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11969295 Imunologia Basica e Aplicada a Analises Clinicas

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IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA ÀS ANÁLISES CLÍNICAS Prof. Sérgio Lisboa Machado Prof.

Raimundo Diogo Machado

IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA ÀS ANÁLISES CLÍNICAS Prof. Sérgio Lisboa Machado Prof. Assistente do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculda de de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Raimundo Diogo Machado Prof. Titular Aposentado do Departamento de Virologia do Instituto de Microbiolo gia da Universidade Federal do Rio de Janeiro I

Prefácio Esta publicação é uma atualização de um livro escrito pelo meu pai em 1992, e qu e já há muito tempo eu tentava publicar. No entanto, como a imunologia está semp re em constante renovação, muitas das vezes deixei de envia-lo a editora para ac rescentar mais um dado novo. Este livro deverá servir para profissionais que bus cam atualizar seus conhecimentos e mais do que repetir o que as bulas de nossos ensaios laboratoriais nos fazem repetir, ele procura fazer com que você tome con hecimento de como os ensaios se processam e o porque da não conformidade. Poderse-á observar, que esta publicação não é um livro, e sim uma coletânea dos melho res livros e trabalhos existentes nesta área, onde a literatura em língua portug uesa é escassa e, por isto mesmo fez-se mister lançar esta coletânea com os dado s mais atualizados e importantes ao profissional das análises clínicas. Espero q ue este agregado de informações seja bem aproveitado, assim como foi a publicaçã o de meu pai, que muito contribuiu em minha formação profissional, e que por iss o contribua também na de vocês caros leitores. Espero que esta publicação não se ja a última e sim uma das que venham a incentivar o mercado a produzir novas pub licações do mesmo gênero e desmistificar o “terror” como a imunologia se apresen ta aos estudantes e profissionais da área da saúde. Façam bom proveito, Prof. Sérgio Lisboa Machado e Prof. Raimundo Diogo Machado II

SUMÁRIO Defesas inatas do organismo Tipos de imunidade Mecanismos da imunidade Respostas imunes adaptativas Resposta imune humoral Via clássica do complemento As imunog lobulinas Anticorpos monoclonais Síntese das imunoglobulinas Reações mediadas po r células Regulação da resposta imune O fenômeno da tolerância Reações de hipers ensibilidade Hipersensibilidade tipo I Hipersensibilidade tipo II Teste de Coomb s Pesquisa de anticorpos irregulares Hipersensibilidade tipo III Conglutinação e imunoconglutinação Imunoconglutininas Hipersensibilidade tipo IV Hipersensibili dade de contato Reação tuberculínica Hipersensibilidade granulomatosa Doenças au toimunes 1 7 8 9 9 14 18 21 22 26 31 34 37 38 41 47 49 50 56 57 58 58 60 61 64 III

Lupus eritematoso sistêmico (LES) Artrite reumatóide Tiroidite de Hashimoto Doen ça de Graves´ Diabetes insulino dependente Esclerose múltipla Miastia gravis Sín drome de Goodpasture Reações imunológicas a vírus Imunidade a bactérias Imunidad e a fungos Resposta imune a parasitos Princípio dos imunoensaios Detecção indire ta de imunocomplexos Controle de qualidade nos imunoensaios Validação de um ensa io Outras medidas para garantir qualidade Interferências nos imunoensaios Reaçõe s cruzadas e analitos heterogêneos Reduzindo as reações cruzadas Anticorpos hete rófilos e anticorpos para animais Reconhecendo e reduzindo a interferência dos a nticorpos endógenos Interferências devido a antígenos que mascaram a reação Inte rferências com o mecanismo indicador Efeitos matriz 66 70 71 72 73 74 75 75 76 79 83 84 93 99 101 102 106 108 110 111 113 116 118 118 119 IV

Ensaios de aglutinação Ensaios de dispersão de luz Neflometria Turbidimetria Apl icações da neflometria e turbidimetria Fatores que afetam a performance dos ensa ios Teste de Paul Bunnel & Davidsohn e monoteste Teste do látex Teste de WaalerRose Teste de fixação do complemento Teste para avaliação da via clássica do com plemento (CH50) Teste para avaliação da via alternada do complemento (AH50) Anti estreptolisina O (ASLO) Teste de neutralização Teste de difusão em gel Teste da DRS Teste da dupla difusão Imunoeletroforese ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Imunofluorescência Quimioluminescência Teste de Western blot 120 124 125 127 128 130 130 133 134 136 147 150 151 155 158 159 160 162 163 170 176 178 V

DEFESAS INATAS DO ORGANISMO Chamamos de defesa inata aquela que nasce com o indi víduo, é ela que age como primeira barreira para tentar evitar que um agente inf eccioso, por exemplo, ao entrar no organismo consiga se replicar e propagar. No entanto nem sempre a resposta inata é suficiente para fazer este bloqueio e aí, quem toma parte neste processo é o sistema imune adaptativo que leva algum tempo até que atinja sua eficiência máxima e consiga evitar a propagação do agente in feccioso. Além disso o sistema de resposta imune adaptativo tem importante papel na reinfecção pelo mesmo agente, pois aí sua resposta é mais rápida no combate ao mesmo, isto se deve a chamada “memória” do sistema imune. No sistema de respo sta inato, temos a participação por exemplo, de fatores solúveis como lisozima e o sistema complemento (principalmente a via alternada deste), e da participação de células fagocitárias. Já no sistema adaptativo temos principalmente a ação d e mecanismos dependentes de linfócitos B que darão início a produção de anticorp os e a coordenação da atividade e supressão ligada principalmente aos linfócitos B. São os linfócitos os responsáveis pela memória do sistema imune, uma vez ati vados eles conseguem estabelecer uma resposta específica e rápida quando ocorre uma reinfecção. A fim de compreender melhor a imunologia devemos ter noção de al guns conceitos básicos que determinam se um indivíduo possa se infectar ou não: • REFRATARIEDADE - É um fenômeno inato, inespecífico e invariável que impede que uma pessoa se infecte por determinados microrganismos. Nestes casos, mesmo que variem as condições intrínsecas e extrínsecas do indivíduo, este não adquire det erminadas infecções. Como exemplo existem microrganismos que infectam os animais e jamais infectam o homem. O vírus da Bouba aviária, o vírus da peste suína clá ssica, o vírus da peste suína africana que são virulentos para a galinha e o por co respectivamente, jamais infectam o homem. As células humanas não possuem rece ptores para estes vírus. Do mesmo modo, certas doenças infecciosas humanas, não são reproduzidas em certos animais. Os vírus do sarampo, da caxumba e da rubéola não infectam as aves, o cão o gato e outros animais. • RESISTÊNCIA - É um fenôm eno inato, inespecífico e variável, e a variação vai depender das condições intr ínsecas e extrínsecas de cada indivíduo e também da biologia do agente infeccios o. Como exemplo, tem-se o Mycobacterium tuberculosis, que na maioria das vezes i nfecta o homem, sem lhe causar danos e este, pelas suas defesas fique em estado latente, permanentemente, ou por um longo período. Se houver problemas imunológi cos por um conjunto de variáveis como infecções em que haja destruição da defesa celular, administração de certos medicamentos, como corticosteroídes, desnutriç ão, o Mycobacterium em fase latente pode reativar causando a tuberculose doença. Um exemplo de doença destruindo a resistência é a SIDA. O HIV, além de destruir o principal linfócito, o T4, produz uma série de outros distúrbios causados por outros microrganismos tidos como normais. 1

• IMUNIDADE - É um fenômeno nato, específico e não raro sofre variação, principa lmente quando há um desequilíbrio da imunidade celular. A infecção pelo HIV é um exemplo clássico dessa alteração. A imunidade é realizada pelo sistema imune ad aptativo, ou seja é realizado por células específicas para este fim. • IMUNIDADE INATA - Muitos mecanismos eficazes podem proteger o indivíduo de infecções por microrganismos altamente patogênicos, independente de qualquer contato prévio co m os agentes etiológicos. Estes mecanismos tão eficientes impedem a ação de dife rentes microrganismos. Toda defesa parece ser controlada geneticamente e há uma diferença de espécie para espécie e mesmo intra espécie, com variações menores p ara um mesmo indivíduo. Para um mesmo agente etiológico há variações na sensibil idade de diferentes indivíduos. A galinha é altamente susceptível ao vírus da bo uba, entretanto, qualquer mamífero é totalmente resistente, e mesmo as aves de e spécies diferentes são também resistentes. Outro exemplo é a resistência dos fel inos e caninos ao vírus Influenza A, entretanto este infecciona e produz doença com facilidade em aves, suínos e equinos. Determinantes ambientais podem fazer a parecer desde o início da vida uma imunidade adquirida que induz um mecanismo de resistência a certas infecções. Com relação a esta resistência temos, por exemp lo a grande sensibilidade da população indígena às várias doenças do homem civil izado. Aquela população é muito mais sensível ao sarampo, à gripe, à tuberculose do que o homem civilizado. A imunidade inata é correlacionada a um grande númer o de determinantes. Estes podem ser específicos do hospedeiro, tais como: espéci es e raças, fatores genéticos individuais, idade, variação hormonal, nutrição. T ambém, é importante a participação de determinantes físicos como: pele, mucosas, superfícies úmidas como é o caso dos olhos, sítios anatômicos que retêm a poeir a e os microrganismos, etc. Aliado a estes determinantes, temos substâncias quím icas como secreções diversas com atividade antimicrobiana, e as enzimas e os pol ipeptídeos básicos que são substâncias com atividade bactericida ou bacteriostát ica. A própria fagocitose com sua clássica digestão, é um fenômeno inespecífico. A imunidade está diretamente relacionada às raças, às espécies e às famílias. C omo exemplo citamos a hereditariedade, que está relacionada à resistência de det erminadas famílias cujos membros são muito sensíveis à tuberculose, contrastando com o que normalmente acontece com a população humana em geral. Também temos a idade como fator de alteração na resposta inata, geralmente as crianças recém-na scidas são sensíveis a uma variedade de agentes infecciosos e tal sensibilidade está ligada à deficiência imunitária, por incapacidade do sistema linfóide reagi r aos antígenos estranhos. Na velhice, os determinantes também desempenham anorm alidades de resistência, ficando as pessoas mais sensíveis aos agentes estranhos diversos. 2

A nutrição é outro fator de alteração marcante na variação da resistência. A sub nutrição de animais de laboratório acarreta uma leucopenia e a atividade fagocit ária diminui, induzindo o aparecimento de infecções diversas. Por outro lado, a resistência inata pode variar com o agente etiológico. Sabe-se que o vírus da po liomielite prefere as crianças bem nutridas, enquanto que as crianças desnutrida s são mais resistentes a este vírus. O contrário acontece com o vírus do sarampo que infecta a criança desnutrida produzindo processos infecciosos graves. Nas c rianças bem nutridas a doença produzida por este vírus é mais suave. Fazem parte da imunidade inata, as barreiras mecânicas e químicas conforme já citado anteri ormente. A pele integra é um obstáculo a um grande número de agentes infecciosos . A camada de queratina contribui muito para esta eficiente barreira. As mucosas contendo secreções, células ciliadas com seus movimentos característicos remove m os microrganismos e as enzimas oferecem efeitos bloqueadores. No estômago, o s uco gástrico, pelo seu pH, tem ação bactericida sobre bactérias Gram negativas e Gram positivas. Logicamente umas poucas espécies de bactérias como o Mycobacter ium tuberculosis e o Helicobacter pylori resistem a esse pH e podem até coloniza r na mucosa estomacal. Na pele, as secreções sebáceas e sudoríparas contém ácido s graxos com propriedades bactericida, fungicida e viruscida. Na cavidade oral e nos olhos encontra-se a lisozima, proteína básica de baixo peso molecular, enco ntrada em alta concentração nos polimorfonucleares e com capacidade de hidroliza r os glicopeptídeos da parede de muitas bactérias Gram negativas, resultando em lise das mesmas. Menor ação é exercida sobre Gram positivas. Quando os microrgan ismos conseguem vencer as barreiras naturais temos o processo inflamatório em qu e, no decorrer deste, há lesão de um grande número de células, liberando vários tipos de proteínas básicas. Incluem-se, entre estas as esperminas e as espermidi nas que destroem o Mycobacterium tuberculosis e o Staphylococcus aureus. Além de stas, são liberadas, também, proteínas básicas com alto teor de lisina e arginin a, com função bactericida. Os Fagócitos Os fagócitos são células especializadas na captura de microrganismo s e substâncias estranhas ao organismo e, devido a sua especialidade são também chamados de fagócitos profissionais. Estes fagócitos são formados por dois princ ipais grupos celulares que compreende os grandes macrófagos e os pequenos granul ócitos polinucleares. Os granulócitos polinucleares também são chamados de polim orfos ou neutrófilos, baseado nas propriedades que tem ao terem seu citoplasmas corados. Os macrófagos tem origem na medula óssea como promonócitos os quais ao amadurecerem circulam no sangue como monócitos e por fim se transformam em macró fagos, se espalhando pelos tecidos. Estes macrófagos estão presentes por todo o tecido conectivo e estão associados a membrana basal de pequenos vasos. Eles est ão concentrados em órgãos como pulmões (macrófagos alveolares), fígado (células de Kupfer), na periferia dos seios medulares dos linfonodos, nos sinusóides do b aço, tudo isso com a finalidade de atuar como uma barreira filtrante à entrada d e microrganismos. Em geral 3

os macrófagos são células de vida longa e que dependem da mitocôndria para retir arem sua energia, apresentam ainda um retículo endoplasmático extremamente rugos o devido a grande quantidade de proteínas secretórias que esta célula produz e l ibera. Os polimorfonucleares são as células encontradas em maior quantidade dent re os leucócitos, assim como os macrófagos, se originam de uma mesma célula toti potente na medula óssea. Estas células não possuem mitocôndria, mas faz uso de s eu glicogênio citoplasmático (que é abundante) estocado justamente para servir d e fonte de energia. A glicólise que estas células realizam permite que elas trab alhem em condições de anaerobiose, como as que ocorrem num processo inflamatório . Outra característica dos polimorfonucleares, é que são células que não se divi dem e possuem um tempo de vida curto (algo entre 24 e 72 horas), apresentam um n úcleo segmentado, seu citoplasma se caracteriza pela presença de grânulos azuróf ilos, que contém mieloperoxidase, lisozima e proteínas catiônicas, grânulos secu ndários específicos que contém lactoferrina e lisozima associadas e grânulos ter ciários, que contém as hidrolases ácidas. De modo geral, podemos dizer que os po limorfonucleares são a defesa contra as bactérias piogênicas enquanto que os mac rófagos atuam melhor contra microrganismos intracelulares. O processo de fagocit ose pelas células fagocitárias envolve primeiro a adesão do microrganismo a supe rfície celular destas células. Esta adesão envolve o reconhecimento de carbohidr atos do microrganismo e, uma vez aderido e identificado como estranho, o microrg anismo é iniciada a ingestão, ativando o sistema de contração de actina e miosin a o qual faz com que o citoplasma celular vá envolvolvendo a partícula estranha até que esta fique dentro de um vacúolo (fagossomo). A etapa seguinte nesse proc esso é a liberação de substâncias que tentarão destruir esta partícula ingerida. Nessa etapa há um grande consumo de oxigênio pela célula resultando no aumento do desvio da atividade da hexose monofosfato. Isto gera NADPH e reduz o oxigênio molecular através da sistema da membrana citoplasmática de citocromos dando ori gem a uma serie de agentes microbicidas poderosos, chamados de anion superóxido, peróxido de hidrogênio, e radicais hidroxila. O peróxido formado, em associação com a mieloperoxidase da origem a um potente sistema de halogenação que é capaz de destruir tanto bactérias como vírus. Assim que o anion superóxido é formado, a enzima superóxido desmutase atua de forma a converter o superóxido em oxigêni o molecular e peróxido de hidrogênio, consumindo durante este processo ions hidr ogênio. Deste modo há inicialmente um aumento do pH, facilitando a ação anti bac teriana das proteínas catiônicas oriundas dos grânulos dos fagócitos. Estas molé culas são capazes de lesar a membrana microbiana devido a ação da catepsina G e pela aderência direta a membrana microbiana. Outros fatores oriundos dos grânulo s são a lactoferrina e intermediários nitrogenados como o óxido nítrico, através de sua capacidade de se complexar ao ferro, privando a bactéria de um elemento essencial ao seu crescimento, e a lisozima que destroí a proteinaglicana da pare de celular bacteriana. Deste modo o pH vai caindo de modo que os microrganismos que estão mortos ou 4

