ANALISIS KIMIA ENZIM

1. PENGUJIAN KUALITATIF ENZIM AMILASE

Pendahuluan
Parameter umum yang digunakan untuk mempelajari aktivitas hidrolitik
enzim amilase terhadap substrat pati diantaranya :
1. Penurunan viskositas
2. Kehilangan kemampuan untuk memberikan warna biru dengan iodin
Ketiga tipe enzim amilase dapat dibedakan satu dengan lainnya berdasarkan
2 atau lebih kriteria ini.
Kriteria

Laju relatif
-amilase

Pembentukan gugus pereduksi

- amilase

glukoamilase

Sama atau hampir sama

Kehilangan viskositas

Cepat

Lambat

lambat

Kehilangan warna biru dgn iodin

Cepat

Lambat

Lambat

Produksi maltosa

Lambat

Cepat

Tidak ada

Produksi glukosa

Tidak ada

Tidak ada

Cepat

Prosedur Kerja:
a. Substrat yang digunakan larutan pati 4% (DE= 15-20) dengan pelarutnya
buffer asetat pH 5.5.
b. Sebanyak 1 ml substrat ditambah larutan iodin 1% selanjutnya tambahkan
dengan 0.5

ml

larutan

enzim.

Pengamatan

aktivitas

amilase

didasarkan

terjadinya perubahan warna biru dari pati setelah ditambah

larutan iodin 1%. Inkubasi pada suhu kamar dengan pengamatan setiap 10
menit, selama 60 menit.
Pengujian aktivitas enzim amilase dapat dilakukan secara kuantitatif dan
secara kualitatif. Dalam pengujian kualitatif dapat digunakan larutan pati/amilum
sebagai substratnya. Pada nilai pH sekitar 6-7 dan dengan adanya kehadiran ion

clorida, maka amilase akan mengkatalisis hidrolisa pati dan menghasilkan

dekstrin dan turunannya. Pati dan dekstrin yang mempunyai berat molekul (BM)
yang tinggi akan memberikan warna biru ungu jika direaksikan dengan iodine.
Sedangkan dekstrin dengan BM rendah tidak akan bereaksi dengan iodine.
Dengan demikian, kerja amilase dapat diamati dengan perubahan yang terjadi.
Achromic point adalah suatu keadaan dimana campuran reaktan tidak membentuk
warna lagi dengan iodine. Selain itu, pengujian enzim secara kuantitatif adalah
pengujian aktivitas enzim berdasarkan jumlah substrat yang berubah sesuai
dengan perubahan waktu (Tranggono & Setiaji, 1989).
Reaksi spesifik yang terjadi pada saat pati ditambah dengan iod akan memberi warna
biru tua, lalu pati dihidrolisis menjadi dekstrin dan jika direaksikan dengan iod akan
memberikan warna ungu untuk yang berat molekulnya besar dan warna merah coklat jika
berat molekulnya kecil. Jika dekstrin dihidrolisa lebih lanjut maka akan menghasilkan
maltosa dan glukosa yang jika direaksikan dengan dengan iod, tidak memberi warna.
Sehingga dapat kita ketahui bahwa larutan iodium merupakan indikator warna (Noor,
1990).
Secara kuantitatif, terjadinya reaksi hidrolisis pati oleh enzim amilase dapat diketahui
dengan uji iodin (Riawan, 1990). Pada uji iodin, karbohidrat golongan pati akan
memberikan reaksi dengan larutan iodin dan memberi warna spesifik tergantung dari
jenis karbohidratnya. Amilosa dengan iodin akan berwarna biru, amilopektin dengan
iodin akan berwarna merah violet, glikogen maupun dekstrin dengan iodin akan berwarna
merah coklat (Sudarmadji et al., 1989).
Bila zat pati ditetesi larutan iodium akan timbul warna biru. Terjadinya warna ini
disebabkan olehamylase yang mengabsorbsi iodium tersebut. (Ismail, 1990). Pati
berwarna putih dan berbentuk serbuk tidak larut dalam air karena lapisan luar granulagranula yang terkandung di dalamnya tersusun amat rapat sehingga tidak tertembus oleh
air dingin. Pati tidak larut dalam air dingin karena ukurannya yang besar serta
membentuk dispersi koloid dengan air panas. Pati dapat dideteksi dengan larutan iod dan
dapat diubah menjadi glukosa dengan pemanasan air dan penambahan sedikit asam (HCl
atau H2SO4). Penggunaan iodine untuk reaksi terhadap pati untuk mengetahui adanya
amilum dalam suatu bahan pangan (Gaman & Sherington, 1994).

