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UNIVERSIDADE DO OESTE PAULISTA-UNOESTE

CURSO DE FARMCIA

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROM Punica

granatum L. NO TUMOR ASCTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS

PRESIDENTE PRUDENTE
2015

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DO EXTRATO DE ROM Punica

granatum L. NO TUMOR ASCTICO DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS

Projeto de Pesquisa apresentado ao Comit de

tica da Universidade do Oeste Paulista Unoeste
Presidente Prudente, sob orientao do professor
Decio.

Presidente Prudente
2015

Contedo
1. INTRODUO........................................................................................................................ 4
1.1

APRESENTAO DO TEMA.........................................................................................4

1.2 PROBLEMA........................................................................................................................ 5
1.3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................. 6
1.4 OBJETIVOS........................................................................................................................ 6
1.4.1 OBJETIVO GERAL.......................................................................................................6
1.4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS........................................................................................6
2. REFERENCIAL TERICO.......................................................................................................7
2.1 TUMOR DE EHRLICH........................................................................................................ 7
2.2 PLANTAS MEDICINAIS......................................................................................................8
2.3 ROM............................................................................................................................... 10
2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROM......................................................................10
2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS........................................................................................10
3. METODOLOGIA..................................................................................................................... 11
3.1 TIPO DE PESQUISA.........................................................................................................11
3.2. EQUIPAMENTOS............................................................................................................ 12
3.3 OBTENO E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROM..........................................12
3.4 INOCULAO DO TUMOR..............................................................................................13
3.5 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROM..................................................13
3.6 DETERMINAO DO NUMERO DE CLULAS VIVEIS...............................................13
3.7 AVALIAO DO CRESCIMENTO DO TUMOR................................................................13
3.8 AVALIAO DA MEDULA SSEA....................................................................................14
4. RECURSOS........................................................................................................................... 14
4.1 RECURSOS FSICOS......................................................................................................14
4.2 RECURSOS HUMANOS..................................................................................................14
4..3 RECURSOS MATERIAIS.................................................................................................14
4.4RECURSOS FINANCEIROS.............................................................................................15
5. CRONOGRAMA..................................................................................................................... 16
6. REFERNCIAS...................................................................................................................... 17

1. INTRODUO
1.1 APRESENTAO DO TEMA
O termo neoplasia pode ser compreendido como proliferao celular anormal,
autnoma e descontrolada, as clulas diminuem ou perdem a capacidade de
diferenciao, resultando em alteraes nos genes reguladores do crescimento e
diferenciao celular (FILHO, PEREIRA, GUIMARES, 2004).
O cncer tambm conhecido como neoplasia uma doena de natureza crnica
que possuem como caracterstica em comum o crescimento desordenado de clulas
que invadem os tecidos e rgos, podendo espalhar-se para outras regies do corpo.
As clulas cancerosas se replicam rapidamente e possuem a tendncia de serem muito
agressivas e incontrolveis as que determinaro a formao de tumores ou neoplasias
malignas. O principal objetivo do tratamento das neoplasias obter a completa
irradiao de clulas tumorais, podendo ser realizado atravs de cirurgias que o meio
simples e seguro para remover tumores slidos. E pode ser obtido por quimioterapia,
um tratamento que envolve o uso de frmacos citotxicos, e por radioterapia que pode
ser curativa para tumores localizados (KUMAR; COTRAN, 2000).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam a ocorrncia de
aproximadamente 518.510 casos novos de cncer, incluindo os casos de pele no
melanoma, reforando a magnitude do problema do cncer no pas. Sem os casos de
cncer da pele no melanoma, estima-se um total de 385 mil casos novos. Os tipos
mais incidentes sero os cnceres de pele no melanoma, prstata, pulmo, clon e
reto e estmago para o sexo masculino; e os cnceres de pele no melanoma, mama,
colo do tero, clon e reto e glndula tireoide para o sexo feminino (INCA, 2012).
Segundo dados do Instituto Nacional de Cncer (INCA, 2011) a doena j a
segunda causa de morte no Brasil. A OMS alerta para o fato de que se no forem
tomadas medidas de preveno a incidncia de cncer aumentar em 100% nos
prximos 20 anos (BRASIL, 2003).