morrendo vão sendo degradados pelas enzimas hidrolíticas. Assim que o processo t ermina os produtos resultante desta degradação são liberados para o exterior da célula. Como a fagocitose depende da adesão celular a membrana do fagócito, está claro que deve haver um mecanismo que permita mobilizar um maior número de célu las para o local de entrada do agente estranho. No caso das bactérias estas prod uzem substâncias como a formil metionina a qual atrai os leucócitos, no entanto este é um sinal ainda fraco, e existe um complexo mais eficiente realizado por n osso próprio organismo que é a ativação da cascata do complemento (principalment e a via alternativa). O complemento tem a propriedade de disparar o estímulo nec essário a ativação de uma cascata que termina por destruir o organismo estranho e atrair células fagocitárias para o local onde o microrganismo está. O principa l elemento da cascata do complemento é o C3, e a sua clivagem dá inicio a via al ternativa do complemento. O C3 entra em ativação expontânea em pequenas concentr ações gerando uma nova molécula a C3b, a qual é capaz de se complexar com o fato r B e interage com o fator D presente no plasma dando origem a enzima C3bBb (C3 convertase), esta por sua vez dá um feedback positivo aumentando a amplificação da resposta ao produzir novas moléculas de C3b. No entanto todo este processo é regulado por mecanismos que bloqueiam a ação da C3 convertase, a quebrando em no vas moléculas menores e sem ação sobre a C3. Na presença de certas moléculas com o carbohidratos presentes na superfície de bactérias o C3b gerado pela C3 conver tase, pode aderir e se tornar estável à uma nova quebra, não perdendo assim sua ação. É nessa situação que ela atua ativando a via alternativa do complemento. N esta ativação uma grande quantidade de C3b, e logo se adere a membrana do micror ganismo de forma covalente, isto termina por conferir a propriedade opsonizante desta fração do complemento. Esta opsonização faz com que as células fagocitária s reconheçam o organismo estranho com maior facilidade e assim o fagocitem com m aior rapidez. O C3b junto com a C3 convertase consegue atuar sobre o fator C5 do complemento o quebrando em C5a e C5b. O C5a junto com C3a atuam sobre os mastóc itos os fazendo degranular, conseqüentemente há a liberação de fatores quimiotát icos e de mediadores da permeabilidade vascular. Estes mediadores da permeabilid ade vascular aumentam a permeabilidade através da modificação das forças interce lulares entre as células endoteliais da parede dos vasos. Isto não só permite a exudação do plasma como permite que elementos constituintes deste como o complem ento chegue ao sítio da infecção. Estes mediadores também promovem a ativação de moléculas como a ICAM-1 (molécula 1 intracelular de adesão) e ELAM-1 (molécula 1 endotelial de adesão leucocitária) as quais se ligam moléculas específicas dos polimorfonucleares e permitem que estas passem entre as paredes dos capilares. Por outro lado os fatores quimiotáticos, atraem os leucócitos polimorfonucleares marginais de sua localização intravascular, através da parede dos vasos e event ualmente os conduzem até os microrganismos opsonizados. Os polimorfonucleares po ssuem um receptor específico para C3b em sua membrana e por isso aderem rapidame nte e firmemente ao microrganismo opsonizado. 5

O processo de dilatação dos capilares (eritema), exudação das proteínas plasmáti cas e do fluído plasmático (edema), devido a alteração hidrostática e osmótica, e ao acúmulo de neutrófilos é que dão origem a resposta inflamatória aguda. Além da atuação da fração C5a do complemento temos a continuação da cascata do compl emento com o C5b que também adere a membrana do microrganismo, ao lado de C3b. A pós a adesão de C5b temos a adesão de C6, C7 e C8 que forma um complexo capaz de já dar início a lesão da membrana celular, com a adição de alguns componentes C 9 temos então a formação do complexo de ataque a membrana (MAC) que leva a lise do microrganismo por perfurar a membrana. Fazendo parte desta resposta imune ina ta, temos ainda as proteínas de fase aguda, como a Proteína C Reativa, que tem s ua concentração aumentada em decorrência da liberação de mediadores de sua sínte se tais como a interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6) e do Fator de Necros e Tumoral (TNF). Estes mediadores são liberados como consequência da injúria cel ular. Existem ainda outros fatores antimicrobianos extracelulares presentes no p lasma como a lactoferrina, que forma um complexo com o ferro e o torna indisponí vel à bactéria que costuma utiliza-lo como fator de crescimento. Temos também os interferons (IFN), mais conhecidos por ter ação antiviral, por interferirem com o processo de adesão viral à uma célula e, por vezes não permitindo que mais de um vírus infecte uma célula já parasitada por um vírus. Os leucócitos produzem vários tipos diferentes de α-IFN, enqu nto os fibrobl stos e pr tic mente todos os tipos celul res sintetiz m o β-IFN. Um terceiro tipo de interferon, o γ-IFN n ão é um componente da resposta imune inata. Quando as células são infectadas por um vírus, elas produzem e secretam interferon o qual se li a a receptores espec íficos nas células adjacentes. O interferon, uma vez li ado a uma célula não inf ectada exerce atividade antiviral ao facilitar a síntese de enzimas que interfer em com o mecanismo de replicação viral. Ainda fazendo parte da resposta imune in ata encontramos um rupo de células chamadas de Células Natural Killer ou NK (ma tadoras naturais), estas células possuem atividade citotóxica. Na verdade as NK são randes linfócitos ranulares que se li am, provavelmente a licoproteínas, que aparecem na superfície de células infectadas por vírus e al umas células tum orais. Uma vez li ada a célula alvo as NK li eram o conteúdo de seus rânulos. P arece que o elemento citotóxico mais importante li erado são as perforinas, que possuem uma ação parecida com o elemento C9 do complemento uma vez que é capaz d e fazer furos na mem rana da célula alvo e assim a leva a citólise. Ainda com me nor participação temos os eosinófilos, que parecem ser os fa ócitos com especifi cidade para a entes parasitários como os helmintos. Os eosinófilos possuem rânu los em seu citoplasma que tem a propriedade de se corar com corantes ácidos. Est as células tam ém possuem receptores para o elemento C3 do complemento, uma vez feita a adesão do eosinófilo com o parasito ocorre a li eração de proteínas cap azes de lesar a mem rana do mesmo e ainda promover uma destruição maior devido a li eração de meta ólitos do oxi énio que contri uem nesta destruição. 6

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TIPOS DE IMUNIDADE Sempre que ultrapassadas as arreiras inespecíficas pelos a e ntes infecciosos, estes vão induzir novos mecanismos de defesa, na maioria das v ezes muito mais eficientes do que as diferentes modalidades que vimos anteriorme nte. Este conjunto denomina-se estado de imunidade. A imunidade pode ser ativa e passiva, su dividindo-se cada uma destas modalidades em natural e artificial. I MUNIDADE ATIVA: É aquela em que o indivíduo rece e o antí eno e o or anismo tem que tra alhar para formar a sua defesa, isto é, a imunidade humoral mediada por anticorpos e a celular mediada por células. IMUNIDADE ATIVA NATURAL: É aquela ad quirida pela infecção natural. Ex.: sarampo, caxum a, mononucleose. IMUNIDADE AT IVA ARTIFICIAL: É aquela induzida pela vacina, a qual pode ser constituída por m icror anismos atenuados como a vacina da tu erculose, anti-pólio, anti-sarampo e anti-fe re amarela; vacinas inativadas como a vacina anti-rá ica, anti-coquelux e, anti-salmonelose; e vacinas constituídas por toxoídes ou frações de micror an ismos como a para difteria e tétano (toxóides), adenovirose, (hexon isolado do A denovírus). Atualmente, há outra modalidade de vacinas que são proteínas clonada s muito específicas. Como este exemplo, temos a vacina contra a Hepatite B, prod uzida numa levedura pelo processo do DNA recom inante. IMUNIDADE PASSIVA: É aque la resultante dos anticorpos pré-formados. Neste caso a imunidade é por pouco te mpo. IMUNIDADE PASSIVA NATURAL: É o tida através de anticorpos da mãe (I G) que atravessam a placenta para o feto ou através do colostro, nos primeiros dias de amamentação. IMUNIDADE PASSIVA ARTIFICIAL: É adquirida pela inoculação de antico rpos pré-formados em outro animal. Como exemplo, temos a soroterapia contra raiv a, anti-ofídica, anti-tetânica e antidiftérica. Estes antissoros são o tidos em cavalos e após purificação são usados para imunização. É um processo efémero de proteção, durando de um a 4 meses, no máximo. IMUNIDADE ADOTIVA: É uma imunidade especial adquirida pela transferência de células (suspensão de linfonodos, aço , medula óssea), provenientes de doadores imunizados que são aceitos como histoc ompatíveis. MECANISMOS DA IMUNIDADE Os mecanismos da defesa or ânica contra as infecções pod em ser discriminados da se uinte forma: a) Imunidade humoral (anticorpos) a.1) A ntitóxica 7

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a.2) Antimicro iana

IMUNIDADE ANTITÓXICA: Este tipo de imunidade é típico das toxi-infecções tais co mo tétano e difteria, nos quais os micror anismos causadores atuam por seu poder toxi ênico afetando as células do or anismo hospedeiro. IMUNIDADE ANTIMICROBIAN A: A imunidade humoral antimicro iana é em exemplificada pela defesa específica que se esta elece no decurso da pneumonia lo ar pelo Streptococcus pneumoniae e na menin ite causada pela Neisseria menin itidis. Quaisquer destes ermes trans pondo as arreiras defensivas do trato respiratório, invadem os alvéolos de dete rminado se mento rônquico onde se implantam e se multiplicam. Daí por diante se ue uma sequência de eventos semelhantes aos que se desenvolvem no processo infl amatório, em que os capilares se distendem e o plasma filtra através de suas par edes, derramando para o interior dos alvéolos pulmonares. Fa ócitos, inicialment e, polimorfonucleares e depois macrófa os afluem em rande quantidade formando u m exudato espesso tornando maciço o conteúdo alveolar, impossi ilitando a respir ação. IMUNIDADE CELULAR: O a ente etioló ico de infecções pode multiplicar-se de ntro dos macrófa os. Nestas condições o anticorpo não pode atin i-lo, esta elece ndo a imunidade através de linfócitos efetuadores, que determinam uma “ativação” dos macrófa os, causando uma destruição do a ente infeccioso intracelular. Em i nfecções como a tu erculose, a lepra, a rucelose e as viroses, em eral é esta elecido um quadro de equilí rio entre o hospedeiro e o a ente infeccioso, persis tindo este no or anismo em focos de infecção latente ou crônica. Bem diferente d a imunidade humoral, a imunidade celular não pode ser transferida, passivamente, com soro imune, mas sim com células linfóides (imunidade adotiva) de animal so revivente à infecção com micror anismo virulento ou vacinado com a ente atenuado . Exemplo típico encontramos na vacina BCG ou nas vacinas virais atenuadas, como a da fe re amarela, da poliomielite, etc. A rande importância da imunidade cel ular é evidenciada nas viroses, nas quais o vírus que é um a ente intracelular, é destruído onde o anticorpo não é capaz de penetrar. Este fato mostra que os an ticorpos sistêmicos ou locais não tem papel relevante nas infecções virais. Este s anticorpos são incapazes de impedir a propa ação do vírus por conti uidade cel ular. Estes anticorpos tem a função mais de neutralizar os vírus, impedindo sua disseminação hemato ênica, como é o caso do vírus da pólio. 8

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) Imunidade celular

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RESPOSTAS IMUNES ADAPTATIVAS O sistema imune adaptativo existe como uma forma de loqueio aos micror anismos que tenham conse uido escapar do ataque promovido p elo sistema inato. Sa emos que isto ocorre porque temos micror anismos mutantes que não ativam a via alternativa do complemento, al uns micror anismos tam ém ao serem capturados pelos macrófa os desenvolvem reações que são capazes de neutra lizar as su stâncias li eradas no vacúolo, vírus que são insensíveis a ação das células NK (natural killer) e vírus que quase não estimulam a produção celular d e interferon, deste modo não havendo a comunicação célula a célula capaz de evit ar a propa ação viral. Uma das principais proteínas sintetizadas nesta defesa im une adaptativa são os anticorpos os quais são sintetizados pelos linfócitos B, m ais especificamente pelos Plasmócitos. A síntese destes anticorpos só ocorre se houver um estímulo feito pelo antí eno ao linfócito B ou se este for estimulado pelos linfócitos T. Cada anticorpo possui um sítio de reconhecimento, que se enc aixa e amolda no antí eno, e isto faz com que a li ação do anticorpo ao antí eno seja mais forte ou mais fraca dependendo da especificidade da molécula de antic orpo. Os anticorpos possuem ainda outros sítios, necessários para diversas funçõ es como a ativação da via clássica do complemento, li ação a células fa ocitária s e células apresentadoras de antí enos. Deste modo, quando um antí eno está rec o erto por moléculas de anticorpo, estes são capazes de induzir a fixação do com plemento e a fa ocitose. AS BASES CELULARES RESPOSTA IMUNE HUMORAL O papel primário do sistema imune humo ral é de eliminar or anismos e iomoléculas estranhas, com o auxílio de proteína s próprias e células. Isto é realizado pela li ação de alo e autoantí enos às im uno lo ulinas. A resposta su sequente inclui a ativação do complemento e ou os s istemas celulares da resposta imune o que eventualmente leva a fa ocitose e dest ruição da célula alvo, vírus ou proteína. Para que este mecanismo funcione é nec essário que o sistema imune reconheça uma rande variedade de antí enos “não sel f” (estranhos ou aloantí enos), normalmente em aixas concentrações. Quando isto não ocorre denominamos de inunodeficiência. Além disso o sistema imune deve res ponder de forma eficiente aos aloantí enos sem que isso leve a uma super reativi dade aos antí enos próprios (perda da tolerância levando a doença autoimune), ou a resposta indevida levando a estimulação imune (produção de I E levando a aler ia). Além disso deve ocorrer a supressão da resposta imune quando a “limpa” do or anismo já tiver sido efetuada. A re ulação do sistema imune é tam ém realizad a pelo contato celular e mecanismos que dependem das citocinas para serem estimu lados ou suprimidos. Os caminhos que a resposta toma depende dos tipos de leucóc itos envolvidos, tipos de antí enos de mem rana que entram em contato e citocina s li eradas. 9

