidad.
Los anticuerpos policlonales obtenidos contra un antgeno purificado,
eventualmente pueden reaccionar contra componentes de la planta, debido a
que restos del antgeno contaminante permanecen en el extracto purificado.
Desdeelpuntodevistaprctico,estaesunareaccincruzadainespecfica.La
base molecular que explica la especificidad, radica en que es regulada por un
mecanismo simple: una clula reconoce un solo antgeno. En la naturaleza, un
individuo (e.g. mamfero) puede producir ms de 10 millones de anticuerpos
diferentes,cadaunofrenteaunantgenodistinto.
La misma base del mecanismo de especificidad permiti la obtencin de
anticuerpos monoclonales, producto de la creatividad humana y cuyo
fundamentoconsisteenfusionarunasolaclulacancerosa,mieloma(capazde
vivir indefinidamente en un medio de cultivo) con un linfocito B aislado (que
produce anticuerpos frente a un solo eptope, y es obtenido de ratones) para
formar un hibridoma: es decir, un hbrido celular que vive por siempre y que
adems,produceanticuerpos.
Con los anteriores conceptos en mente, podemos decir que los anticuerpos
policlonales no son ms que la suma o mezcla de muchos anticuerpos
monoclonales,cadaunoreaccionandofrenteauneptopedistinto.Debidoaque
losanticuerposmonoclonalessoncuidadosamenteseleccionadosenunproceso
de validacin y control de calidad, slo reaccionan contra un antgeno que es
bien conocido y, por lo tanto, son altamente especficos. Dependiendo de la
seleccindelanticuerpomonoclonal,estepuedeser,desdeelpuntodevistadel
espectrodedeteccin,especficoparadiferenciarrazasdeunmismopatgeno,
o genrico para identificar grupos de patgenos en un determinado nivel
taxonmico. Este criterio tambin es aplicable a los anticuerpos policlonales,
slo que en el caso de los anticuerpos monoclonales, la reaccin contra
componentesdelaplantaeseliminadatotalmente.
La especificidad del anticuerpo policlonal o monoclonal depende de la
distribucin del antgeno en la naturaleza, si est o no presente en individuos
pertenecientes a diferentes grupos taxonmicos, o si presenta variantes en su
estructura en diferentes organismos. As, aquellos ms o menos semejantes,
peronoidnticos,puedenserreconocidosenmayoromenorgradocomotales.
Estatambinpuedeconsiderarsecomounareaccincruzada, en cuyo caso no
seproduceunareaccinpositivafalsaoinespecfica,sinounareaccingenrica
que revela relaciones genticas entre el organismo detectado y el que sirvi
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comoantgenoparalaproduccindelosanticuerposqueseusanenelensayo
deELISA.Lascaractersticasanterioresproducenunavariadagamadeposibles
respuestas e interpretaciones, por lo cual estas tcnicas se deben usar con
criterio prctico y adecuado contexto, que les permita juzgar sus alcances y
limitaciones.
ÂnticuerposusadosenELISA
Los anticuerpos obtenidos para el desarrollo de mtodos de deteccin o
diagnstico son purificados a partir del suero antiantgeno (suero inmune o
antisuero). Los anticuerpos obtenidos con estos fines estn constituidos
completamenteporinmunoglobulinas G o IgG, debido a que son las molculas
especificasqueexhibenlasmejorespropiedadesparaelprocesamiento,esdecir
para marcarlas con molculas tales como biotina o enzimas para producir una
reaccin de inters en un inmunoensayo. El diagnstico de virus y otros
patgenos,deplantas,basadoenestosmtodospresentanumerosasvariantes
ypresentacionesdisponiblesanivelcomercial.
Inmunoensayosmsusadosactualmenteenladeteccinde
patgenosenplantas
Para el caso de que la tcnica utilice como soporte una fase slida (placa de
microtitulacin),enlacualseaadensecuencialmenteanticuerpos,lamuestray
otros reactivos, la reaccin final tiene como resultado un producto soluble que
permite la deteccin del antgeno a consecuencia del cambio de color del
sustratodegradadoporlaenzima.(ELISAclsica).