1.2 PROBLEMA

A utilizao de produtos naturais como terapia muito antiga e por muito tempo
foi o nico arsenal teraputico disponvel. Com a Revoluo Industrial e com a
descoberta da Indstria Qumica, as plantas foram caindo em desuso e os produtos
qumicos ganharam fora de uso, um dos fatores que facilitou essa mudana de hbitos
foi a facilidade de obteno de compostos puros, facilidade de utilizao e pelo grande
poder da Industria Farmacutica (RATES, 2001).
Vale ressaltar que no Brasil, a utilizao de plantas medicinais tambm
difundida e ampliada pela crise econmica que afeta o pas, coligada ao difcil acesso
da populao assistncia mdica e farmacutica, elevado custo dos medicamentos
industrializados e a crescente tendncia dos consumidores a utilizarem produtos
naturais decorrente de uma conscincia ecolgica estabelecida nos ltimos anos
(SILVEIRA, BANDEIRA, ARRAIS, 2008).
Sabe-se que ainda h grande nmero de plantas medicinais utilizadas em todo o
mundo, por todas as idades e para diversos fins, mesmo sem a devida comprovao
cientfica de sua ao farmacolgica.
Considerando que o Brasil possui a flora mais rica do mundo em matria prima
para a produo de fitofrmacos (cerca de 1/3 do total) e que apenas cerca de 8%
foram estudadas, de suma importncia que se busque nestas plantas uma fonte
alternativa de medicamentos, visando no futuro a obteno de novos frmacos mais
eficazes e especficos (BRAZ- FILHO, 1994; SIMES etal , 1999).

1.3 JUSTIFICATIVA

O cncer constitui a segunda causa de mortes por doena no mundo considerado

problema de sade pblica.
Os tratamentos atuais no so totalmente eficazes na maioria dos cnceres com
efeitos colaterais e reaes adversas intensas.
As plantas medicinais so amplamente utilizadas, por diversos motivos, utilizadas
para diversos fins, que variam de preventivo a curativo. Em diversas regies as plantas
medicinais so uma das principais formas de tratamento, onde a populao utiliza por
muitas vezes de forma errnea, com preparo e quantidades inadequadas, e sem saber
se o efeito biolgico comprovado.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade antitumoral do extrato bruto de rom em camundongos com

TAE.

1.4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar se a planta pnica granatum L. modifica o desenvolvimento do tumor

asctico de Ehrlich (TAE) em camundongos.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de volume

asctico de animais portadores do tumor asctico de Ehrlich.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera a quantidade de clulas totais e

tumorais da cavidade peritoneal.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o nmero total das celulas na
medula ssea.

Determinar se este tratamento, nesta dose, altera o nmero dos leuccitos

sangneos totais e diferenciais dos animais com tumor.

2. REFERENCIAL TERICO

2.1 TUMORES DE EHRLICH

O tumor de Ehrlich foi introduzido por Erlich em 1886 e descrito em 1906 como
um carcinoma mamrio de camundongos fmeas. Inicialmente, o tumor foi
desenvolvido experimentalmente sob a forma solida, sendo ento transplantado em
animais da mesma espcie. Em 1932, com Loenwnthal & Jahn , surgiu em forma
ascitica, ou seja, aquela que se desenvolve no peritnio de animais inoculados com
clulas tumorais (GUERRA, 1983).
A induo experimental dessa neoplasia em camundongos feito por intermdio
do transplante das clulas tumorais retiradas de um animal j com a neoplasia
desenvolvida. Essa inoculao poder ser feita diretamente no peritnio do receptor,
levando ao desenvolvimento da forma ascitica, diretamente no subcutneo ou no
coxim plantar, ambas as localizaes levando a formao do tumor solido. No exame
microscpio da forma ascitica, aps o 7 dia j possvel observar expressivo
crescimento da massa tumoral, um fluido discretamente viscoso e de aspecto leitoso,
na qual continua crescendo: aps o dcimo dia de inoculao intraperitoneal do
tumor, cerca de 90% das clulas so tumorais. Pode-se observar a migrao das
clulas para os linfonodos regionais. O tumor possui clulas inflamatrias, estroma
escasso e alto ndice mittico e de invasidade: constituindo um excelente instrumento
didtico para o entendimento do comportamento dos tumores malignos (GERRA,
1983).
O tumor de Ehrlich possui capacidade de crescimento em quase todas as
linhagens de camundongos, provavelmente porque durante o processo de
transformao maligna suas clulas perderam os antgenos de histocompatibilidade
H-2 (CARRY, 1979). um tumor considerado pouco imunognico, pois no expressa
molculas de MHC de classe II. Devido a sua baixa imunidade, esta neoplasia
apresenta crescimento bastante agressivo, com proliferao celular acelerada e
invaso de tecidos adjacentes. A virulncia do tumor de Ehrlich no alterada pela

