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Sldes - Reacoes Antigeno Anticorpo

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07/05/2013

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Técnicas Laboratoriais para detecção de antígenos-anticorpos

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico

RESPOSTA DE ANTICORPOS
 Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.

 Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.

 Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.

Afinidade Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.

Avidez x Afinidade

MÉTODOS
1) Reagentes não marcados • Reação de precipitação • Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados • RIA • ELISA • Imunofluorescência • Western Blotting

MÉTODOS
 PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

APLICAÇÕES
- Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia

 AGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs

 IMUNOENSAIOS
- RIA - ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo Western Blotting

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

Precipitação: Aglutinação:

Formação de complexos Antígeno-Anticorpo.

É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de anticorpo que se ligam a antígeno na superfície de partículas adjacentes. As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
   

Interação entre Anticorpo e Antígeno solúvel Anticorpo precisa ser bivalente Antígeno precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO

É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: +

Anticorpo livre Antígeno livre 100%-Percentual de complexo imune precipitado

+ -

Zona de Zona de excesso equivalência de anticorpo

Zona de excesso de antígeno

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla: • Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

IMUNODIFUSÃO DUPLA

As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose

Ag

Ag

Ac Ag Ag

Ag

Ag

Ac

Ac

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IMUNODIFUSÃO RADIAL
 

Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas. Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Halo deanti-IgG IgG – precipitação

IMUNOELETROFORESE
   

Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação.

1- Separação de antígenos
Ag

2- Anti-soro na coluna canaleta
canaleta

+
Ag

3- Difusão e precipitação

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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac + Ag multivalente particulado  Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo)  Pó-zona: excesso de Ac  Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão)  Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

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AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

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AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:

negativo

positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.

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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. • O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. • Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglutinação Positiva Negativa

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+
Urina Soro anti - hCG Adicionam-se São incubados e colocados numa placa Partículas revestidas com hCG

Resultado positivo:
(presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação. Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo: (ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

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TESTE DE COOMBS
     

Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

IMUNOENSAIOS
 Reagentes

marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)  Tipos:
-

RIA ELISA IFA / CITOMETRIA DE FLUXO WESTERN BLOTTING

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.  Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.  A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
 

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o material examinado

fluorescência emitida chega ao observador

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
É

uma técnica onde se consegue intensa) e especificidade.

alta sensibilidade (fluorescência é mais

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

 

O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO

DIRETO OU SANDUÍCHE

PLACA UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

ELISA Competitivo

 Aplicações do ELISA:  Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa  Vantagens:  Teste de alta sensibilidade  Permite quantificar Ag ou Ac das amostras  Seguros e de baixo custo

RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcações:  I125: emite raios gama  H3: raios beta  Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)  Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.  Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

WESTERN BLOTTING
 Eletroforese

de

proteínas.  Identifica antígenos ou anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

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