Determinação da

actividade enzimática da
Fosfatase Alcalina
Elaborado por:
• Ana Carina Nogueira;
• Ana Cláudia Costa;
• Carla Saraiva;
• Melissa Alves.
 Fosfatase Alcalina
• Enzima que remove grupos fosfato de diferentes moléculas
(desfosforilação), principalmente os das extremidades 5’ do DNA,
impedindo a sua ligação com outras moléculas de DNA;

• É mais activa em soluções alcalinas;

• É produzida por diversos órgãos e tecidos. Nesta experiência, será

utilizada a da mucosa do intestino delgado do rato;

• A fosfatase alcalina é também utilizada em outras técnicas, como a

marcação radioactiva e ensaios de imunodetecção.
 Detecção da fosfatase alcalina

• A presença desta enzima é detectada pela reacção com o

substrato incolor p-nitrofenilfosfato (pNPP);

• Os produtos desta reacção são um grupo fosfato e p-nitrofenol,

cuja coloração é amarela, sendo assim detectado por absorvância a
405nm.
 Absorvância
• Quantidade matemática do processo de absorção da luz;

• É detectada usando um espectrofotómetro.

 Lei de Beer-Lambert
A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de Beer ou
lei de Beer-Lambert-Bouguer é uma relação empírica que, na Óptica,
relaciona a absorção de luz com as propriedades do material
atravessado por esta.
 Isto se pode expressar de distintas maneiras:

Onde:

• A é a absorção.
• Є é a constante de absortividade molar
(18500cm/M) .
• l é a largura da cuvete.
• c é a concentração.
 Cinética enzimática
• Iremos calcular velocidade máxima e constante de Michaelis-Menten (Km)

S1 + E ES1 ES2 E + S2
 Cinética enzimática (cont.)

• A vantagem do uso de gráficos lineares é a quantificação precisa de Km e

Vmáx através da extrapolação em linhas rectas em vez de assímptotas.
 Preparação de um extracto enzimático da
mucosa intestinal de rato

• Raspar a superfície interna do intestino do rato, para obter o extrato

enzimático
Determinação da actividade da fosfatase
alcalina a pH 8,5

• Preparar uma solução com Tris-HCl,

pNPP e NaCl;

• Medir a absorvância antes e depois de

adicionar a fosfatase alcalina, de modo a
verificar a sua acção;

• Representar graficamente os
resultados obtidos.
 Efeito da concentração de substrato na
actividade enzimática

• Preparar 12 tubos com diferentes concentrações de reagentes;

• Ler absorvância;

• Fazer os gráficos normal e inverso da cinética da reacção em estudo

e concluir sobre a mesma.