GLUTATION REDUKTAZA

(Sigma assay kit- Milo je ovako radio)

Reagensi:
1. Assay buffer (100 mM K-fosfatni pufer, 1 mM EDTA, pH 7,5) steilno filtrovati
0,5 M fosfat
10 ml
200 mM EDTA
50 l
dH2O
39,95 ml
2. Dilucioni pufer ( 100 mM fosfat pH 7,5; 1 mM EDTA; 1 mg/ ml BSA)
0,5 M fosfat
10 ml
200 mM EDTA
50 l
BSA
50 mg
dH2O
39,95 ml
Sterilno profiltrovati pufer, dodati BSA.
3. 2 mM NADPH- pripremiti svee
NADPH
9,25 mg
Assay buffer
5 ml
4. 2 mM oksidovani gluatation ( GSSG)
GSSG
7,1 mg
Assay buffer
5 ml
uvati na sobnoj temperaturi do izvoenja testa. Moe se uvati na 2-8 C, 7 dana.
Priprema uzorka:
Lizirati eritrocite: 200 l + 600 l hladne dH2O na ledu 30 minuta. Razblaiti lizirane eritrocite u
dilucionom puferu neposredno pre analize (5x i 10x).
Postupak:
Sve temperirati na sobnoj temperaturi 10 minuta pre poetka reakcije.
Sipati u kvarcnu kivetu po navedenom redosledu, reakcija poinje dodatkom NADPH. Meriti A
na 340 nm, interval 10s.
2 mM GSSG
Assay buffer
Uzorak
2 mM NADPH

Blank
500 l
450 l
/
50 l

Uzorak
500 l
400 l
50 l
50 l

Izraunavanje:
U/ml ( Auz Ablank) x R/ x V (u ml)

= 6,22 mM-1 cm-1