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A apresentação de antí enos A fim de tornar simples o modo eral de apresentação de antí enos ao sistema imune, podemos dizer que existem dois rupos celulares, um expressando o Antí eno de Histocompati ilidade (MHC) de Classe I, que está presente em todas as células do or anismo, e outro rupo apresentando o MHC de Classe II, que é encontrado nas células apresentadoras de antí eno. Podemos dizer que as células com o MHC de cl asse I são responsáveis pela apresentação de antí enos endó enos, como vírus e a l uns marcadores tumorais produzidos dentro da célula afetada, e que as células com o MHC de classe II fazem a apresentação de antí enos exó enos como actérias e toxinas. As células expressando o MHC de classe I, em eral fazem o processam ento da se uinte forma: primeiro elas pe am as proteínas produzidas por elas no citossol ou endó enamente, as que ram em peptídeos (8 a 12 aminoácidos) pelos sp liceossomas e então são enviadas ao Retículo Endoplasmático (RE), através de mol éculas de transporte associadas a proteína. No RE, os peptídeos são li ados as m oléculas do MHC de classe I ativas e são transportadas via Complexo de Gol i, a superfície celular. Uma vez na superfície celular, o complexo MHC classe I + ant í eno, se li am a células T CD8+, o que leva a uma resposta mediada por células do tipo citotóxica. Quanto as células que expressam o MHC de classe II, elas faz em a captura do antí eno exó eno por endocitose. O antí eno é em se uida transpo rtado para o lisossomo, onde então é de radado em peptídeos, os quais serão li a dos a moléculas de classe II específicas. O complexo MHC de classe II + antí eno é então exposto na superfície celular, onde então irá se li ar a linfócitos T C D4+ que darão início a resposta imune humoral (produção de anticorpos). (McDonne l,W.M., 1997) Células Apresentadoras de Antí enos (APC) Os plasmócitos, são célu las oriundas da diferenciação dos linfócitos B e tomam parte na resposta humoral a partir do momento que estão envolvidas na monta em de imuno lo ulinas, no ent anto, as Células Apresentadoras de Antí enos (APC) e os linfócitos T são necessá rios para o estímulo e controle da produção de anticorpos. Os leucócitos fa ocit ários podem ser divididos em duas classes funcionais: os macrófa os/monócitos e as APC, elas são responsáveis pela eliminação de produtos estranhos ao or anismo assim como de moléculas próprias. Aparentemente, os macrófa os não são ons em reprocessar os antí enos para a apresentação ao sistema imune, eles apresentam e m sua superfície um rande número de receptores para re ião Fc das imuno lo ulin as (FcR) e para o fator C3 do complemento (auxiliando no reconhecimento de célul as reco ertas com anticorpo ou complemento), possui tam ém em menor quantidade m as em concentrações variáveis os antí enos de histocompati ilidade (HLA ou MHC) e outras moléculas de adesão celular como a CD54 e CD58. As APCs são muito menor es em número do que os macrófa os e não fa ocitam células e antí enos, ao invés disso elas capturam e processam o antí eno, apresentando os fra mentos em sua su perfície celular em conjunto com os antí enos de histocompati ilidade celular de Classe I e II (MHC), principalmente os de Classe II. As APCs mi ram para as zon as do tecido linfóide de células T 10

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e B, e apresentam os antí enos as células efetoras e moduladoras do sistema imun e (células T, B e NK). Tam ém temos as células dendríticas que formam uma espéci e de pseudopodo os quais podem se estender e aumentar a área de contato com os l infócitos T e B. Isto tudo em conjunto com as moléculas de mem rana e citocinas são os responsáveis pela ativação específica da resposta imune. No lifonodo temo s a divisão das APC em células dendríticas, que apresentam antí eno, via MHC de Classe II ao linfócito T CD4+, e células foliculares dendríticas, as quais apres entam o antí eno no centro erminativo dos linfócitos B. As células B tam ém pod em funcionar como APCs. As células dendríticas são leucócitos, derivados de perc ursores próximos do CD34. As citocinas são importantes em sua maturação, como o Fator de Necrose Tumoral α (TNFα) e F tor Estimul dor de Colôni s de Gr nulócito s e M cróf gos, no desenvolvimento d s célul s dendrític s, enqu nto bloquei m o crescimento de m cróf gos. As célul s dendrític s e su s v ri ntes, como s cél ul s de L ngerh ns, são encontr d s n pele, v sos linfáticos ferentes, s ngue e outros tecidos não linfóides. Nos tecidos linfoídes, s célul s dendrític s sã o norm lmente encontr d s n região interfolicul r. As célul s dendrític s, norm lmente não possuem um número signific tivo de receptores p r C3 ou p r regi ão Fc d IgG (Fcγ), mas são ricas em moléculas de MHC da classe I e II assim com o em moléculas de adesão do tipo CD2, CD11c, CD29, CD54 e CD58. Tam ém, para fac ilitar o contato com os linfócitos T e seu estímulo, expressa as moléculas CD40 e B7 na mem rana. As células dendríticas foliculares são APCs localizadas no fol ículo primário (não estimuladas) e folículo secundário (estimuladas). Apesar des tas áreas serem ditas zonas de células B, elas apresentam uma minoria de células T, macrófa os e APCs. As APCs ricas em receptores de Fcγ as quais li am e apres entam o antí eno as células B inativas e ativas. As células dendríticas folicula res podem se urar este antí eno por semanas, provavelmente desempenhando um pape l importante na manutenção da resposta imune, por estimular células B novas e de memória. O papel de ativação das APCs nos linfócitos T pode ser dividido em dua s fases: o estímulo das células T inativas (reposta primária) e a ativação de cé lulas T de memória (resposta secundária). Am as as células dendríticas, e em peq ueno número as células B, podem apresentar antí enos aos linfócitos T. A apresen tação efetiva por am as, não apenas requer o complexo de MHC, mas outro fator es timulatório como o contato célula a célula e a li eração de citocinas. Finalment e as células B tam ém servem como células apresentadoras de antí enos, isto foi provado in vitro. As células B expressam o MHC de Classe II, e tem um receptor e specífico para antí enos (imuno lo ulinas). Estas células B capazes de estimular linfócitos T de uma maneira antí eno específica, são células B7+, isto é import ante sa er pois as células B em repouso (não ativadas), não possuem as proteínas co-estimulatórias de li ação, necessárias para ativar as células TH. Quando tem os muitas células B7-, as células TH se tornam incapazes de responder ao estímul o imune, 11

 

     

       

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e isto leva a suspeita de que tais células B7- sejam a s responsáveis no papel d e indução a tolerância ou aner ia a antí enos próprios. As células dendríticas a presentam o complexo HLA+A (MHC II + A ) ao receptor de célula T (TCR), de form a que há o reconhecimento simultâneo, da célula T reconhecendo o HLA e a célula dendrítica o TCR, ocorrendo assim a li ação entre elas e a su sequente resposta intracelular com a li ação posterior do CD4 ao MHC de classe II ou do CD8 ao MHC de classe I. No entanto, se apenas a li ação TCR/CD4(8) e o antí eno/MHC II(I) ocorre, parece que a célula T se torna incapaz de responder ou se tornar anér ic a. Na verdade esta é uma forma de induzir a tolerância a antí enos próprios, esp ecialmente para as células TH Th1. A ativação efetiva das células T pelas APC re querem a co-estimulação pelo antí eno B7 das células dendríticas ou dos linfócit os B li ando seus antí enos CD28 ou CTLA-4 à célula T. Quando as células T são e stimuladas deste modo, elas passam a coexpressar um li ante (CD40L ou T-BAM) par a o antí eno de células B CD40. Apenas quando estes contatos co-estimulatórios o correm é que a ativação da célula T ao antí eno ocorre. As células T O antí eno TCR (Recptor de Células T) é um dos mem ros da superfamília das imuno lo ulinas só que, diferentemente das imuno lo ulinas, o TCR é composto de uma su unidade a lfa e eta (α e β). Uma pequena fração das células T expressam uma outra coleção de produtos ênicos do TCR, que são a delta e a ama (δ e γ). Assim como as imu no lobulinas, são necessárias moléculas acessórias para transferir o sinal e li ação o antí eno ao TCR para entro a célula. As moléculas acessórias mais imp ortantes para esta ativação as células T são os complexos B7-CD28 ou B7-CTLA-4. O complexo TCR-CD3, junto com a li ação ao MHC-CD4 e B7-CD28, eralmente conse uem ativar a célula T, no entanto, foi emonstra o que a a esão e CD2-CD58, CD1 1a-CD54 e CD4-MHC II ou CD8-MHC I são capazes e aumentar si nificativamente o e stímulo provi o pelo TCR e por B7-CD28 ou B7-CTLA-4. Parece que este aumento o sinal estimulatório se eve a ocorrência e uma estabilização celular maior, qua n o o contato entre estas moléculas. 12

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Citocinas e sub-populações e Linfócitos T Dentre as sub-populações e linfócito s T, as Th1 e Th2 parecem ser oriun as a mesma célula pro enitora, a Th0. As cé lulas Th1 secretam interleucina 2 (IL-2), γ-Interferon (γ-IFN), Fator e Necrose Tumoral (TNF) e IL-12, já as células Th2 são capazes e secretar as citocinas I L-4, IL-5, IL-6 e IL-10. As células Th1 lançam um sinal estimulatório às células B para que pro uzam e secretem I G2a, que inibe a função a população Th2. A IL -12 é uma citocina importante neste processo já que, sem ela, a eração e novas células Th1 é bloquea a. Isto acaba se refletin o também no papel a IL12 em es timular a pro ução e IL-1, TNF e γ-IFN, o qual é necessário para a maturação e Th1. IL-12 normalmente é pro uzi a pelos monócitos, macrófa os e células acessó rias como ecorrência e um estímulo a o pelas infecções por parasitas e bactér ias. O γ-IFN exerce um sinal e “fee back” positivo estimulan o a pro ução e ma is IL-12. A sub-população Th2 inibe a pro ução e I G2a, mas estimula a síntese e I E e I G1; a IL-4 também tem participação neste processo. Em resumo IL-4 e I L-10 são capazes e inibir monócitos e macrófa os a pro uzir IL-12, que este mo o acabam por bloquear a maturação e Th1 e o correr a resposta imune feita por Th1. O estímulo a pro ução e imuno lobulinas Ativação O primeiro estímulo para que a célula B e início a pro ução e imuno lobulinas, em eral ecorre a li ação o antí eno ao anticorpo preso na membrana a célula B. Caso os antí enos sejam m ultivalentes, como os polissacarí eos, ocorre a li ação cruza a a imuno lobulina presente na membrana a célula B e ela se torna ativa a, in epen ente a ativaç ão pelas células T (estimulação T in epen ente). No entanto, para a maioria os antí enos, há a necessi a e o estímulo pelas células T para que seja inicia a a pro ução e imuno lobulinas (estímulo T epen ente). Para que isto ocorra, há a necessi a e e que o antí eno seja apresenta o junto com uma molécula e MHC nu ma APC e que a célula B seja co-estímula a pelo contato celular e por al umas ci tocinas. Isto é importante como forma e evitar reações autoimunes ou aloimunes. Existem várias formas em que este processo po e ocorrer, a mais comum é a apres entação o MHC II por uma APC para uma célula B na presença o contato a célula B com a T por B7-CD28. Em eral a li ação cruza a a imuno lobulina presente na membrana a célula B, leva ao aumento o nível e moléculas e a esão em sua me mbrana (CD25, HLA Dr, CD40, B7) e e um aumento na resposta a citocinas. Parece que o contato mais importante neste processo é o a molécula CD40 com a CD40L a célula T é claro que, o contato e CD4/HLA Dr, CD11c/CD54 e CD2/CD58 são import antes, já que aumentam o estímulo a célula B. Também é importante o contato as APC que ocorre via Antí eno-MHC-Imuno lobulina e Superfície e/ou B-antí eno e supefície-Receptotes Fc presentes nas células foliculares en ríticas. Este aum ento e contato também ocorre se o sinal for a o pelas células Th1 ou Th2. 13

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Proliferação e maturação A ativação e proliferação T epen ente as células B, i nicialmente ocorre nos centros erminativos os linfono os, baço e tonsilas. A s equência e ativação as células B nos folículos parece ocorrer o se uinte mo o , após a li ação o complexo MHC II-A -I e superfície e CD40CD40L, na presença e etermina as citocinas (IL-2, IL-4), as células B começam a proliferar rapi amente. Nesta etapa elas crescem e morfolo icamente são enomina as blastos, pos teriormente, elas proliferam e se tornam centroblastos, os quais sofrem hipermut ação somática nos enes as imuno lobulinas. Os centroblastos então ão ori em a células menores, que não se ivi em e se enominam centrócitos. A manutenção a maturação os centrócitos epen e a li ação a sua imuno lobulina e superfíci e com os complexos e MHC II às células foliculares en ríticas. Quan o os centr ócitos se li am via CD40-CD40L e/ou CD23 as IL-4, isso evita que eles entrem em apoptose (morte celular), evi o a ativação a síntese proteíca o bcl-2 que a m antém. A presença e IL-4/IL-6 se li an o a CD23 também faz com que a célula B a ma ureça e se transforme no plasmócito que é a célula especializa a na síntese e liberação e imuno lobulinas. Depen en o a IL libera a no processo e ativação a célula B, é que vamos ter a pro ução e I G (estimula a por Th1: IL-1, γ-IFN , IL-12) ou I E (estimula a por Th2: IL-4,IL-6). A população e células Th1 e su as citocinas estimulam as células B a ama urecer e secretar anticorpos I G2a. Já o γ-IFN inibe a transcrição enica a I G1, enquanto a IL-4 é responsável pela troca a transcrição enica e I G1 e I E. É importante ressaltar que há necessi a e e IL-4 e IL-5 para a maturação os plasmócitos. Os mecanismos apresenta os até o momento a troca e isotipo na síntese e anticorpos são ain a um tanto c omplica os e controversos e por isso não serão iscuti os a fun o aqui. Resumi a mente po emos izer que a troca a ca eia pesa a se eve a uma eleção e um se mento e DNA entre re iões constantes e exons e, o novo exon o DNA que co ific a a nova ca eia pesa a. Isso parece se ar por uma excisão o “loop” o DNA inte rme iário, acompanha o pela eleção e reanelamento (li ação). Sabe-se que eve e xistir uma enzima na con ução este processo só que, esta ain a não foi escober ta.