linhagem do camundongo utilizada, porm cada linhagem apresenta uma reao

imunolgica especfica presena do tumor, fato que altera a sobrevida de acordo
com a linhagem utilizada (KODAMA & KODAMA, 1975). O tumor de Ehrlich bom
modelo para estudos envolvendo citologia, por crescer na forma asctica, o que
permite a obteno de clulas tumorais isoladas (HOSSNE, 2002).
Histologicamente, o tumor de Ehrlich apresenta extensas reas de necrose.
Estas so oriundas da morte das clulas neoplsicas, a qual bastante intensa j na
primeira semana ps-inoculao. Intensa atpica e clulas extremamente anaplsicas
so comumente vistas por toda a lmina. O tumor possui poucas clulas
inflamatrias e estroma escasso. Alto ndice mittico e de invasividade caracterizam
essa neoplasia, a qual constitui excelente instrumento didtico para o entendimento
do comportamento dos tumores malignos (DAGLI, 1989).

2.2 PLANTAS MEDICINAIS

Desde tempos remotos, o homem busca, na natureza, recursos que melhorem

sua condio de vida para assim aumentar suas chances de sobrevivncia pela
melhoria de sua sade (BRASIL, 2006).
Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), 85% das pessoas do mundo
utilizam plantas medicinais para tratar da sade (OLIVEIRA; SIMOES: SASSI, 2006).
Nesse sentido, visando diminuio do numero de excludos dos sistemas
governamentais de sade, a OMS recomenda aos rgos responsveis pela sade
publica de cada pas, que: a) procedam ao levantamento regional das plantas e
identifique-as botanicamente; b) estimulem e recomendem o uso daquelas que tiverem
comprovadas sua eficcia e segurana teraputica; c) desaconselhem o emprego das
praticas medicina popular considerada prejudicial; d) desenvolvam programas que
permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas na forma de preparaes dotadas
de eficcia, segurana e qualidade (LORENZI&MATOS, 2008). Um estudo realizado
pelo RENISUS-Relao Nacional de Plantas Medicinais, divulgada pelo Programa
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos do Ministrio da Sade teve como

objetivos orientar a elaborao de uma relao de fitoterpicos disponveis para o uso

da populao, com segurana e eficcia para o tratamento de determinadas doenas.
Neste estudo, foram analisadas 71 espcies de plantas medicinais e dentre elas,
encontra-se a rom, P. granatum (MINISTERIO DA SAUDE, 2009).
O uso de plantas medicinais para tratamento, cura e preveno de doenas tem
sido descrito por muitos povos desde os tempos mais remotos. Devido a esse uso,
surgiram interesses comerciais e cientficos e, por isso, tornou-se necessria a
avaliao da eficcia e segurana dessas plantas. Para muitos, o conceito de natural
significa a ausncia de produtos qumicos, que so aqueles que podem representar
perigo. Esse conceito equivocado, j que muitas plantas contm substncias com
aes txicas sobre organismos vivos. A funo dessas substncias para os produtores
de defesa contra predadores, por isso no de surpreender que muitas plantas
acumulem substncias de elevada toxicidade (MENGUE et al., 2001).
As plantas medicinais desempenham papel importante na medicina, na indstria
e na economia, uma vez que podem fornecer frmacos extremamente importantes e
difceis de serem obtidos atravs da sntese qumica. As fontes naturais fornecem
compostos que podem ser levemente modificados, tornando-os mais eficazes ou
menos txicos. Diante da grande importncia dos fitoterpicos, verifica-se que vrios
pases da Europa (dentre eles Alemanha e Frana), esto intensificando esforos para
unificar a legislao que regulamenta a comercializao dos fitoterpicos. Entretanto,
nos Estados Unidos, a grande maioria das preparaes que possuem derivados de
plantas medicinais pode ser comercializada livremente por ser classificada como
suplementos nutricionais. Esta classificao faz com que no seja necessrio submeter
dados de segurana e eficcia destes produtos ao rgo regulamentador Food and
Drug Administration (FDA) (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).