Cuandolatcnicaempleadautilizacomofaseslidaunamembranadenylono
nitrocelulosa, y la reaccin final que permite la deteccin del antgeno produce
unprecipitadoinsolubledecolorcaractersticosobrelamuestra(delacualseha
efectuado una impresin directa o colocado una gota de extracto), es
denominada entonces, inmunoimpresin o dotblot, aunque esencialmente es
un inmunoensayo del tipo ELISA, ya que los pasos a seguir son los mismos. El
cambio de color es indicativo de la presencia de virus en la muestra, y la
intensidad de color es proporcional a la concentracin de antgeno viral. Sin
embargo, hay ocasiones en que ocurren cambios en el color que apenas
permiten diferenciar los controles, o los mismos ocurren donde se supone no
debe ocurrir reaccin alguna. Esto es lo que se conoce como ruido de fondo,
sealinespecficaobackground.
Esta reaccin puede tener diferentes causas, en estos casos, an cuando la
prueba haya sido ejecutada correctamente, la apreciacin cualitativa o a ojo
desnudo no es de mucha utilidad para el diagnstico. Para el caso de realizar
una prueba de ELISA con producto soluble, es conveniente disponer de un
espectrofotmetro o lector de placas de microtitulacin, ya que se obtienen
valoresnumricosysepuedenefectuarlascorreccionessustrayendolosvalores
correspondientes al blanco de los controles sanos que ofrecen la reaccin
inespecficaqueescomnatodalaplaca.
^FactoresqueafectanlosresultadosenELISA
A continuacin se enumeran algunas de las causas ms comunes para la
ocurrenciadesealinespecfica:
Elevada variabilidad de absorbancia entre los pozos de una placa.
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Actualmenteespocofrecuentedebidoaquecadavezsecontrolamejoreste
factor, incluso algunos fabricantes ofrecen un certificado de anlisis con un
coeficientedevariacinestadsticamenteverificable.
Anticuerpos(policlonales)obtenidosapartirdeviruspurificadoparcialmente
que conserv antgenos de la planta y que por lo tanto tambin reaccionan
contraantgenosdeplantasana.
Uso de una concentracin elevada de reactivos (particularmente del
conjugado).
Sustratodegradadoporenzimasexgenas(p.ej.:lagrasayelsudordelas
manos contienen cantidades reactivas de fosfatasa alcalina que pueden
degradarelsustratoyconducirafalsospositivos).
Sustratoalmacenadoportiempoprolongadoyparcialmenteyadegradado.
Ejecucindeficientedelatcnica(escasadestreza,adicinerrticadelos
reactivosporelusodeinstrumentosnoajustados,ladilucindelosreactivos
estenunrangoenquelareaccinenzimticanoeslineal,etc.)
Muchas de estas reacciones pueden ser identificadas y corregidas mediante la
inclusin de controles experimentales adecuados, es decir: un control de
muestrapositivo(enfermo),uncontroldemuestranegativo(sano)yuncontrol
negativoabsoluto(slotampndeextraccin,sonrecomendables.La inclusin
de controles positivos de patgenos relacionados y no relacionados, no es
requerida, pero es aconsejable por la informacin de especificidad que se
obtiene,dndolemayorconfiabilidadalainterpretacinde los resultados de la
prueba.
Es recomendable efectuar diluciones de calibracin al iniciar el trabajo con un
lote de anticuerpos. Existe la tendencia general a omitir este paso debido al
inters de economizar reactivos, pero se debe hacer para contrastar con las
recomendaciones del fabricante, ya que desde la produccin del lote, pueden
ocurrir alteraciones en las condiciones de almacenamiento y/o transporte que
afectanlacalidaddelosreactivosyconsecuentementelareaccin.
Latcnicaquedescribiremosacontinuacinestbasadaenelinmunoensayode
doblesandwichdeanticuerposydeteccinindirecta,cuyassiglaseninglsson:
DASIELISA(DoubleAntibodySandwichIndirectEnzimeLinkedImmunoSorbent
Assay).
