TECNICAS DE OBSERVACIN

MICROSCOPICA

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y tien.
Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la
divisin celular
Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observacin con tinciones

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias
Identificacin y diferenciacin de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
preparacin en fresco simple
preparacin en gota pendiente
2. Observacin con tinciones
Tincin simple: un solo colorante.
Tincin diferencial: ms de un colorante
Tincin especial
Tincin negativa: colorea el medio que rodea
a la bacteria permaneciendo sta sin teir.

Procedimiento para un preparado en fresco

("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota de

2.- Tomar la muestra con el

SSF o agua en un porta

asa de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.
campo oscuro)

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco : (SSF)
Parsitos : Trofozoitos, larvas.

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Hongos: Levaduras

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco con modificaciones
Hongos
NaOH 10% (hifas)

Procedimiento para un preparado en fresco

en gota pendiente

2. TINCIONES O COLORACIONES

COLORANTE: DEFINICIN
Son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por algn componente.
Los colorantes son compuestos qumicos
utilizados para aumentar el contraste

COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un anin
incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente (cidos
nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas)
(ms usados en citologa bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina bsica,
el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado.

No tien la clula bacteriana, pueden usarse como color de
contraste (coloracin negativa). Tien estructuras citoplasmticas
de las clulas eucariotas(Rx bsicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.

COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
Se combinan con los componentes lipdicos de
la clula, usados para revelar la localizacin de
los depsitos de grasa. Ej. Negro Sudn.

COLORACIONES : Tipos
Vitales
Son aquellas que se practican sobre clulas que estn
vivas, mediante la introduccin de un colorante en la
circulacin de un organismo vivo.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.

Supravitales
son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos,
pero que estn aislados del organismo del que proceden.

No vitales
se realizan sobre clulas muertas.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
b) La fijacin

c) Coloracin.

Tincin de clulas para la observacin

microscpica

Extensin de una fina capa

de clulas sobre el porta

Adicin del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Se coloca una gota de aceite

de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)

Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)

TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH)
FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y ter)

Metanol

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
c) Coloracin. SIMPLE : Positiva o negativa

Lunes

Tincin simple de azul de metileno.

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de agua

en un porta

2.- Tomar la muestra con el

asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y

fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin

con Azul de Metileno 5

2.- Lavar con agua, dejar

secar y observar al
microscopio
Micrococcus luteus

Lunes

Tincin negativa.

1.- Colocar una gota

Nigrosina en un porta

de

2.- Tomar muestra del

microorganismo
con el
asa, flamear el tubo y tapar

3.- Mezclar con la

Nigrosina y extender por
todo el porta. Secar al
aire y observar

cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas

 Hongos
Tincin negativa

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
c) Coloracin. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Etapas :
1. tincin primaria
2. Tincin de contraste o secundaria
-

Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHLNEELSEN, ESPORAS

TERMINOS
Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tincin
porque aumentan la afinidad de la
clula por el colorante. Tambin se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podran
ser visualizados de otra forma.

Diferencias en la pared celular

Lunes
Tincin

L-3.2.3.- Tincin de Gram

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota 2.- Tomar la muestra

de agua en un porta con el asa de siembra

3.- Decolorar con

Alcohol 96 hasta que
no suelte colorante

3.- Extender sobre el

agua y fijar a la llama
del mechero

4.- Lavar con agua

1.- Cubrir la
preparacin con
Cristal Violeta 2

5.- Teir con Safranina 1

2.- Aadir Lugol

(mordiente) durante 1

6.- Lavar con agua,

dejar secar y observar
al microscopio

Tincin de Gram
Tincin del frotis
Paso 1

Paso 2

Previamente fijado al calor,

con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.

Aadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las clulas siguen
de color azul-violeta.

Gram +

Decolorar con alcohol

Paso 3

Las clulas Gram +

siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las clulas G+
se ven azul-violeta.

Paso 4

Las G- rosas o rojas.

Gram -

PROCEDIMIENTO COLORACION
GRAM

Lunes

Tincin de Gram
Cocos Gram -

Bacilos Gram -

COLORACIN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad
de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos miclicos)
Resiste la decoloracin con alcohol y un cido fuerte cuando
VARIANTES
Caliente : Mycobacterium
En fro (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E

Miercoles

Tincin de cido-alcohol-resistente.
Tincin

Frotis y fijacin

1.-Poner una gota de agua

en un porta

2.- Tomar la muestra de un

cultivo de Mycobacterium

3.-Extender sobre el agua y

fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparacin
con Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de

algodn empapado en alcohol
y prendido con la llama del
mechero hasta la emisin de
vapores. Mantener durante 5
minutos.

3.-Lavar con agua y

decolorar con alcohol
cido

5.-Lavar con agua, dejar

secar y observar al
microscopio

4.-Teir con Azul de

Metileno 1

Tincin de esporas.

Miercoles
Tincin

Frotis y fijacin

1.-Poner una gota de

agua en un porta

2.-Tomar la muestra de
un cultivo de Bacillus

2.-Calentar, con un
hisopo de algodn
empapado en alcohol
y prendido con la
llama del mechero,
hasta la emisin de
vapores.
Mantener
caliente durante 5
minutos.

3.-Lavar con agua

3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero

Esporas

Bacterias

4.-Teir con Safranina 1

1.-Cubrir la
preparacin con
Verde Malaquita

5.-Lavar con agua,

dejar secar y observar
al microscopio

La tincin de flagelos de Leifson

1.Se fija qumicamente la suspensin bacteriana,
mediante formol, y se hace la extensin en un
portaobjetos.
2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
3.Se cubre la preparacin con una mezcla de cido
tnico y el colorante rosanilina, de preparacin
extempornea. El cido tnico engruesa los flagelos y
la rosanilina los tie.
4.Se retira el exceso de colorante con agua.

5. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su

observacin al microscopio.

Figura 3.11Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza para observar

endosporas. Bacilius cereus (b) La tincin de Leifson revela que este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa
con tinta china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su
identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.

Tcnicas de tincin para bacterias

Tincin

Uso

Tcnicas

Tinciones
simples

Un colorante; proporciona contraste para

observar mejor un organismo completo

Se tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina

bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi
todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.

Tnciones
diferenciales
Tincin de Gram Dos o ms colorantes; distingue entre
bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y despus con

una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas quedan tenidas de color
violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa.
Tincin de
Dos colorantes; distingue entre las
Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores
cido-alcohol
micobacterias (cido-alcohol resistentes) y el durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora
resistencia
resto de las bacterias
brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes
(Ziehl-Neelsen)
permanecen teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el
colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes
continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul.
Tinciones
especificas
Tincin de
Tie selectivamente las endosporas
Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de
esporas de
vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie
Wirtz-Cortitlin
con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma
el color rosa.
Tincin de
Permite observar los flagelos
A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico
flagelos de
(mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el
Leifson
colorante los fine.
Tincin negativa Revela la presencia de cpsulas
Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparacin en fresco del
espcimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que
se observa como una regin clara alrededor de la clula.

Imgenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos

microscopios. (a) La microscopa de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamao, como el ncleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el caracterstico halo. (c) La
microscopa de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.

PARASITOS: Plasmodium
GIEMSA O WRIGHT

COLORACION LEISHMAN

HONGOS
AZUL DE LACTOFENOL
T. MENTAGROPHYTES

COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA

Hay alguna pregunta?

o de lo contrario

seguimos en la
prxima clase !!!