VIA CLÁSSICA DO COMPLEMENTO Esta via só acontece se tivermos moléculas e antico rpo li a as ao antí eno, e no mínimo são necessárias uas moléculas e anticorpo . O primeiro componente o complemento ativa o é o C1, que ao se li ar à uas mo léculas e anticorpo I G ou uma molécula e I M pela uni a e 7S através a porçã o Fc a imuno lobulina, passan o então a expor suas frações C1q, C1r e C1s e tor nar a uni a e C1r ativa a, passan o a ter ativi a e e esterase. Um etalhe impo rtante nesse processo e ativação e C1 é que há a participação e ions cálcio ( Ca++), sem ele, não há a manutenção o complexo 14

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trimolecular C1q-C1r-C1s. É bom ressaltar que a via clássica também po e ser ati va a pela presença a proteína A os Estafilococos, pela Proteína C Reativa (PCR ) e também pela molécula e DNA. Com esta ativi a e e esterase C1 cliva os ois próximos componentes a cascata o complemento que são C4 e C2, estes são cliva os em C4a e C4b e C2a e C2b respectivamente. C4b e C2 a erem a superfície o an tí eno, e próximo e C1, forman o assim o complexo C14b2. A fixação e C2 só oco rrerá em C4b se contarmos com a presença os ions Ma nésio (M ++), só então é qu e C2 será quebra o em C2a e C2b, este último fica em solução. O complexo C4b2a a e como uma C3 convertase que cliva C3 em C3a e C3b, este mo o a opsonização e quimiotaxia os leucócitos é ativa a, assim como também ocorre o aumento a perm eabili a e vascular. C4b2a tem a capaci a e e clivar várias moléculas e C3 em C3a e C3b, sen o que C3b irá se li ar a superfície o antí eno. O complexo C4b2a 3b é chama o e C5 convertase, este quebra as moléculas e C5 em C5a e C5b. As m oléculas e C5b se li am também a superfície o antí eno e, em se ui a a início a formação o complexo e ataque a membrana (MAC), assim temos a li ação sucess iva e C6, C7, C8. Finalmente ocorre a li ação e 8 a 18 moléculas e C9 junto a este complexo, forman o assim um canal transmembrana que atua como uma uni a e lítica. Os fra mentos C3a e C5a atuam como potentes anafilotoxinas que estimulam os mastócitos a e ranularem histamina, a qual é um potente ilata or vascular e contrator a musculatura lisa. Os neutrófilos liberam enzimas hi rolíticas e a s plaquetas se a re am, levan o a microtrombose, estase san uínea, formação e e ema e estruição teci ual local. C5a também atua como fator quimiotático para p olimorfonucleares e macrófa os. Vemos então que a reação que ocorre é uma reação em cascata, uma vez que em ca a fase enzimática ocorrem inúmeras reações na fas e se uinte, avoluman o a reação, como se fosse um processo ener ético e uma cas cata. O processo reacional vai se avoluman o a ca a passo que ocorre a reação se uinte. ATIVIDADES DO COMPLEMENTO Muitas células próprias ou estranhas ao or ani smo po em sofrer lesões pela ação o complemento. Plaquetas, hemácias, leucócito s, bactérias, quan o revesti as por anticorpos específicos ativam o complemento. Os componentes C3 e C9 são os responsáveis pelo esenca eamento a lesão. No ca so os micror anismos pato ênicos, o complemento é e capital importância na es truição as mesmas e na efesa o in iví uo. Lo icamente, há uma série e reaçõe s in esejáveis, on e o complemento é o responsável. É o caso as reações pós tra nsfusionais em que, a a ministração e san ue ABO incompatível leva a reações se veras como calafrios, tremores, elevação a temperatura e, conseqüentemente, fix ação o complemento com lise e liberação a hemo lobina. Nas anemias auto imunes ocorre, também, hemólise. O anticorpo sensibiliza as hemácias e esenca eia a h emólise. A oença hemolítica o recém-nasci o (DHRN) é, frequentemente provoca a 15

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por anticorpos para o fator Rh. Há uma série e outros processos em que a partic ipação o complemento é in esejável. Complemento e Fa ocitose: hemácias revesti as por anticorpos e complemento têm si o utiliza as para a emonstração a parti cipação o complemento na facilitação a fa ocitose. O C3b é o elemento mais env olvi o nesse processo. Os polimorfonucleares e macrófa os possuem receptores par a C3b em suas membranas, o que promove intimo contato entre fa ócitos e as célul as a serem in eri as. Bactérias em presença o complemento e e seu anticorpo co rrespon ente, são fa ocita as mais facilmente e sofrem lise. Complemento e Liber ação e Histaminas: na sequência a reação e fixação o complemento, são libera as C3a e C5a, em ambas as vias, clássica e alternativa. São proteínas e baixo peso molecular e que promovem a contração a musculatura lisa e po em provocar o aumento a capilari a e celular. Os C3a e C5a são istintos química e biolo ica mente, e mo o que, quan o o músculo não respon e mais ao C3a, mostra resposta a tiva ao C5a, su erin o receptores nos mastócitos. Nesse processo há a liberação e histamina que exerce a função e anafilotoxina. Complemento e Ação Quimiotáti ca: os fra mentos C3b e C5a e o C5b67 (Complemento macromolecular) forma os ura nte o processo e fixação o complemento, atraem

polimorfonucleares, exercen o ação quimiotática positiva. Se for feito um corte histoló ico no local em que ocorreu o Fenômeno e Arthus, isto é, no ponto on e se eu a reação e anti eno-anticorpo, envolven o o complemento, observa-se um a cúmulo e polimorfonucleares. O tratamento e C3a por Tripsina inativa a sua cap aci a e e contrair o músculo liso, permanecen o a sua ação quimiotática. Nesse caso su erem-se que rupamentos químicos istintos sejam responsáveis por estas ativi a es. Complemento e Pro ução e Quininas: As quininas são polipeptí eos co m ativi a e hipotensora e estimulante a musculatura lisa, urante a ativação o complemento. Há su estões que a quinina pro uzi a pelo complemento seja ori ina a o componente C1 ou C4. O tratamento estes com a C1 esterase á ori em a uma substância e ativi a e semelhante às quininas. Complemento e Doenças Humanas: o complemento está relaciona o à iversas oenças como, a lomerulonefrite a u a e crônica, lupus eritematoso sistêmico, na pan encefalite sub a u a e mesmo na hepatite viral. Já se sabe que há eposição e complexos antí eno-anticorpo-anti -AU, em lesões renais. BIOSSÍNTESE DO COMPLEMENTO: Os locais e síntese os seus componentes são iversos e etermina os para quase to os os componentes, bem co mo para o inibi or C1. Componentes o Complemento e locais e síntese: Component e C1 C2 C3 Locais e Síntese epitélio intestinal macrófa os macrófa os 16

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C4 C5 C6 C7 C8 C9 Inibi or C1 fí a o (células e Kupfer) baço fí a o baço fí a o fí a o fí a o EFEITOS BIOLÓGICOS DOS PRODUTOS DE ATIVAÇÃO DO COMPLEMENTO COMPONENTES E COMPLEXOS ENVOLVIDOS ATIVIDADES C1,4 C1,4,2 Em associação com I M, neutralização o vírus Herpes simples Possível pro ução e quininas, aumento a permeabili a e vascular C3b Facilitação a fa ocitose pelos leucócitos. Imunoa erência - C3b sobre hemácias, leucócitos ou plaquetas, terminan o por eliminação com a fa ocitose. C3a Quimiotaxia para leucócitos. Anafilataxia (liberação e histamina, contração a musculatura lisa e aumento e permeabili a e capilar). C5a C5,6,7 C8,9 Quimiotaxia para leucócitos. Anafilatoxina. Quimiotaxia para leucócitos. Efeito citotóxico. 17

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AS IMUNOGLOBULINAS Também chama as e anticorpos, são o pro uto a célula B ma u ra, sintetiza os evi o a um estímulo anti ênico. As imuno lobulinas são constit uí as e, no mínimo uas ca eias pesa as (H e Heavy Chain) e uas ca eias leves (L e Low Chain), estas ca eias estão presas entre si por pontes issulfeto. As moléculas são sub ivi i as em classes e subclasses basea o em sua especifici a e anti ênica as ca eias pesa as. As ca eias pesa as são esi na as por letras re as minúsculas, μ,γ,α,δ,ε, as imunoglobulinas são chamadas d IgM, IgG, IgA, IgD IgE r sp ctivam nt . As três principais class s são a IgG, IgM IgA as pr s nt s m m nor quantidad são a IgD IgE (m nos d 1% do total d imunoglo bulinas). Exist m dois tipos d cad ias l v s, chamadas d κ λ, presentes em t odos os tipos de imunog obu inas, mas apenas um tipo está presente em cada mo éc u a de imunog obu ina. IgG, IgD e IgE apresentam duas cadeias pesadas e duas cad eias eves, enquanto que a IgM e a IgA são mu tímeros desta estrutura básica. Po ntes dissu feto e forças não cova entes conferem estabi idade a estrutura da imu nog obu ina. A estrutura monomérica básica tem a forma de Y, com uma região cham ada de região de dobradiça. A região da dobradiça, é uma região rica em pro ina e suscetíve a c ivagem por enzimas proteo íticas. Tanto a cadeia pesada e eve, possuem uma região constante na porção carboxi termina e apresentam uma região variáve na porção amino termina . Aproximadamente 60% das mo écu as de imunog obu inas tem a cadeia eve κ, e 40% tem a cadeia eve λ. A cadeia eve λ, aprese nta 6 subtipos, estes indo de λ1 a λ6. As cinco c asses de imunog obu ina são ch amadas de isotipos, baseado na especificidade da cadeia pesada de cada c asse de imunog obu ina. Duas c asses de imunog obu ina, IgA e IgG foram posteriormente subdivididas em subc asses baseado nas diferenças apresentadas na cadeia pesada. Temos conhecimento de 4 subc asses de imunog obu inas IgG, designadas como IgG1 , IgG2(e recentemente descoberto a IgG2a e IgG2b), IgG3 e IgG4; e 2 subc asses d e IgA, também designadas como IgA1 e IgA2. A digestão da IgG com papaína fornece dois fragmentos chamados de Fab e um chamado de Fc. Cada fragmento Fab possui u m sítio para igação ao antígeno, o fragmento Fc não se iga a antígeno mas é ca paz de fixar o comp emento e se igar a receptores de Fc presente nas cé u as. J á ao tratarmos a IgG com pepsina, teremos a imunog obu ina c ivada em sua porção carboxi termina , dando como produto um fragmento com as duas porções Fab igad as, F(ab’)2, e um fragmento parcia mente digerido de Fc (pFc’). Os fragmentos F( ab’)2 possuem dois sítios de igação ao antígeno. As cadeias eves possuem um do mínio variáve e um constante enquanto que a cadeia pesada possui um domínio var iáve e de três a quatro domínios constantes. A cadeia eve das imunog obu inas tem aproximadamente 24 D e a cadeia pesada das imunog obu inas tem um peso mo e cu ar compreendido entre 51 D e 71 D, baseado em suas características dividimos as imunog obu inas em c asses. Encontramos aproximadamente 30% de 18

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homo ogia na sequência de aminoácidos presente na cadeia pesada das cinco c asse s de imunog obu inas. A cadeia pesada da IgM é a μ, a I G é a γ, a I A é a α, d IgD δ e a I E a ε. A cad ia p sada é o principal constituint da molécula d imunoglobulina. Cada imunoglobulina é constituída d uma cad ia d quatro pol ip ptíd os monoméricos, o qual consist d dois polip ptíd os l v s dois p sad os. Os dois polip ptíd os p sados são idênticos m qualqu r molécula assim como as duas cad ias l v s. As imunoglobulinas possu m ainda r giõ s d nominadas domí nios, o qual consist d um polip ptíd o pr s nt tanto na cad ia l v como na p sada cuja unidad strutural contém aproximadam nt 110 aminoácidos. Os domín ios são alças qu são ligadas por pont s dissulf to nas r giõ s constant vari áv l das cad ias p sada l v . As funçõ s das imunoglobulinas stão ligadas a a lguns domínios. A r gião VH corr spond a porção variáv l da cad ia p sada da im unoglobulina a VL, corr spond a r gião variáv l da cad ia l v . T mos ainda d ntro d stas r giõ s variáv is, part s hip rvariáv is, chamadas d R giõ s Hip r variáv is, stas são r sponsáv is p lo sítio d ligação ao antíg no p la sua c onformação sp cificidad . ALGUMAS CARACTERÍSTICAS DAS DIFERENTES CLASSES DE IMUNOGLOBULINAS IgG Corr spond a aproximadam nt 85% das imunoglobulinas pr s nt nos adultos. T m um p so mol cular d 154 D com duas cad ias l v s d 22.000D duas p sadas d 55.000D cada. É também a imunoglobulina qu dura mais t mpo m circulação, m média 23 dias. T m a capacidad d atrav ssar a plac nta é o anticorpo nvolv ido na r sposta imun s cundária (r sposta anamn stica). Esta imunoglobulina pos sui alta afinidad para ligação a um antíg no sp cífico, assim como d fixar co mpl m nto, stimular a quimiotaxia atuar como opsonina para facilitar a fagoci tos . Conform dito ant riorm nt , t mos 4 subclass s d IgG, todas bas adas nas dif r nças d suas cad ias p sadas γ, temos então as ca eias γ1,γ2,γ3 e γ4. Est as iferenças a ca eia pesa a se baseiam na iferença que apresentam no número e na posição as pontes issulfeto que li am uma ca eia a outra. I M Correspon e a 5% as imuno lobulinas presentes no in iví uo a ulto e possui uma vi a mé ia e 5 ias. É uma molécula com estrutura pentamérica, ou seja, pos sui 5 estruturas básicas as imuno lobulinas, só que estas estão li a as entre s i por pontes issulfeto e pela Ca eia J, com isso o seu peso molecular é em torn o e 900kD. A I M é a imuno lobulina mais eficiente na fixação o complemento. S ó encontramos a I M em sua forma monomérica quan o está li a a na membrana os 19

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linfócitos B ma uros, nesse caso ela apresenta ois componentes a icionais, o o mínio transmembrana, composto por aminoáci os hi rofóbicos que ancoram a molécul a à membrana citoplasmática, e um omínio citoplasmático. Por ser uma imuno lobu lina ran e, basicamente a encontramos no interior os vasos. Tem importância na imuni a e para antí enos polissacarí ecos oriun os os micror anismos. I A Assim como a I M, correspon e a 5% as imuno lobulinas presentes em um a ult o, possui uma vi a mé ia e 6 ias, e seu peso molecular está em torno e 160 kD . Po e ser encontra a na forma monomérica, imérica, trimérica ou multimérica. E xistem uas subclasses e I A que são a I A1 e I A2. Ela po e ser encontra a na circulação e nas secreções corporais, neste último caso ela se apresenta na form a imérica, com as uas ca eias básica a imuno lobulina li a as pela ca eia J e um componente chama o e peça secretória. I D Encontra a li a a a membrana e linfócitos B ma uros, somente sob a forma mo nomérica. Seu peso molecular aproxima o é e 185kD. I E Encontra a sob a forma monomérica na circulação, seu peso molecular é e apr oxima amente 200kD. Está implica a nas reações alér icas, principalmente quan o li a a a membrana e mastócitos e basófilos. Resumi amente po emos izer que a I A secretória po e ser encontra a em secreções corporais como saliva, leite, sec reções brônquicas e intestinais. I D e I M estão eralmente presas a membrana o s linfócitos B a fim e intera ir com os antí enos e ativar os linfócitos B. A I E está implica a com os mecanismos e anafilaxia e a I G, que é a única imuno l obulina capaz e atravessar a placenta, é a que está presente na circulação san uínea em maior quanti a e.

A LIGAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO O mo elo tra icional usa o há al uns anos, antes e se conhecer melhor a composição estrutural os anticorpos não é mais váli o. Es te mo elo anti o izia que o antí eno se li ava ao anticorpo por um mo elo tipo chave-fecha ura, hoje em ia já é sabi o que a interação que ocorre envolve síti os combinatórios, sen o estabiliza a por li ações não covalentes, on e os rupos que intera em evem estar próximos para que estas forças atuem ou seja, evemos ter uma complementarie a e entre o epítopo anti ênico e o sítio combinatório o anticorpo. As variações que ocorrem nesta complementarie a e é que era iferen ças na afini a e, avi ez e especifici a e o anticorpo. 20

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Po emos izer que o anticorpo possui alta afini a e quan o a interação as força s moleculares e atração é maior que o as forças e repulsão. A força e intera ção total entre antí eno e anticorpo é que confere o rau e avi ez e isto també m está li a o a especifici a e, pois quanto maior a complementarie a e entre os sítios combinatórios o anticorpo com o antí eno, maior a sua especifici a e. A PARTICIPAÇÃO DOS ANTICORPOS NA REAÇÃO DE FASE AGUDA A reação e fase a u a tam bém po e ter início quan o os anticorpos se li am a superfície e mastócitos, só que a imuno lobulina que mais participa nessa reação é a I E, isto porque ela p ossui um sítio e li ação específico para receptores presentes na superfície e mastócitos. Quan o um micror anismo se li a a estes anticorpos li a os a mastóci tos, há uma alteração conformacional nos receptores celulares os mastócitos, qu e se tra uz em um sinal que leva a liberação e me ia ores capazes e aumentar a permeabili a e vascular e a quimiotaxia e polimorfonucleares. Al uns tipos e anticorpos também po em se li ar a membrana e células fa ocitárias, e mo o que se houver a formação e um complexo antí eno-anticorpo, envolven o mais e uma molécula e anticorpo, há uma alteração a nível e receptores as células fa oci tárias que in uzem um sinal ao fa ócito, fazen o que ele fa ocite o antí eno. Is to ocorre mais rápi o o que se o fa ócito apenas tivesse um contato íntimo com o antí eno. Os anticorpos também po em atuar bloquean o al umas reações os antí enos a li ação com células, por exemplo, um anticorpo iri i o para a hema luti nina o vírus Influenza, po e bloquear sua li ação a uma célula hospe eira. Outr o exemplo, quan o os anticorpos se li am a moléculas e transporte presentes na membrana bacteriana, faz com que esta eixe e captar al uns nutrientes para o s eu crescimento. Os anticorpos, também ao se li arem a toxinas bacterianas, bloqu eiam sua ação e evitam que ocorra o ano celular. ANTICORPOS MONOCLONAIS Os anticorpos monoclonais, em mea os os anos 70 represen taram um ran e avanço na linha e ia nóstico imunoló ico os laboratórios, com eles foi possível aumentar a especifici a e os "kits" e assim, obter resulta o s mais confiáveis. Os anticorpos monoclonais, são anticorpos que possuem especif ici a e para apenas um etermina o epítopo o antí eno, iferente os anticorpos policlonais, on e temos varias imuno lobulinas respon en o a iferentes epítopo s e uma mesma molécula anti ênica. Nossa resposta imunoló ica normal a um antí eno é uma resposta policlonal, ou seja, há uma estimulação múltipla e vários cl ones forma ores e anticorpos, cujos pro utos representam uma mistura e imuno l obulinas. A síntese e anticorpos monoclonais só é possível em um laboratório es pecializa o, isto apesar e teoricamente ser fácil e ser monta o. Os anticorpos monoclonais são sintetiza os a partir e um clone e linfócito B ou e plasmóci tos capazes e pro uzir anticorpos para o antí eno eseja o. 21

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Só que estes clones evem ser imortais, já que as células B não uram muito, mes mo que sejam manti os em con ições i eais. A fim e conferir imortali a e aos li nfócitos B, se montam os chama os hibri omas, que é a hibri ização (fusão) e cé lulas B com uma célula e mieloma linfocitário. As células e mieloma são escolh i as por terem uas características principais, uma é e não conse uir pro uzir imuno lobulinas, outra é que não possuem a ativi a e e Hipoxantina Fosforibosil Transferase (HPRT) ou seja, não tem a capaci a e e sintetizar purinas pela via exó ena. Os linfócitos B são fusiona os com as células e mieloma usan o-se Pol ietileno Glicol (PEG), este mo o em uma cultura e células passamos a ter linfó citos, células mielói es e hibri omas. Os híbri os sofrem a combinação os seu enoma com o o linfócito B e a quire um esta o iplói e. A seleção os hibri oma s é feita colocan o as células trata as com PEG em um meio conten o Hipoxantina, Aminopterina e Timi ina, por isso chama o e meio HAT. O que se faz é esperar a morte natural os linfócitos, que ocorre entre 1 a 2 semanas, enquanto que as c élulas mielói es morrem porque elas não conse uem usar a Hipoxantina exó ena par a pro uzir purinas, e a Aminopterina bloqueia a síntese en ó ena e purinas e pirimi inas. Os hibri omas conse uem sobreviver porque conse uem fazer uso a hipoxantina e timi ina para pro uzir as purinas por via exó ena, evi o a informação enética oriun a os li nfócitos B. Passa as então uas semanas, o meio HAT vai sen o ra ativamente sub stituí o por um meio para manutenção celular comum, como o MEM-Ea le. Posteriorm ente, quan o estas células já estão crescen o em um meio e manutenção comum, é feita a separação estas por iluição. É realiza a uma iluição e forma que se obtenha 0,5 células para ca a 100 ou 200μL, e esta suspensão é istribuí a em um a microplaca, colocan o-se justamente e 100 a 200μL por orifício. Futuramente, quan o já ocorreu o crescimento e mais hibri omas em ca a orifício a microplac a, a suspensão e ca a um estes eve ser testa a. Normalmente pela meto olo ia e ELISA, para verificação o tipo e anticorpo pro uzi o ser o eseja o. A SÍNTESE DAS IMUNOGLOBULINAS Durante a maturação os linfócitos B, o primeiro r earranjo o DNA celular para a síntese os anticorpos ocorre com a monta em a c a eia pesa a e posteriormente a monta em a ca eia leve, mas para fins i áticos , apresentaremos primeiro a síntese as ca eias leves e posteriormente as pesa as. Os cromossomas responsáveis pela pro ução e imuno lobulinas nos humanos são o 14 para as ca eias pesa as, 2 para as ca eias leves κ e 22 para as cadeias e ves λ. Síntese das cadeias eves Na década de 70, com o emprego das técnicas de DNA rec ombinante é que se tornou possíve estudar os genes responsáveis pe a codificaçã o dos anticorpos. Conforme dito anteriormente, a cadeia 22

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eve pode ser constituída pe a cadeia λ ou κ, os genes que as codificam estão pr esentes em cromossomas diferentes. Iremos descrever brevemente como ocorre a sín tese de cada uma destas cadeias baseado no mode o experimenta descoberto em rat os. Síntese da cadeia Lambda: O segmento genético que codifica a cadeia λ está p resente no cromossoma 22 e está arranjado da seguinte forma a partir da posição 5’ para 3’: • • • Apresenta aproximadamente 100 segmentos Vλ (que codificam a po rção variáve ), 6 segmentos Jλ (codificando a Junção) sendo que o segmento Jλ4 é um pseudogene, ou seja, é um gene que não é expressado, 6 segmentos Cλ (que cod ificam a região constante). Antes de cada segmento Vλ temos também um segmento L chamado de segmento Líder, é e e que codifica o inicio da fita a ser transcrita, este segmento, codifica pe ptídeos que, tão ogo a mo écu a de imunog obu ina esteja montada, são c ivadas para dar origem a mo écu a funciona . Todos estes segmentos estão separados por introns (sequências não codificantes de DNA). Inicia mente o que ocorre é a reco mbinação do segmento Lλ-Vλ com Jλ formando o comp exo Lλ-Vλ-Jλ o qua fica separ ado do segmento Cλ por um intron, e assim dará origem a um transcrito primário d e RNA. Posteriormente temos processo de “sp icing” do intron entre a sequência L λ-Vλ-Jλ e Cλ onde parte da sequência entre Lλ-Vλ-Jλ e Cλ é cortada e posteriorme nte é feita a adeni ação do termina 3’, formando assim a cauda po i-A. Este tra nscrito primário dá ao RNAm capacidade de codificar LλVλ-Jλ-Cλ quando for traduz ido. Após a tradução temos o peptídeo nascente que é processado e g icosi ado, s ofrendo então o corte do pedaço po ipeptídico codificado pe a sequência íder. Síntese da cadeia Kappa: Nesse caso, o cromossoma que a codifica é o cromossoma 2, e este dispõe de maior número de regiões V (aproximadamente 350) cada uma pre cedida de uma sequência Lκ, posteriormente 5 genes para Jκ, e ao fina do cromos soma há apenas um gene que codifica Cκ. Justamente pe o cromossoma que codifica a cadeia κ possuir maior número de genes codificando V é que o número de regiões variáveis possíve é maior pois o número de combinações entre Vκ-Jκ passa a ser de aproximadamente 1400. A sequência de montagem da cadeia Kappa ocorre da mesm a forma que o da cadeia Lambda. Síntese das Cadeias Pesadas As cadeias pesadas são codificadas pe o cromossoma 1 4, só que a ém dos genes codificadores para V e J também há um grupo de genes ch amados D (Diversidade), estes segmentos D apresentam variações tanto no número d e codons como no número de pares de bases e ainda, mais de um 23

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segmento D pode se unir para dar origem a uma região D. A região D pode ser ida de três formas diferentes sem gerar um “stop codon”, o que he atribui a divers idade. O cromossomo da cadeia pesada descrito até o momento, parece apresentar d e 100 a 200 genes para V com seus respectivos genes L na porção 5’, 30 genes par a D, seis genes funcionais para J, três pseudogenes J e 11 genes para as porções constantes da cadeia pesada (Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cε2, Cα1, Cγ2b, Cγ2a, Cγ4, Cε1 Cα2). São estes genes const ntes que irão determin r cl sse d imunoglobulin ser form d . No processo de mont gem d c dei pes d , primeiro ocorre o re r r njo do DNA de form que um dos segmentos D e J são lig dos, com o corte d seq uênci de DNA que está entre eles. Em seguid um dos vários segmentos V, junto c om o respectivo gene L, é lig do o complexo DJ form do. Este re rr njo VDJ con tece pen s n s célul s que d rão origem os linfócitos B, e é o ponto crítico d e controle n expressão d imunoglobulin um vez que pen s o gene V re rr nj d o é tr nscrito. As regiões C ind se m ntém sep r d s do complexo VDJ por um in tron, prov velmente contendo ind segmentos J não re rr nj dos. O tr nscrito pr imário de RNA v i ter mesm org niz ção deste DNA. Não se s be ind se tod s s regiões const ntes são express s no tr nscrito primário. Posteriormente o RNA primário tr nscrito sofre o processo de “splicing”, onde o intron situ do entre o complexo VDJ é excluído té o primeiro gene C, o qu l é o Cμ, an o ori em a um RNAm funcional para a monta em a ca eia pesa a μ. Múltiplos nucleotí eos e a enina são a iciona os, forman o a cau a poli-A, a um os sítios e polia enila ção localiza os na porção 3’ o RNA Cμ. Os enes co ifica ores para as outras cl asses também possuem sítios e polia enilação, e são utiliza os quan o estas re iões são expressas. Então após a monta em o RNAm, este é tra uzi o, an o ori e m a um polipeptí eo que ain a contém os peptí eos co ifica os pelo ene L, estes então são corta os urante o processamento e licolização a proteína, assim a n o ori em a ca eia pesa a μ. To o este rearranjo o DNA que ará ori em as ca e ias pesa as e leves a imuno lobulina, são coman a os por recombinases, são enzi mas que reconhecem sequências especificas o DNA localiza as na re ião 3’ e 5’ e ca a exon que será uni o e assim, se forma um “loop” o intron e DNA que será corta o. A troca e classe e imuno lobulina, importante no processo e ama urec imento a resposta imune, parece ser acompanha a ou prece i a pela mutação somát ica. Inicialmente um se mento completo e DNA, o qual inclui a re ião VH recombi na a, é li o com as re iões μ e γ, sen o transcrito em uas moléculas e RNAm, u ma expressan o a re ião constante μ e outra expressan o a re ião constante γ. Su põe-se também que se mentos maiores e DNA sejam transcritos juntos, e que o “sp licin ” iferencial aria ori em à outras classes e imuno lobulinas, compartilh an o as re iões VH. Isto foi observa o em células pro uzin o simultaneamente I M e I E. 24

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Parece também que a troca e classe e imuno lobulina é me ia a pela recombinaçã o entre cromossomas, nesse caso a semelhança entre as sequências que efinirão a classe e imuno lobulina, permitem que ocorra uma recombinação somática entre ois cromossomas. Deste mo o, se por exemplo temos os cromossomas, um chama o e A e outro B, uma parte o cromossoma A rearranja o, que seria corta o em Cμ, re combina com parte o cromossoma B ain a não rearranja o on e está o ene para Cγ . Assim teríamos a troca a I M pela I G. Como vemos, evi o a esta recombinação somática que ocorre é que permite a iversi a e que aparece nas imuno lobulinas , a associação ao acaso e ca eias leves e pesa as ain a contribui mais para aum entar esta iversi a e. Devemos ter em mente também que o DNA presente em uma cé lula B que sofreu o rearranjo (recombinação somática), é iferente as emais cé lulas o or anismo, pois evi o as eleções sofri as no DNA, este é menor, no en tanto a célula B continua sen o uma célula somática, ou seja capaz e se ivi ir . As células tronco hematopoiéticas, assim como qualquer célula não B, tem o DNA correspon ente aos enes as imuno lobulinas não rearranja o. A partir o momen to que a célula tronco á ori em a uma célula pró-B, já começa a ocorrer o rearr anjo os enes e imuno lobulinas. O controle alélico Como ca a célula e nosso or anismo tem 23 pares e cromossomas homólo os, isto si nifica que temos 2 pare s e cromossomos 2, 14 e 22. Como o linfócito B só pro uz um tipo e anticorpo, ou seja com um tipo e ca eia leve e um tipo e ca eia pesa a isto si nifica que a expressão os outros tipos e ca eia pesa a é suprimi a assim como o se un o tipo e ca eia leve. Por exemplo, o linfócito B pro uz anticorpos com a ca eia leve λ e com a cadeia pesada γ, suprimin o a expressão os emais. O que eve es tar ocorren o então é o que chamamos e exclusão alélica, ou seja enquanto um o s enes é expresso o outro é excluí o. Isto parece ocorrer a se uinte forma, qu an o o rearranjo e um os enes, como por exemplo, o e ca eia pesa a é bem suc e i o, ori inan o ca eias pesa as funcionais, estas ca eias impe em o rearranjo o cromossomo homólo o e, assim não po e co ificar outra ca eia pesa a. No caso os enes as ca eias leves, parece que as ca eias pesa as pro uzi as irão estim ular o ene as ca eias leves a sofrer rearranjo, inicialmente os enes a ca ei a κ, se então o rearranjo dos cromossomas 2 é bem sucedido, há o impedimento do cromossoma homó ogo e do par de cromossomos 22. Caso este rearranjo não seja bem sucedido, outro cromossomo 2 é rearranjado e, em sequência, o par 22, até que u ma cadeia eve funciona seja produzida. Esta então inibirá o rearranjo nos gene s ainda não modificados. Caso não haja rearranjo produtivo de cadeias eves ou p esadas a cé u a entra em apoptose. Produção de imunog obu inas de membrana Os i nfócitos B maduros tem de apresentar IgM em sua superfície ce u ar, esta IgM est á na forma monomérica e apresenta dois domínios adicionais na porção carboxi ter mina , um é o domínio 25