Enzim amilase ini juga banyak diproduksi oleh kapang. Kapang Aspergillus
dan Rhizopus merupakan jenis kapang yang banyak digunakan dalam produk
fermentasi seperti tempe, oncom, sake dan lain-lain (Andini, 1999). Kapang
tersebut mempunyai kemampuan tinggi dalam memproduksi enzim amilase yang
merupakan campuran dari -amilase dan glukoamilase (Andini,1999).
2. PENGUJIAN KUALITATIF ENZIM LIPASE
Pendahuluan
Lipase (triacyl glycerol acylhydrolase, EC. 3.1.1.3) adalah enzim yang
menghidrolisis triasilgliserol menjadi asam lemak bebas dan gliserol dan
mempunyai aktivitas maksimum pada daerah interface minyak dan air
(Brockerhoff dan Jensen, 1974).

Produk

hasil

hidrolisis yang

lain

adalah monogliserida dan digliserida. Jenis produk tersebut sangat ditentukan

oleh enzim lipase yang digunakan. Lipase mempunyai sifat yang berbeda antara
lain sifat spesifik terhadap posisi dan jenis asam lemak. Saat ini penggunaan
enzim lipase antara lain pankreas, susu, tanaman yang menghasilkan
trigliserida (seperti kacang, kedelai), kapang dan bakteri.
Berat

Molekul

lipase

berkisar

20.000-60.000. Sumber

lipase

akan

berpengaruh terhadap spesifisitas asam lemak, pH optimum dan thermostabilitas.

Stabilitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu dan waktu.

Reaksi hidrolisis

minyak dengan lipase harus mempertimbangkan suhu dan lama waktu reaksi agar
aktivitas enzim lipase dapat dipertahankan.
Berdasarkan

sifat

spesifisitasnya

Macrae

(1983)

membagi

enzim

lipase yang diisolasi dari mikrobia menjadi 3 kelompok :

1. Lipase yang menghidrolisis asam lemak secara acak terhadap posisi
asam lemak, contoh : Corynebacterium acne, Staphylococcus aureus.
2. Lipase yang menghidrolisis asam lemak pada posisi sn-1, dan sn-2. Contoh
: Lipase dari Aspergillus niger. Mucor miehei. Rhizopus arrhizus
3. Lipase yang menghidrolisis secara spesifik asam lemak
Contoh : Geotrichum candidum,

memiliki

spectrum

tertentu.

terhadap

asam

lemak rantai panjang.

Prosedur Kerja
Pengujian aktivitas enzim lipase dilakukan dengan metode titrimetrik. Sampel
yang telah diinkubasi dengan isolat, lalu dipindahkan ke tabung propylene.
Kemudian ditambahkan 25 ml buffer sitrat pH 6.0, divortex 15 menit dan
disentrifuse selama 15 menit pada 3500 rpm, suhu 4 - 5 C. Selanjutnya
mencampurkan sebanyak 2 gram minyak zaitun, 4 ml larutan buffer sitrat (pH 6),
1 ml supernatan enzim. Campuran dikultivasi pada shaker berpenggoyang pada
suhu 37C selama 1 jam. Setelah dikultivasi campuran substrat enzim
diinaktifkan dengan penambahan larutan aseton:alkohol (1:1) sebanyak 10 ml
kemudian dititrasi dengan NaOH 0,05 N dengan menambah 2 - 3 tetes
phenolphtalien 1% sebagai indikatornya. Aktivitas enzim lipase ditunjukkan
dengan perubahan warna. Perlakuan untuk kontrol supernatan diberikan setelah
kultivasi selama 1 jam. Penghitungan aktivitas enzim lipase dilakukan dengan
rumus berikut
Aktivitas hidrolisis lipase : (A-B) x N.NaOH x 1000
W x 60
Keterangan :
Satu unit aktivitas lipase adalah banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk
menghidrolisis minyak menghasilkan 1 mol produk selama 1 jam.
A : Volume NaOH untuk titrasi sample (ml)
B : Volume NaOH untuk titrasi blanko (ml)
N.NaOH : Normalitas NaOH yang digunakan
1000 : Faktor konversi dari mmol kemol
W : Berat sampel (mg) dan 60 : Waktu inkubasi (menit)
DAFTAR PUSTAKA
Andini, L. S. 1999. Seleksi Kapang Iradiasi Untuk Produksi Enzim Amilase Pada
Substrat Sagu. Sainteks Vol. VI No. 2.
Ismail, S.D. 1990. Nutrisi Dan Kesehatan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta
Riawan, S. 1990. Kimia Organik edisi 1. Binarupa Aksara: Jakarta

Sudarmadji, S; B. Haryono; & Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan dan

Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.
Tranggono & B. Setiaji. 1989. Biokimia Pangan. Gadjahmada University Press:
Yogyakarta.
Tim Dosen PS ITP THP FTP UB. 2012. Modul Praktikum Biokimia dan Analisis
Pangan. Universitas Brawijaya: Malang