En el laboratorio de virologa del CENIAP se utiliza rutinariamente esta tcnica
para la deteccin del virus de la tristeza de los ctricos (CTV), utilizando una
mezcladeanticuerposmonoclonalescomerciales(3CA5+3DF1),quereconocen
todaslasvariantesdelvirusdescritashastaelpresente.Debidoaqueesunade
las variantes con ms pasos a seguir, es una referencia para la ejecucin de
otras, siguiendo las instrucciones de diferentes fabricantes o proveedores. Se
incluyencomentariosparafacilitarlacomprensindelmtodo.
Losvolmenesdereaccinsonlosmximosutilizablesconfinesdidcticos,ylas
diluciones son referidas a un factor de 1:1000, pero esta informacin puede
cambiarsegnlasespecificacionesdelfabricante.Otrossistemasdedeteccin
pueden utilizar diferentes tampones, que han sido validados para el sistema
biolgicoobjetodeestudio.
ProtocoloparaladeteccindelCTVconanticuerposmonoclonales
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usandoensayoDASIELISA
^Sensibilizacindelaplaca
Losanticuerposqueseaadenalaplacaantesquelamuestrasondenominados
anticuerposprimarios,desensibilizacinodecaptura.Losorificiosdelasplacas
son sensibilizados con 200 l de solucin de IgG diluda 1:1000 en tampn
carbonato a pH 9,6, dejando en incubacin por 2 h a 37C, o 18 h a 4C. Las
placas se enjuagan 3 veces con tampn fosfato salino + Tween 20 (PBST),
quedando listas para la adicin de las muestras (Fig. 1A). Cuando termina el
tiempo de incubacin, se puede recuperar la solucin con el anticuerpo de
capturayreutilizarloparaotrareaccinsiempreycuandoseapronto.Unavez
sensibilizadaunaplaca,puedepermanecerviablea4Cycubiertaparaevitarla
evaporacin hasta su uso luego de pocos das (no se recomienda ms de una
semana).
Figura1.RepresentacinesquemticadelatcnicadeDASIELISA
doblesandwichdeanticuerposparaladeteccinindirectadel
CTVconanticuerposmonoclonalesbionilados
A:Sensibilizacindelaplaca(anticuerpodecaptura: )
B:Adicindeantgeno
C:Adicindeanticuerpobiotinilado(primerconjugado )
D:Adicindelsegundoconjugado(estreptavidinafosfatasa
alcalina:
)
E:Adicindelsustrato(revelado)
F:DetencindelareaccinconNAOH3N.Lalecturasehace
luegoasimplevistaoconunespectrofotmetro.
Âdicindelasmuestras
A cada pozo de la placa, se aaden 200 l de antgeno o muestra
convenientementemaceradaydiluida(Ladilucinpuedevariardesde1:1hasta
1:100 en peso: volumen, segn calibracin previa) en tampn de extraccin
(Fig. 1B). Se debe incluir los respectivos controles o testigos (tejido enfermo,
sanoytampnsinmuestra).Laplacasepuedetaparconplsticoadhesivocon
la finalidad de prevenir evaporacin y se deja en incubacin a temperatura
ambiente,oa37Cde2a4horas,odurantelanochea4C.Luego,laplacaes
vaciada rpida y cuidadosamente, enjuagando posteriormente tres veces con
PBST.Ennuestrolaboratorioseusandospozospormuestra,conlafinalidadde
poderanalizarestadsticamentelosresultados.
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Âdicindelprimerconjugadooanticuerpossecundarios
Se aaden 200 l/pozo de los anticuerpos secundarios biotinilados diluidos
1:1000 en tampn de extraccin. Se dejan incubar por 3 horas a 37C, y
posteriormenteselavancuidadosamentecomoenpasosanteriores(Fig.1C).
La conjugacin del anticuerpo de deteccin con biotina permite que este sea
detectadoenunpasoposterior,porunconjugadoenzimticodeestreptavidina,
elcualdegrada un sustrato especfico y posibilita la deteccin de antgenos en
muy bajas concentraciones, dado el carcter amplificador que el uso de los
conjugadosdebiotinayestreptavidinaleconfierenalensayo.Elhechodequeel
anticuerposecundarioseadetectadoporelsegundoconjugado,esloquedefine
ladeteccinindirectadelvirus.