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REAÇÕES MEDIADAS POR CÉLULAS Estas reações envo vem a resposta imune quando, os anticorpos não são suficientes ou não conseguem ter participação efetiva na ativ ação imuno ógica. Esta resposta mediada por cé u as pode ocorrer na presença de maior ou menor quantidade de anticorpos, não existe uma resposta sem a participa ção de anticorpos. Como exemp o, citamos a formação dos comp exos antígeno antic orpo durante uma resposta, em que estes comp exos estimu am a iberação de fator es quimiotáticos os quais evam ao aumento do numero de cé u as e inf amação oc a . Os anticorpos também podem estar envo vidos na igação dos antígenos às cé u as via os receptores Fc, deste modo modu ando a resposta ce u ar. No caso de cé u as fagocitárias e Natura Ki er (NK), os anticorpos podem iga- as à seus a vos. Do mesmo modo não podemos dizer que toda resposta mediada por cé u as é dep endente da coordenação dos infócitos T, muitas das vezes a resposta depende do reconhecimento de partes comuns do microrganismo por receptores que não estão re acionados com receptores antígenoespecífico de cé u as T e B. Respostas T indep endentes

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transmembrana e o outro o citop asmático. A IgM secretada tem estes dois domínio s substituídos por uma peça. Estes dois tipos de IgM se originam devido a um pro cesso a ternativo do mesmo transcrito primário de RNA onde um transcrito dará or igem a IgM secretória com a cauda na porção carboxi termina e o outro transcrit o dará origem a IgM com os domínios transmembrana e citop asmático. Troca de c a sse das imunog obu inas Os infócitos B assim que estão maduros expressam IgM e IgD em sua membrana, isto se deve ao transcrito primário conter tanto o segmento que expressa a IgM e a IgD, tendo este então dois processamentos para montar um a ou outra imunog obu ina. No entanto quando a resposta imune exige a troca de c asse, o rearranjo VDJ pode permanecer e ocorre apenas um novo rearranjo com o s egmento C. Outra possibi idade, é do rearranjo VDJ permanecer e ser montado um t ranscrito primário que expresse os segmentos constantes necessários. Este rearra njo é dependente das citocinas iberadas durante o estímu o imune. Na resposta s ecundária, dependendo do estímu o imune, pode ainda vir a ocorrer o rearranjo so mático dos segmentos V, desta forma aprimorando a especificidade do anticorpo. O s infócitos B maduros, assim que saem da medu a óssea permanecem na circu ação periférica por a guns dias, morrendo então a menos que sejam recrutados por cont ato com o antígeno que reconhecem. A partir do estímu o sofrido pe a igação com o antígeno mais aque es oriundos das cé u as TH estes passam a secretar imunog obu inas.

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Respost s medi d s por célul s T As célul s T enc rreg d s do princip l controle imunológico neste tipo de re ção são s CD4+ ou Thelper (TH). Diferentes sub po pul ções de célul s TH modul m os vários tipos de cooper ção celul r e produzem diferentes tipos de citocin s. Efeitos secundários deste tipo de tiv ção lev m Re ção de Hipersensibilid de T rdi com form ção do gr nulom de hipersensib ilid de ou d no tecidu l. As célul s T enc rreg d s d supressão do sistem imun e são ch m d s de célul s T supressor s, lgum s del s liber m citocin s modul t óri s como TGFβ, que parece ser um supressor de células T. A partir do momento que uma célula TH é ativada (pela apresentação de um antí eno a ela), ela pode determinar qual ou quais mecanismos que serão ativados, dentre estes, temos: a a tivação de células CD8+ citotóxicas (TC), ativação de mastócitos e eosinófilos, ativação de macrófa os levando a 27

     

Vários componentes de microrganismos podem servir de estímu o para que ocorra a quimiotaxia de fagócitos até o ponto de infecção. A gumas endotoxinas bacteriana s podem ativar a via a ternativa do comp emento, promovendo então a formação de C3a e C5a, que tem atividade quimiotática. Outro exemp o, são os Formi peptídeo s que a gumas bactérias possuem e que agem como quimiotáticos e são agentes esti mu antes para fagócitos, uma vez que possuem receptores para estas substâncias. A fagocitose só ocorre se o microrganismo estiver igado a superfície da cé u a fagocitária, é c aro que esta igação é faci itada quando o microrganismo está r ecoberto pe a fração C3b do comp emento pois, C3b se iga a receptores CR3 exist entes nos fagócitos. Do mesmo modo, se o antígeno está recoberto por mo écu as d e anticorpo, então o fagócito se iga ao antígeno via receptor de Fc para a imun og obu ina. Outro mecanismo de ativação da resposta ce u ar independente da ativ ação das cé u as T, é o da iberação de citocinas pe os macrófagos e outras cé u as. O microrganismo invasor parece ter ou iberar mo écu as que fazem este efei to. Dentre as citocinas iberadas pe os macrófagos, as de maior importância pare cem ser o TNFα, o MIF (F tor de Inibição de M cróf gos) e IL-12. O TNFα ge u ment ndo c p cid de microbiocid de m cróf gos e neutrófilos, junto com IL-12 ele f z com que s célul s NK liberem γIFN, que leva ao aumento a ativi a e mic robioci a os macrófa os. O TNFα t mbém c us mud nç s n s célul s endoteli is e f gócitos o que lev um umento d c p cid de de desão dos f gócitos s p re des dos v sos endoteli is, f zendo que deste modo s célul s cheguem o sítio de infl m ção. Qunto o MIF, ele possui c p cid de de tr ir m is célul s o loc l onde está o ntígeno e desenc de r o processo infl m tório, ele t mbém é c p z de ument r c p ci d de de f gocitose de outros m cróf gos e neutrófilos, s sim como sin liz r célul s B e T p r que entrem em est do de “prontidão”.

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hipersensi ilidade tardia. A via de ativação vai depender de que su população d e linfócitos T (TH1 ou TH2) vai ser ativada, e isto depende das citocinas e da c oncentração local de vários esteroídes e meta ólitos da vitamina D3 presentes no tecido linfóide. Por exemplo, quando um micror anismo leva a li eração de IL-12 e γ-IFN de macrófa os e células NK, a su população de linfócitos T que será at ivada é a TH1, enquanto que a li eração de IL-4 e IL-10 leva a ativação de TH2. No processo a udo ocorre a estimulação das células TH0 que tem a capacidade de l i erar uma série de citocinas. No estímulo crônico as su populações TH1 e TH2 s e tornam ativas. Al umas citocinas são li eradas tanto por TH1 quanto TH2 (IL-3, GM-CSF, TNFα) enqu nto lgum s só por TH1 (IL-2, γIFN) e TH2 (IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10). A população TH1 respon e a macrófa os, especialmente quan o estes apre sentam o antí eno. A população TH2 ten e a aumentar a pro ução e eosinófilos e mastócitos e aumentar a pro ução e anticorpos a classe I E principalmente; ess a população respon e melhor quan o o antí eno é apresenta o por células B. Sabese também que uma população e TH1 é capaz e inibir a ação e TH2 e vice versa. O γ-IFN secreta o por TH1 inibe TH2, enquanto que a Il-10 libera a por TH2 inib e a liberação as citocinas e TH1 e talvez as células T citotóxicas e NK. As c élulas que expressam CD8 na membrana po em apresentar variações na liberação e citocinas, muitas elas liberam as mesmas citocinas que TH1 liberam e outras tem o mesmo repertório e citocinas que TH2, talvez estas últimas exerçam um papel re ula or ou supressor. A iferenciação as células CD8 é influencia a pelas sub populações e células CD4. A ativi a e citotóxica as células CD8 está presente enquanto as células TH1 estão ativas. Citotoxici a e Me ia a por Células A cito toxici a e me ia a por células po e ser feita por células T citotóxicas, al umas sub populações e células linfói es, e em etermina as circunstâncias por célul as mielói es. As células citotóxicas só são capazes e lisar células alvo, es e que estejam suficientemente próximas. No entanto nem to as as células citotóxic as operam o mesmo mo o, pois existe o comprometimento e iferentes receptores na forma e ativação o mecanismo citotóxico. Existem três principais tipos e i nteração receptor-li ante: • Antí enos específicos (como peptí eos virais em cél ulas infecta as), são reconheci os por receptores e MHC as células T citotóxic as. Nesse caso a maioria as células é CD8+, mas também envolve al umas CD4+. • Determinantes presentes em células tumorais, por exemplo, são reconheci os por r eceptores em células NK. • Um anticorpo já li a o a um etermina o antí eno (ant í eno viral em uma célula infecta a), é reconheci o pelos receptores Fc presente s em células K; a esta forma e reconhecimento chamamos e Citotoxici a e Celula r Depen ente e Anticorpo (ADCC). Estes são os principais mecanismos, mas existe m outros em que há outras interações li antereceptor que contribuem na estabiliz ação a li ação entre a célula citotóxica e a célula alvo. 28

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Há um rupo e células citotóxicas capazes e reconhecer peptí eos apresenta os por moléculas e MHC presente nas células alvo e que por isso, não epen e o re conhecimento e um antí eno li a o a anticorpo. São chama as e células T citotó xicas MHC restritas, na ver a e são uma sub-população e pequenos linfócitos. A maioria estas células é CD8+ e é capaz e reconhecer antí enos associa os com M HC e classe I, mas aproxima amente 10% as células T citotóxicas MHC restritas tem CD4+ e reconhecem o MHC e classe II. O papel mais importante as células T citotóxicas, talvez seja o e eliminar células infecta as por vírus ao fazer o r econhecimento o antí eno apresenta o junto com o MHC e classe I. Temos também um rupo e células citotóxicas que não precisam reconhecer o MHC, entre elas in cluem-se as células NK e LAK (Limphokine Activate Killer), eralmente estão pre sentes no baço e san ue periférico. As células NK são eriva as os ran es linf ócitos ranulosos (LGL), a maioria as NK são CD3-, CD16+, CD56+ e MHC e classe I+, este último como forma a célula ser reconheci a como própria e não ser lis a a. Quanto as células LAK, sabe-se que em cultura elas são capazes e ter sua a tivi a e citotóxica aumenta a quan o na presença e IL-2. Elas são eriva as e células percursoras pareci as com as células NK. Tem-se o conhecimento e que ex istem células mata oras, mas que não possuem uma função específica, elas possuem CD3+ e CD8+ e apresentam ativi a e citotóxica epen ente o reconhecimento o M HC e classe I, há também uma população que expressa CD3+ e o receptor e célula s T mas que possui pouca ativi a e citotóxica e não precisa fazer o reconhecimen to o MHC. Citotoxici a e Celular Depen ente e Anticorpo (ADCC) As células que esempenham este papel, possuem receptores para a porção Fc as imuno lobulinas, principalm ente I G, e costumam a se li ar à células alvo recobertas por anticorpos. Os pri ncipais alvos este tipo e células, são as células infecta as por vírus que apr esentam antí enos virais em sua superfície, moléculas e MHC e al uns epítopos p resentes em tumores. Embora alvo e controvérsias, também é ito que monócitos e polimorfonucleares po em atacar células tumorais recobertas por anticorpos. Al umas células mieloí es como os monócitos e eosinófilos, tomam parte nesse estímu lo celular me ia o por anticorpo. Nesse último caso a reação celular ocorre cont ra parasitos e a classe a anticorpos envolvi os parece ser a I E. Diante isso levantou-se a possibili a e e que a I E promove inicialmente os mastócitos a e ranularem fatores quimiotáticos para eosinófilos e estes ataquem o parasito em questão. Este tipo e mecanismo parece ser controla o pelas células TH2, uma vez que elas liberam IL-4 e IL-5 que tem papel na promoção o aumento a população e eosinófilos, mastócitos e linfócitos B pro utores e I E. 29

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O mecanismo básico pelo qual as células ADCC, T citotóxicas, NK e Linfói es K ex ercem sua função é bem pareci o, este envolve três fases istintas: 1. Li ação a célula com a célula alvo 2. Liberação o conteú o citotóxico as vesículas, es ta etapa é Ca2+ epen ente. Nesta etapa a célula alvo sofre alteração e sua est rutura e já se prepara para a morte. 3. Morte a célula alvo Este mo elo simples é basea o na observação e vesículas os Gran es Linfócitos Granulosos (LGL), c élulas NK e al umas células T citotóxicas, que contém perforina (uma proteína co m ativi a e semelhante a fração C9 o complemento), e serina esterase, envolvi a na monta em o processo lítico. Na presença e Ca2+, os monômeros e perforina se li am a membrana a célula alvo e se polimerizam forman o o canal transmembra na. É bom ressaltar que as células citotóxicas são resistentes a ativi a e a pe rforina e por isso po em continuar ativas, esta resistência parece ser conferi a pela proteo licana presente nas vesículas, que se li a e inativa as perforinas. As perforinas terminam por levar a célula alvo a apoptose com a fra mentação o DNA e esinte ração celular em pequenos pe aços, que são rapi amente captura os e estruí os por outras células, isto sem provocar um ran e processo inflamató rio. Nem to as as células com ativi a e citotóxica são capazes e pro uzir perfo rina e, por isso, sua ativi a e citotóxica é menor, uma vez que ela eve ter out ros mecanismos menos eficazes e estruição a célula alvo. As vesículas as cél ulas T citotóxicas parecem conter TNFα, TNFβ (Linfotoxina) e fator citotóxico de NK (NKCF), no entanto não se sa e direito o papel destas citocinas uma vez que elas levam de 3 a 4 horas para exercer seu efeito citotóxico. As células mielóid es tem sua atividade citotóxica ainda não totalmente conhecida, sa e-se que junt o com a li eração de TNFα e γIFN(este último libera o por células T e NK), há um aumento e ativi a e a ciclo-oxi enase e lipo-oxi enase a célula alvo, com a consequente liberação e ra icais livres intracelulares, também ocorre a liberaç ão e ra icais livres a ca eia e transporte e elétrons a mitocôn ria e mu an ças na síntese proteíca. As células mielói es também são capazes e liberar me i a ores tóxicos como oxi ênio reativo e interme iários nitro ena os. O papel os Macrófa os Sabe-se que os macrófa os estão envolvi os em praticamente to os os e stá ios a resposta imune, a in o antes mesmo a resposta me ia a pelos linfócit os T. Também é sabi o que eles atuam na ativação e células T ao liberar etermi na as citocinas e atuam na resposta coor ena a pelos linfócitos T, me ian o a re sposta inflamatória, tumorici a e microbioci a. Muitas as ações os macrófa os são conheci as a partir e estu os in vitro, on e se escobriu que o γIFN é capa z e ativar sua capaci a e e pro ução e óxi o nítrico enquanto que o TNFα é c p z de ument r su liber ção. T mbém foi possível s ber que os m cróf gos são 30

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des tiv dos qu ndo n presenç de Prost gl ndin E e glicocorticóides. Há lguns nos trás foi descoberto o F tor Des tiv dor de M cróf gos, encontr do como pr oduto de célul s tumor is, este f tor é c p z de bloque r tivid de do γIFN. Formação e ranuloma Quan o a resposta me ia a por células falha na estruição e um micror anismo por ele ser resistente ao ataque, as células T continuam lib eran o lifocinas que levam a formação o ranuloma. A formação o ranuloma é ob serva a, por exemplo, em infecções por Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Le ishmania spp e Lysteria monocyto enes e or anismos ran es como o ovo e shistos oma. A característica os ranulomas é conter células eriva as e macrófa os, c uja função ain a não está esclareci a, células epitelioí es e células multinucle a as i antes. Estas células parecem ter mais a função secretória o que fa ocit ária e, ao que parece elas são o resulta o a estimulação crônica os macrófa os pelas linfocinas. A análise o ranuloma mostra que existem células T CD4+ no c entro e, células CD8+ na periferia, su erin o que as CD4+ tem importância na in ução ao acúmulo e ativação e outros linfócitos e macrófa os. Estu os in vitro m ostram que as lifocinas libera as por TH1 e TNFα são essenci is nesse p pel. No modelo nim l de infecção pelo schistosom em r tos há necessid de de célul s TH2.