2.3 ROM
Punica granatum L. ou popularmente denominada de romzeira, pertencente
famlia Punicaceae, um arbusto ramoso ou arvoreta de at 3m de altura,com folhas
simples,cartceas,

dispostas

em

grupos

de

ou

3,

de

4-8

cm

de

10

comprimento.Contem flores solitrias, constitudas de corola vermelho-alaranjada e

um clice esverdeado, duro e coricio. Frutos de tipo baga, globoides, medindo at
12 cm, com numerosas sementes envolvidas por um arilo rseo, cheio de um liquido
adocicado. , muito provavelmente, originaria da sia e espalhada em toda regio do
Mediterrneo, sendo cultivada em quase todo mundo, inclusive no Brasil
(LORENZI&MATOS, 2008).

2.4 IMPORTANCIA FITOTERAPICA DA ROM

Conforme estudos realizados por LORENZI & MATOS (2008), a analise
fotoqumica da romzeira registra a presena de at 28% de taninos glicos na
casca do caule e dos frutos e, em menor quantidade, nas folhas; nas sementes 7%
de um leo essencial, que entre seus cidos graxos esta principalmente o acido
puncico.
Atualmente muitos trabalhos cientficos so feitos estudando as propriedades
medicinais da romzeira. No entanto, h ainda poucos estudos etnobotnicos, de
farmacognosia e toxicolgicos suficientes para elucidar os mecanismos de ao e
efeitos dos constituintes qumicos derivados da rom (MACHADO et al.,2003)

2.5 PROPRIEDADES MEDICINAIS

Com o objetivo de pesquisar o uso tradicional de plantas medicinais usadas em
Ladakh, na ndia, BALLABH et al.(2008) coletaram informaes de 105 aldeias onde
fazem uso de varias espcies de plantas, incluindo P. granatum, contra distrbios
renais e urinrios. Os resultados mostraram a eficcia dos sistema tradicional da
medicina para estes povos.
A avaliao da toxicidade do extrato da P. granatum realizada por WERKMAN
(2009) por meio de cultura celular com duas linhagens: fibroblastos humanos de
mucosa oral e clulas de carcinoma epidermoide. Os resultados mostraram que op

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extrato inibiu a citoxicidade celular nas concentraes 0,5%, 0,25%, 0,125%

0,031%. Esses resultados esto relacionados com a propriedade anticarcinogenica

da rom.
Estudos in vitro realizados por DAI et al. (2010) demonstram que o extrato da
rom inibe a proliferao do cncer mamrio. Os dados sugerem que o extrato um
suplemento diettico e tem futuro no tratamento de cncer de mama.
A atividade citotxica de P. granatum foi avaliada por OLIVEIRA ET AL.(2010). Os
resultados revelaram que o extrato possui potencial antitumoral in vitro e in vivo.

3. METODOLOGIA

3.1 TIPOS DE PESQUISA

Pesquisa Experimental
Sero utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) fmeas, pesando
entre 30-80g provenientes do Biotrio da Unoeste, divididos em 3 grupos e cada grupo
acomodado em 3 gaiolas.
Os animais sero mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, em temperatura
entre 22 e 25C, com gua a vontade e rao ad libitum. Os nossos protocolos para
experimentos com animais sero projetados de maneira que o animal tenha o mnimo
de sofrimento possvel e com limite de animais sacrificados. Os procedimentos
adotados com os animais seguiro os Princpios ticos, de acordo com a resoluo
1000 de 11/05/2012 do Conselho Federal de Medicina Veterinria. Os protocolos para
experimentos com animais sero projetados de maneira que o animal tenha o mnimo
de sofrimento possvel e com limite de animais sacrificados. Aps o experimento os
animais sero sacrificados por inalao, com a substncia inalatria anestsica
isoflurano, com posterior deslocamento da coluna cervical, a fim de minimizar
sofrimento dos animais.