Âdicindelsegundoconjugado
Luego del enjuague, se agrega 200 l/pozo de estreptavidina conjugada con
fosfatasa alcalina diluida 1:1000 en tampn fosfato salino, dejando en
incubacinporunahoraatemperaturaambiente(Fig.1D).
Âdicindelsustratodelaenzima
Acontinuacin,seaade200l/pozodelsustratodelaenzima(paranitrofenil
fosfato de sodio, pnpp2Na) a razn de 1 mg/ml en una solucin acuosa de
dietanolamina10%apH9,8(Fig.1E).Sedejaincubarlareaccinenzimticapor
30minutos,luegodelocualesdetenidaporadicindeNaOHa3N,araznde50
l/pozo(Fig.1F).Eltiempodeincubacinpuedevariaryserecomiendasehaga
enlaoscuridad.Eltampnsustratosedebemantenerprotegidodelaluzdirecta
ycuandoelsustratoesaadidoaltampn,debeutilizarseinmediatamente.
^Lecturadelaplaca
Las placas estn listas para ser analizadas cuando a simple vista se pueda
observar una reaccin distinguible entre los controles de la placa.
Alternativamente se pueden analizar con el espectrofotmetro. Cuando se usa
fosfatasa alcalina y pnpp2Na como complejo enzimasustrato, se efecta la
lecturaa405nm.Lareaccinpuedehacerseevidentedemaneracasiinmediata,
opuededemorarhorasobedeciendoadiversosfactores.
En caso de efectuar la lectura directamente debe haber bajo nivel de reaccin
inespecfica y la coloracin debe tener una intensidad aceptable. Adems, se
recomiendaquelalecturaseaefectuadasobreunfondoblancoconluzincidente
o al transluz, que sea efectuada por una misma persona y que se haya
familiarizadoconlosdiferentesresultadosposibles.
Êstablecimientodelpuntodecorte
Elestablecimientodelpuntodecorteoumbraldedecisinparacalificarsiuna
muestraestsanaoinfectada,esrelativamentearbitrarioysehaescritomucho
al respecto. An cuando la prueba de ELISA es muy sensible para el caso de
especimenes asintomticos o que presenten sntomas no especficos, no es
infalible.Sinembargo,ofreceunmedioobjetivoaceptadointernacionalmenteen
muchos sistemas de control de calidad para la determinacin de la condicin
sanitariadeunamuestra.
En el laboratorio de Virologa Vegetal del CENIAP, se consideran muestras
enfermas o positivas aquellas cuyo promedio de lectura de absorbancia o
densidad ptica (D.O), es mayor o igual al promedio de la lectura del testigo
negativomsdosvecesladesviacinestandard del mismo {Prom D.O (2n
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1)},
con la finalidad de minimizar la probabilidad de ocurrencia de falsos

negativos,esdecir,escapesenladeteccin.Estepuntodecorteesconsiderado
estricto y requiere tener un buen control de error experimental, lo cual no
siempreesfactible.Sinembargo,sepuedesermenosestrictosegnelmotivo
deldiagnstico.Otroscriteriospuedenser:{PromD.O(3n1)}{PromD.O
(4n1)},osencillamente10veceselvalordelaD.Odelcontrolsano.Algunos
protocolos comerciales incluyen el procedimiento estadstico recomendado por
elfabricante.
Engeneral,serecomiendaestablecerunbalancedeespecificidaddelsistemade
deteccinyrigurosidadrequeridaenelensayo,yaquenoesigualladeteccin
deunaenfermedadenelcampoparaunaenfermedadendmica,queel control
decalidadenunaplantaocategoradesemilladeFundacin,oladeteccinde
unaenfermedaddeinterscuarentenarioenunlotedesemillaimportada.
^ Consideracionesfinalesytendenciasfuturas
LaincorporacinprogresivadelusodelatcnicadeELISAenVenezuelaparala
deteccindepatgenosenplantas,esunanecesidadalacualnoselehadado
la importancia que tiene, en funcin de su utilidad para mejorar el control de
calidadfitosanitariadesemillaymaterialdepropagacinvegetativa.