 

 

Regul ção feit por ntígenos Célul s T e B podem ser tiv d s por ntígenos ss im que eles se lig rem receptores específicos, no c so dos linfócitos T lig ção não se dá com o ntígeno m s sim com p rte desse que p ssou por um process m ento e foi lig do o MHC de cl sse I ou II. A form com que o ntígeno é dminis tr d e n turez do ntígeno t mbém tem profund rel ção com form d respos t imune. Como exemplo temos cápsul poliss c rídic de b ctéri s que ger lmen te induzem produção de IgM, enqu nto que s proteín s induzem respost celul r e humor l. Gr ndes qu ntid des de ntígeno o invés de produzir tiv ção, p odem lev r o fenômeno de Tolerânci , que pode ser T especific e/ou B específic . Como exemplo, se for dministr d um lt dose de poliss c rídeo em um nim l, este pode ter induzid su tolerânci este ntígeno. 31

 

REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE A respost imune pode ser regul d de vári s m neir s, veremos brevemente s princip is del s, pen s o suficiente p r que poss mos entender como que isso influenci nos ex mes l bor tori is.

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Regul ção por nticorpos Os mec nismos pelos qu is os nticorpos regul m respo st imune ind não estão tot lmente definidos, s be-se que os nticorpos são c p zes de induzir um controle neg tivo n respost imune isso é observ do qu ndo se dministr um ntígeno junto com IgM específic , neste c so ocorre um estímul o d respost imune p r este ntígeno, o p sso que, se for dministr d IgG no lug r d IgM ocorre um supressão n respost . A plic ção prátic deste conhec imento é feit , por exemplo, n plic ção de v cin s p r c xumb e s r mpo, el s não são dministr d s em cri nç s com menos de 7 meses. Isso porque os níveis de IgG oriund s d mãe, perm necem em circul ção por té 6 meses pós n scimento e, com dministr ção d v cin nesse período ger ri um respost in dequ d , p or não h ver o estímulo produção de m is nticorpos. Outro exemplo está nos c sos em que há incomp tibilid de de Rh. A dministr ção de nticorpos p r Rh n mãe Rh-, evit que el sej sensibiliz d pel s hemáci s Rh+ d cri nç no mom ento do p rto, removendo s pouc s hemáci s que por ventur cheguem mãe tr vé s d tiv ção d c sc t do complemento. Os imunocomplexos t mbém podem ument r ou diminuir respost imune, s imunoglobulin s G e M podem modul r respost vi receptores de Fc e form ção de um imunocomplexo com o imunógeno. Um exemp lo disso está em p cientes com tumores m lignos, onde foi postul do que os imuno complexos circul ntes de nticorpos e célul s tumor is são c p zes de suprimir respost imune. Já form ção de imunocomplexos como o que ocorre com proteín A de est filococos e nticorpo, estimul m respost imune por desenc de r v i clássic e ltern d do complemento. Regul ção por linfócitos Conforme dito nteriormente, dependendo d sub-popul ção de linfócitos T tiv d (TH1 ou TH2), respost ocorre de form diferente. Há t mbém evidênci de que s célul s T podem f zer supressão d respost imune. As célul s CD4+ podem evit r que ocor r utoimunid de, embor não se conheç o mec nismo pelo qu l el s f zem isso. S be-se t mbém que liber ção de citocin s como TGFβ, IL-4 e IL-10 podem supri mir a resposta imune parcial ou totalmente. A produção de citocinas pelas difere ntes su -populações de linfócitos TH CD4+, mostra porque ocorre a indução na pro dução de I E, tam ém a re ulação cruzada das su -populações de linfócitos T most ra que citocinas como o γIFN secretado por células TH1 pode ini ir a resposta de TH2. A IL-10 li erada por TH2 faz a supressão da expressão de B7 e produção de IL-12 por parte das células APC, o que tam ém aca a por ini ir a ativação de TH1 . No entanto parece que a função fisioló ica de TH2 é mesmo de re ular a respost a, conforme modelo realizado em ratos de la oratório, em que ao se remover a pop ulação TH2, o rato tinha a resposta imune exacer ada. Já as células CD8+ parecem desempenhar o papel de transferir a resistência e a tolerância, este efeito par ece ser mediado pela TGFβ. 32

       

   

   

         

   

     

   

 

 

   

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Re ulação neuroendócrina Em condições de estresse pode ocorrer a supressão da re sposta imune, como por exemplo a maior dificuldade de uma pessoa se recuperar de uma infecção. A re ulação feita pelo sistema nervoso central (SNC), pode ocorre r so dois aspectos, numa devido a maioria dos tecidos linfóides e vasos san uín eos terem enervação simpática, aca a influenciando na re ulação dos linfócitos. Tam ém o sistema nervoso controla de forma direta ou indireta a li eração de vár ios hormônios, envolvendo peptídeos pituitários e hormônios esteroídais adrenais em particular, corticosteróides, hormônio do crescimento, tiroxina e adrenalina . As células nervosas costumam apresentar receptores para produtos do sistema im une, assim como os linfócitos apresentam receptores para vários hormônios, neuro transmissores e neuropeptídeos, incluindo-se al uns para as catecolaminas (adren alina e nor adrenalina), encefalinas, endorfinas, su stância P e peptídeo intest inal vasoativo (VIP), a resposta varia entre os diferentes linfócitos e monócito s. Como exemplo temos a prolactina re ulando a função linfocitária, em condições de estresse há a li eração de corticosteróides, endorfinas e encefalinas as qua is tem efeito imunosupressivo. Foi evidenciado tam ém que os linfócitos podem re sponder a corticotrofina, li erando um fator que as faz erar seu próprio ACTH, o qual é capaz de ativar a li eração de corticosteróides. A su stância P parece ter papel nas reações de hipersensi ilidade como a artrite e a asma, ao ser li e rada pelo sistema nervoso, parece atuar em cima das juntas e do trato respiratór io perpetuando o processo inflamatório e, pelo menos in vitro ela parece atuar n a quimiotaxia de macrófa os e fazer com que mastócitos de ranulem. Outro exemplo , encontramos nas células como os macrófa os, que quando ativados li eram IL-1, esta a e no hipotálamo produzindo a fe re. Controle enético Estudos realizados com diferentes rupos populacionais tem demonstrado que a resposta imunoló ica p ode variar entre eles por um fator enético. Um dos exemplos está em famílias qu e são suscetíveis ao Coryne acterium diphtheriae, isto devido a uma característi ca intrínseca deles. Outro exemplo está na suscepti ilidade de al umas famílias de Japoneses descendentes da ilha de Okinawa ao HTLV; tam ém tem-se conhecimento de rupos suscetíveis ao Myco acterium tu erculosis, assim como outros suscetív eis ao vírus da hepatite B e por isso incapazes de montar uma resposta contra es tes a entes. Parte dessa resposta parece ser determinada pelos enes que control am a monta em do MHC de classe II pois, de acordo com sua estrutura ele poderá t er maior ou menor afinidade por determinados peptídeos. Mas há tam ém a influênc ia de outros enes não li ados ao MHC que parecem influenciar, como exemplo temo s a Imunodeficiência Severa Com inada (SCID) que ocorre devido a falta do ene d a recom inase, outro exemplo está na Deficiência da Adesão Leucocitária, promovi da por mutações na su unidade da β2 inte rina, o que leva a falha na expressão d e LFA-1, CR-3 e CR-4. O FENÔMENO DA TOLERÂNCIA 33

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A tolerância imunoló ica é um fenômeno que o or anismo se torna incapaz de respo nder para determinado antí eno. A auto-tolerância é a mais importante de todas p ois é aquela em que o or anismo aprende a não produzir uma resposta imune contra si. Não é a estrutura de uma molécula que irá induzir o fenômeno da tolerância e sim fatores como o tempo que os linfócitos entraram em contato com os epítopos , o local de encontro, a natureza das células que apresentaram os epítopos e a p rodução de fatores co-estimulatórios por estas células. A tolerância pode ser di vidida em dois rupos, a sa er, a tolerância central e a tolerância periférica. Entende-se por tolerância central aquela que ocorre durante a maturação das célu las T no timo e, das células B na medula óssea, já a tolerância periférica, é aq uela que ocorre nos tecidos periféricos. Após as células pró-T saírem da medula, elas che am ao timo e, é aí que as células T se desenvolvem a partir de percurs ores em que não foi feito o rearranjo dos enes do Receptor de Célula T (TCR). E stes enes são rearranjados durante o desenvolvimento dos linfócitos tímicos, de forma que os linfócitos T possam expressar TCRs que os permita reconhecer produ tos de de radação anti ênica ou peptídeos quando estes são apresentados junto co m a molécula de MHC. Da mesma forma como ocorre uma alta proliferação de linfóci tos T no timo, tam ém ocorre uma alta taxa de mortalidade destes, a maioria CD4+ e CD8+, tudo isso faz parte do processo de seleção dos timócitos. As células qu e não são destruídas, so revivem porque possuem al um rau de afinidade com re i ões polimórficas do MHC. Os timócitos se encontram com células corticais epiteli ais que lhe apresentam moléculas de MHC, se estas forem capazes de se li ar, pre sume-se que seja dado um sinal para que estejam prote idas da morte celular. Ess a seleção positiva arante que as células T amadureçam e sejam capazes de reconh ecer os peptídeos de li ação das moléculas de MHC assim se tornando tolerantes a o próprio MHC. A seleção positiva no entanto, não conse ue evitar a diferenciaçã o de células T expressando TCR de alta afinidade por peptídeos próprios e por mo léculas de MHC. Deve haver al um processo de seleção ne ativa para estas molécul as. Um dos processos prováveis, envolve a li ação das moléculas Fas do linfócito T com a FasL expressa por al umas células presentes no timo, no entanto, este p rocesso da interação Fas-FasL parece ocorrer com maior frequência na tolerância periférica. Como tanto o processo de seleção positiva e ne ativa envolvem o reco nhecimento de peptídeos próprios associados com MHC, parece que os sinais dados através do mesmo TCR leva a seleção celular de acordo com a afinidade de li ação do TCR com seu epítopo e a concentração do mesmo. Quanto mais forte for a li aç ão com o epítopo, será dado o sinal para a seleção ne ativa. A existência de vár ios sinais diferentes para cada processo seletivo é provavelmente a razão pela q ual os co-receptores de CD8 são essenciais para a seleção positiva, mas não nece ssária para a seleção ne ativa a menos que a afinidade do TCR pelo peptídeo este ja aixa. A seleção ne ativa depende de uma série de fatores, os quais incluem o desenvolvimento da célula T a acessar o antí eno self, a com inação do TCR e mo léculas acessórias como a CD8 ou CD4 34

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para o complexo peptídico que compõe o MHC próprio e a identificação e deleção d as células. A seleção ne ativa não requer células APC, é eralmente realizada po r células dendríticas do timo ou por macrófa os presentes na junção córtico medu lar e são ricas em MHC da classe I e II deste modo, elas podem se li ar a célula s T que tem alta afinidade por peptídeos próprios. Há suspeita de que outras cél ulas tam ém possam estar envolvidas nesse processo, inclusive se acredita que os próprios timócitos tomem parte neste processo. Existe tam ém um rupo de célula s especializadas, em in lês chamadas de “veto cells”, que expressam seus próprio s epítopos e emitem um sinal ne ativo que mata o clone auto-reativo. Em condiçõe s fisioló icas, o sinal dado por estas células veto, ocorre quando uma célula T que expressa o TCR para o epítopo próprio se li a a célula veto que expressa os epítopos próprios. Para que o efeito da célula veto ocorra o TCR deve se li ar a o epítopo próprio que está associado com o MHC de classe I presente na célula ve to, enquanto o CD8 da célula veto se li a ao MHC de classe I presente na célula T deste modo, assim que essa li ação ocorre a célula T é morta. As células T que escapam do processo de tolerância central, ainda podem sofrer o processo de sel eção periférica, neste caso, existem pelo menos três tipos de processos conhecid os, são eles: 1. Deleção clonal pela indução a morte celular 2. Aner ia clonal 3 . Supressão periférica por células T No processo de deleção clonal pela ativação da morte celular, um dos prováveis fatores para este, parece ser o da li ação d as moléculas Fas-FasL. Sa e-se que várias células além dos linfócitos expressam o Fas (CD95), que é um mem ros da família de receptores do TCR, o li ante do Fas , é a molécula FasL, que homólo a ao TNF, este é expresso por células T ativadas . A partir do momento em que uma célula T expressando o Fas se li a a célula T c om o FasL, é dado um sinal para que a célula T com o Fas entre em apoptose, elim inando-se assim a célula T autoreativa. Ao que parece devem ocorrer outras inter ações entre outros receptores para que haja a indução da apoptose da célula auto reativa, al uns autores falam que o estímulo repetitivo das células T auto reat ivas com o antí eno próprio, levaria estas células T a ficarem no estado ativo e assim expressarem mais Fas, o que as levaria mais facilmente a rea irem com a c élula T expressando o FasL. Sa e-se até o momento, que ratos que não expressam c élulas com o FasL, sofrem de uma doença auto imune semelhante ao Lupus Eritemato so Sistêmico (SLE), só que com uma intensa linfoploriferação. O processo de Aner ia Clonal, envolve a inativação prolon ada ou irreversível dos linfócitos T, es ta indução ocorre so certas circunstâncias. Como sa emos, as células T se torna m ativas a um determinado antí eno quando estas são apresentadas a ela via MHC e há a presença do sinal coestimulatório como a li ação do CD28 da célula T ao B7 da célula apresentadora de antí eno. Se a célula apresentadora de antí eno não é capaz ou, se ela não expressa B7, a célula T então se tornará anér ica a este antí eno. Posteriormente, mesmo que a célula anér ica a determinado antí eno, ve nha 35