12

3.2 EQUIPAMENTOS

Balana analtica (Bel Engineerring);

Leitora de Elisa ( LabsystemsMultiskan MS );

Centrfuga de eppendorff;

Espectrofotmetro (Digimed DME 21)

3.3 OBTENES E PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA ROM

Os extratos sero preparados no Laboratrio da Unoeste , segundo as
recomendaes da Farmacopeia Brasileira 2 edio (1959) e adaptaes de SILVA et
al. (2006) e SILVA (2008).
Os extratos etanolicos sero obtidos a partir da folhas e frutos fresco pelo
processo de macerao a frio. Sero utilizadas 500g de cada material vegetal
dissolvido em lcool etlico.
Inicialmente, as folhas e os frutos sero devidamente selecionados, higienizadas,
pesadas em balana eletrnica e acondicionadas em vidros com tampa rosqueada por
quatorze dias com o solvente extrator, sendo agitados periodicamente. Aps esse
perodo, o extrato ser filtrado, e levado a secura em banho-maria para a evaporao
do solvente.

3.4 INOCULAES DO TUMOR

Ser inoculado na cavidade peritoneal 0,2ml de tumor asctico, nele contendo
5x106 clulas tumorais em cada camundongo.

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3.5 AVALIAES DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA ROM

Os animais sero tratados com o extrato hidroalcoolico de rom via oral pelo
mtodo de gavagem.

3.6 DETERMINAO DO NUMERO DE CLULAS VIVEIS

O nmero total de clulas ser determinado atravs da contagem em cmara de
Neubauer, usando o microscpio ptico. Para a viabilidade celular as clulas sero
diludas em corante vital azul de Tripan.

3.7 AVALIAO DO CRESCIMENTO DO TUMOR

Os animais sero separados em trs grupos. Todos recebero 5X10 6 clulas

tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle receber o veculo de diluio do
extrato e o grupo tratado receber os extrato da planta diludo no mesmo veculo por
gavagem 2 X ao dia por 7 dias.
Para determinar o crescimento do tumor ser avaliado o peso dos camundongos
no 1 e no 8 dia do experimento. A cavidade peritoneal ser lavada (aps a morte do
animal) com 5 mL de salina, sendo determinado o volume do recolhido e o nmero de
clulas contidas neste volume.
A contagem ser determinada em cmara de Neubauer ao microscpio ptico.

3.8 AVALIAES DA MEDULA SSEA

Para avaliar a medula ssea ser extrado o fmur de cada animal, sendo que as
suas extremidades sero seccionadas de maneira que todos tenham a mesma medida
de aproximadamente 1 cm de comprimento. O canal interno de cada fmur ser lavado

14

com 3 mL de soro fisiolgico e o lquido resultante ser corado com cristal violeta. A
contagem ser realizada em cmara de Neubauer.
4. RECURSOS

4.1 RECURSOS FSICOS

O preparo do extrato da Rom ser realizado no Laboratrio da Unoeste. Todos
os experimentos comportamentais e bioqumicos sero realizados no laboratrio de
pesquisa da mesma instituio.

4.2 RECURSOS HUMANOS

Este trabalho ser realizado pela acadmica Kelly C. do curso de Farmcia e um
professor orientador.

4.3 RECURSOS MATERIAIS

Pipetas volumtricas de vidro e pipetas automticas;

Tubos de ensaio;

Estante para tubos de ensaio;

Placas de Petri;

Basto de vidro;

Balo volumtrico;

Becker;

Balana analtica (Bel Engineerring);

15

Leitora de Elisa LabsystemsMultiskan MS

Material cirrgico;

4.4 RECURSOS FINANCEIROS

Considerando que todos os equipamentos e reagentes que sero utilizados j
fazem parte dos recursos permanentes da Unoeste, e encontram-se disponveis para
utilizao, estima-se que no ser necessrio investimento financeiro para execuo
deste projeto.

5. CRONOGRAMA

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outubro
2015

novembro

dezembro

2015

2015

Preparo do
extrato de rom
X
Avaliao da
dose teraputica
do extrato de

rom
Avaliao do
efeito antitumoral
do extrato de
rom
Reviso

bibliogrfica
Anlise

estatstica
Elaborao do

X
x

X
x

Relatrio

6. REFERNCIAS
BALLABH,B.et AL.Traditional medicinal plants of cold desert Ladakh-used against
kidney and urinary disorders.Journal of Ethonopharmacology, v.118, n.2, p.331-339,
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17

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fev.,

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OLIVEIRA, M.J.R.; SIMOES, M.J.S; SASSI, C.R.R. Fitoterapia no Sistema de Saude
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Medicinais, v.8, n.2, p.39-41, 2006
WERKMAN, C. Citotoxicidade da Punica granatum L. (romak) sobre cultura de
fibroblastos e de clulas de linhagem cancergena. Tese apresentada a Universidade
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2009