A pesar de tener una estructura de costos y escalabilidad razonables, su
utilizacin es todava marginal, asociada a proyectos de investigacin y
eventualmente en servicios solicitados por un nmero muy reducido de
productoresquehancomprendidoquesegeneravaloragregadoalsistemade
produccin, cuando se conoce objetivamente el estado fitosanitario de la
plantacinodeunlotedeplantasquepuedenservircomodonadorasdeyemas
libresdeundeterminadopatgeno.
Es deseable incluso, la incorporacin de la tcnica de ELISA en el anlisis de
calidadfitosanitariadesemillascertificadasporlainstitucin.Sinembargo, hay
un largo camino por transitar en el cual se deber definir cuales sern los
patgenos a incluir en el esquema de control y variables operacionales, como
intensidad de muestreo y niveles de tolerancia basada en la evaluacin de
normas internacionales ya en funcionamiento y ajustarlas a las condiciones de
nuestropas.
Dependencias como el Servicio Autnomo de Sanidad Agropecuaria, deben ser
fortalecidas en la Divisin de Sanidad Vegetal para incorporar rutinariamente
esta tecnologa en puertos y aeropuertos para el anlisis de muestras frente a
enfermedadesexticas.
Los bajos ndices de utilizacin de esta tcnica, se explican por la simple
aplicacindelaleydeofertaydemanda,enlacual,labajademandadecontrol
decalidadconinstrumentostecnolgicosenelpasenelsectorvegetal(yasea
de particulares o agencias del gobierno), limita la ampliacin de la oferta
tecnolgica,apesardecontarelpasconinstitucionesconcompetenciaslegales
y capacidades tcnicas para ello. Un medio para corregir esta desviacin
negativadelmercado,podraconsiderarlainclusindeunanormadeobligatorio
cumplimientoycuyaaplicacinseafactibletcnicayeconmicamente.
Nosedescarta,elusodeotrastcnicascomplementariasbasadasenlabiologa
molecular,comolahibridacindecidosnuclicosylareaccinencadenadela
polimerasa(PCR),lascualesenelfuturotendrnsuespacioenlarednacional
de laboratorios dedicados al diagnstico fitopatolgico, en conjunto con la
implementacin de la tcnica de ELISA, cuya alta sensibilidad y especificidad
permitirmejorarlosnivelesdecontroldelacalidadfitosanitariacomorespaldo
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5/9/2015
alaspolticasqueadelanteelestadovenezolano.
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Notadeloseditores
Esteartculofuerevisadoyavaladopor:
EfranSalazar
PedroRamos
Comentarios a este artculo a ceniaphoy@inia.gov.ve .Asunto CH10:
Implementacin de la tcnica de ELISA para la deteccin de virus y otros
patgenosenplantasenVenezuela.
11/12
5/9/2015
Referenciadeesteartculo:
RangelE.SchmidtA.yCenteno,F.2006.ImplementacindelatcnicadeELISA
paraladeteccindevirusyotrospatgenosenplantasenVenezuela.RevistaDigital
CENIAPHOYNmero10,2006.Maracay,Aragua,Venezuela.ISSN16904117,
Depsitolegal200302AR1449.URL:
www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n10/arti/rangel_e/arti/rangel_e.htm
Visitado:13/10/106
DERECHOSRESERVADOS2003REVISTADIGITALCENIAPHOY
ISSN:16904117
DepsitoLegal:200302AR1449
CENTRONACIONALDEINVESTIGACIONESAGROPECUARIAS(INIACENIAP)
UnidaddeInformacinCoordinaduradeNegociacin,Venezuela
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Implementación de La Técnica de ELISA para La Detección de Virus y Otros Patógenos en Plantas en Venezuela

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5/9/2015

De ocurrencia ms recientemente an, el estudio a escala mundial del virus de la

Elevada variabilidad de absorbancia entre los pozos de una placa.

con la finalidad de minimizar la probabilidad de ocurrencia de falsos

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