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a sofrer a apresentação de um antí eno para o qual ela é anér ica por uma APC pr ofissional, expressando B7, ela continuará anér ica. Na supressão periférica por células T, esta parece ocorrer por ação de células TH2 li erando al umas citoci nas em cima de uma determinada célula TH1 auto reativa, pois ao que parece os au to antí enos, são capazes de fazer as células TH2 expressarem um resposta seleti va de supressão a favor do próprio. Tolerância das células B aos antí enos própr ios Quando se fala de tolerância das células B a nível de medula óssea, parece q ue o processo de seleção é parecido com aquele que ocorre com as células T no ti mo, ou seja, quando as células B que estão em desenvolvimento encontram um antí eno de mem rana e se li am a este ainda na medula, elas entram em apoptose, mas isso não evita que saiam células B auto reativas da medula pois é possível encon trar células B com receptores para colá eno, tireo lo ulina e DNA no san ue peri férico de al umas pessoas. Em ora a tolerância das células B possa ser comandada pelas células T, em determinadas ocasiões as células B podem se tornar tolerant es sem esta interferência. Um exemplo são al uns micror anismos que apresentam r eação cruzada com epítopos reativos das células T e apresentam epítopos que são capazes de estimular células B. Tais antí enos são capazes de provocar um forte estímulo na produção de anticorpos a antí enos próprios. Além disso os receptore s de imuno lo ulinas em células B maduras estimuladas podem sofrer hipermutação e por isso podem se tornar anti-self reativas num está io tardio. A tolerância d eve ser imposta as células B durante o seu desenvolvimento e após o estímulo ant i ênico nos tecidos linfóides secundários, e ao que parece, é aí que as células B que rea em com antí enos próprios são excluídas. As células B tam ém podem sof rer o processo de aner ia clonal, neste caso, parece que se elas encontram um de terminado antí eno e não encontram a célula T específica para fazer a apresentaç ão do mesmo, o complexo antí eno-receptor é suprimido e a partir daí esta célula B nunca mais irá expressar a imuno lo ulina de superfície para este antí eno as sim como nunca mais será estimulada pela célula T para que produza imuno lo ulin as para este antí eno que ela foi ini ida. As células B tam ém podem se tornar a nér icas quando expostas a randes quantidades de antí enos monoméricos solúveis . Parece que a supressão ocorre quando o antí eno se li a a I M presente na mem rana do linfócito B. Esse mecanismo provavelmente não tem a participação das cél ulas T supressoras ou de células B anti idiotípicas. As células B anér icas pode m voltar a responder desde que sofram o estímulo pelas células TH, este estímulo é realizado via CD40 (presente nas células B) com os receptores presentes nas c élulas T e tam ém por receptores de I D. Por outro lado a expressão das molécula s B7 na célula B é prejudicada, este defeito pode ser superado se as células B s ofrerem o estímulo por citocinas como a IL-4 e/ou ativadores policlonais como os lipopolissacarídeos. 36

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Baixas concentrações de antí eno tam ém pode levar a tolerância, asta que estes entrem em contato com células B imaturas, o que leva ao processo de a orto clon al. Outro processo que pode levar as células B a se tornarem tolerantes é o que se chama de exaustão clonal, neste caso o imunó eno é capaz de ativar todos os c lones de linfócitos B existentes para ele. Isto leva a maturação dos linfócitos B e a produção de anticorpos para o antí eno em questão, o que aca a levando, de pois de um determinado tempo, a exaustão das células B, o que enfraquece a respo sta imune para este antí eno. REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE Chamamos de reações de hipersensi ilidade aquelas que ocorrem de forma exa erada ou de forma inapropriada. São reações oriundas de uma resposta normal, mas que em al um momento se processam de forma indevida e al umas vezes promove um processo inflamatório ou causa lesão tecidual. Estas re ações não aparecem no primeiro contato do indivíduo com o antí eno, mas sempre n um contato posterior. Gell e Coom s descreveram quatro tipos de reações de hiper sensi ilidade, assim classificadas como I, II, III e IV, mas na verdade al umas das vezes temos a manifestação de mais de um tipo de reação de hipersensi ilidad e em conjunto. As três primeiras reações são reações dependentes de anticorpos e a última é mediada pelas células T e macrófa os. A reação do tipo I ocorre quan do a I E é produzida e normalmente se diri e a antí enos inócuos como pólen, áca ros e pelo de animais. A li eração de mediadores farmacoló icos por parte de mas tócitos sensi ilizados produz uma reação inflamatória a uda com sintomas como as ma e rinite. A reação do Tipo II, ou reação citotóxica dependente de anticorpo o corre quando o anticorpo se li a a um antí eno próprio ou estranho presente nas células e leva a fa ocitose deste, via atividade matadora das células ou via lis e mediada pelo complemento. A reação do Tipo III ocorre quando há a formação de imunocomplexos em rande quantidade e que não conse uem ser eliminados pelas cél ulas do sistema retículo endotelial, levando a reações como a doença do soro. Po r fim, a reação do tipo IV, tam ém chamada de hipersensi ilidade tardia, ocorre quando antí enos, como o acilo da tu erculose, são capturados por macrófa os e não conse uem ser destruídos. Neste processo há o estímulo de células T que pass am a li erar citocinas as quais mediam as respostas inflamatórias. Hipersensi il idade do Tipo I É caracterizada como uma reação alér ica que ocorre imediatament e após o contato com o antí eno ou aler eno. Seus sintomas clínicos foram descri tos em 1923 por Coca e Cooke, os quais incluíam asma, eczema, fe re, urticária e aler ia a comida. Geralmente ela ocorre em pessoas que apresentam al um históri co familiar de aler ia tam ém. 37

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As reações do Tipo I, são dependentes de I E li adas a mastócitos ou asófilos, pois a partir do momento em que a I E se li a ao antí eno, ela sensi iliza os ma stócitos a de ranularem, desta forma levando ao processo inflamatório. Ao que pa rece, quando os mastócitos são ativados há a li eração de citocinas como a IL-3, IL-4, que atuam nos mastócitos, outras capazes de ativar os linfócitos B a prod uzirem e secretarem I E; IL-5, IL-8 e IL-9, que parecem ativar a quimiotaxia e a tivação de células inflamatórias ao sítio de inflamação. A produção da I E depen de da apresentação do antí eno por uma APC e da cooperação entre células B e TH2 . Assim que a I E é produzida ela cai na circulação e se li a a receptores espec íficos para ela, presentes em asófilos e mastócitos. Aliás está é uma caracterí stica da I E, ela se li a a mastócitos e asófilos via o receptor de Fc presente nestas células. Apesar de a I E durar al uns dias, os mastócitos e asófilos pe rmanecem sensi ilizados para a I E por meses, isto devido a alta afinidade que a I E apresenta para o receptor FcεRI, o qual vita qu a IgE s ja d struída por prot as s séricas. Só como curiosidad , as células também apr s ntam um r c ptor d Fc, d nominado d FcεRII, só qu st t m baixa afinidad p la IgE. Em manif staçõ s alérgicas inf cçõ s parasitárias, os nív is d IgE stão s mpr l va dos, mas as r açõ s alérgicas não s manif stam ap nas p la l vação sérica da I gE. Sab -s qu a produção d IgE d p nd da coord nação das células TH2, pois la lib ra citocinas como a IL-3, Il-4, IL-5, IL-9 IL-13, qu ativam a célula B a faz r a troca d class d imunoglobulina assim passar a produzir IgE. A IL -5 lib rada também é capaz d promov r o aum nto do núm ro d osinófilos, l van do a osinofilia tão caract rística nos proc ssos alérgicos. Os mastócitos qu s ão as células nvolvidas n st proc sso, são classificados m dois tipos, os mas tócitos do t cido con ctivo (CTMC) os mastócitos das mucosas (MMC), cada uma d las apr s nta caract rísticas morfológicas próprias assim como prot as s caract rísticas, qu não s rão d scritas aqui por não s r d nosso int r ss . Exist m outras células qu pod m s ligar a IgE com isso t r sua ação citotóxica aum n tada no combat a parasitos como os schistosomas. Estas células pod m s r s nsib ilizadas por compl xos imun s circulant s com isso contribuir no proc sso alér gico já qu las contém uma vari dad d m diador s inflamatórios capaz s d pro mov r a r ação alérgica. Estas células pod m s r o próprio linfócito B, células T, macrófagos, células d Lang rhan é células folicular s d ndríticas as quais, s ligam a IgE via o r c ptor FcεRIIb. A d granulação dos mastócitos basófilos ocorr a partir do mom nto m qu as moléculas d IgE s ligam ao antíg no pr omov m a agr gação dos r c ptor s d Fcε, isto promov o aum nto da ntrada d í ons Ca++ d ntro da célula, r sultando na d granulação. Esta d granulação também pod ocorr r s houv r a ligação cruzada d l ctinas (como a concavalina A), com a r gião Fc da IgE, d sta forma agr gando os r c ptor s Fcε. Isto xplica porqu algumas p ssoas t m urticária quando ntram m contato com algumas plantas, po is pod s r qu stas t nham grand quantidad d l ctinas. 38

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D v mos r ssaltar qu xist m outras substâncias capaz s d faz r os mastócitos basófilos d granular m como os fator s C3a C5a do compl m nto, drogas como o ACTH sintético, cod ína, morfina ionóforos d cálcio (por facilitar m a ntra da d Ca++ na célula). O influxo d cálcio nos mastócitos induzido p lo antíg no t m dois f itos principais, um é qu ocorr a xocitos do cont údo dos grânul os com a lib ração d m diador s pré formados, s ndo qu a histamina é o mais co nh cido, outro é qu ocorr a indução da sínt s d novos m diador s formados a partir do ácido araquidônico, l vando a produção d prostaglandinas l ucotri n os, os quais t m f ito dir to nos t cidos locais. Nos pulmõ s l s l vam a bron coconstrição, d ma d mucosas hip rs cr ção, l vando a asma. Atualm nt é dit o qu xist m dif r nt s populaçõ s d mastócitos produzindo dif r nt s tipos d m diador s. Como prova disto, citamos os anti-histamínicos, qu são ficaz s na s rinit s urticárias, mas não são fici nt s na asma, ond os l ucócitos t m u m pap l mais important . Algumas drogas pod m bloqu ar a lib ração d m diador s , s ja p lo aum nto dos nív is intrac lular s d AMPc, como a isopr nalina qu stimula os r c ptor s β adrenér icos, ou por evitar a que ra do AMPc pela fosfod iesterase como a e a teofilina. O modo de ação do cromo licato de sódio prevenin do os mastócitos de de ranularem ainda não está esclarecido mas parece envolver o mecanismo de entrada de cálcio na célula, e tam ém parece afetar a li eração d e mediadores por outras células. Dia nóstico in vitro Os métodos de dia nóstico para a hipersensi ilidade do Tipo I empre ados nas análises clínicas não são muitos, em eral eles são analisados em conjunto com testes in vivo realizados no paciente. Como nosso o jetivo é o estudo la oratorial, descreveremos de forma reve, os testes in vitro. Dosa em d a I E sérica total Em eral na hipersensi ilidade do tipo I, a I E sérica está a umentada em pacientes que apresentam aler ia a inalantes no entanto a quantidade de I E sérica depende de fatores como idade, sexo, fumo, histórico familiar e p resença de processos infecciosos como parasitoses. A I E sérica é expressa em Un idades Internacionais (UI), cada UI equivale a 2,4 nano ramas de I E, sendo que os valores de referência se aseiam na o servação populacional, portanto não há uma normatização dos mesmos. A ta ela a aixo, mostra os níveis séricos de I E o servados em pessoas normais de acordo com a idade. IDADE VARIAÇÃO (UI/ml) MÉDIA GEOMÉTRICA (+/2DP/UI/ml) Desvio Padrão 0 dia <0,1 - 0,5 0,22 (0,04 – 1,28) 39

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6 semanas 3 meses 6 meses 9 meses 1 ano 2 anos 3 anos 4 anos 7 anos 10 anos 14 a nos 18 – 83 anos <0,1 – 2,8 0,3 – 3,1 0,9 – 28,0 0,7 – 8,1 1,1 – 10,2 1,1 – 49,0 0,5 – 7,7 2,4 – 34,8 1,6 – 60,0 0,3 – 215,0 1,9 – 159,0 1,0 – 178,0 0,69 (0,08 – 6,12) 0,82 (0,18 – 3,76) 2,68 (0,44 – 16,26) 2,36 (0,76 – 7,31) 3,4 9 (0,80 – 15,22) 3,03 (0,31 – 29,48) 1,80 (0,19 – 16,86) 8,58 (1,07 – 68,86) 12, 89 (1,03 – 161,32) 23,66 (0,98 – 570,61) 20,07 (2,06 – 195,18) 21,20 (valores no rmais 10 –20 UI/ml) Em eral os testes para a dosa em total de I E no soro são aseados na metodolo ia de ELISA, mas tam ém dispomos da metodolo ia de quimioluminescência só que a sua popularização só será possível quando estiver a preços mais acessíveis. O pr incipio ásico da maioria dos testes compreende o uso de um anticorpo específico para I E fixado em um suporte onde é colocado o soro do paciente e feita a incu ação. Posteriormente, é feita a lava em do suporte para que os anticorpos não l i ados sejam removidos, e em se uida é adicionado um outro anticorpo específico para I E marcado que se li ará a outra porção da I E . De acordo com a reação qu e é feita a leitura é realizada em um aparelho apropriado que lançara os resulta dos em UI/ml. Testes soroló icos específicos para dosa em de I E Ultimamente dis pomos de vários testes para dosa em de I Es específicas no soro, todos tem quase o mesmo princípio que é de fixar uma porção do antí eno purificado a um suporte . Posteriormente o soro do paciente é colocado em contato com este antí eno para que ocorra a li ação antí eno anticorpo. Toda I E que não for específica para o antí eno não se li ara, e lo o na etapa se uinte, que é a de lava em, será desp rezada. Posteriormente, é acrescentado o conju ado, que é um anticorpo específic o para I E li ado a al uma su stância reveladora ou passível de revelação como a peroxidase, Iodo 125 ou su stâncias derivadas do luminol. O conju ado então se li a ao complexo antí eno anticorpo formado, se li ando apenas às I Es, todo o e xcesso que não se li ar é removido com uma lava em posterior. Dos testes disponí veis temos os de Radioimunoensaio, que já estão caindo em desuso devido aos pro lemas que os materiais radioativos apresentam, o teste de ELISA e suas variações e os testes de Quimioluminescência. 40

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Todos estes testes apresentam oa sensi ilidade, no entanto o que apresenta maio r sensi ilidade e permite quantificar a I E com maior exatidão é o teste que emp re a a quimioluminescência. REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE TIPO II As reações do tipo II são mediadas por anti corpos da classe I G e I M que se li am a células ou tecidos específicos com iss o, o dano causado se restrin e as células adjacentes ao antí eno. As reações do tipo II diferem do tipo III porque, nesta última a reação ocorre com antí enos s olúveis presentes no plasma, formando imunocomplexos que aca am por se depositar de modo não específico em determinados tecidos e ór ãos. Os mecanismos pelos qu ais a reação do tipo II ocorre, se dá inicialmente pela li ação do anticorpo a c élula alvo, desencadeando a ativação da via clássica do complemento, com isso, o s fra mentos C3a e C5a do complemento atraem macrófa os e polimorfonucleares ao local, assim como estimula mastócitos e asófilos a li erar su stâncias que irão atrair mais células ao sítio de reação. A via clássica do complemento tam ém pr omove a deposição de C3 , C3 i e C3d na mem rana da célula alvo, facilitando ass im sua fa ocitose ou destruição por células matadoras. Ainda com relação a via c lássica do complemento, pode se o servar a formação do complexo de ataque a mem rana (MAC) que leva a lise da célula alvo. As células que participam deste proce sso são macrófa os, neutrófilos, eosinófilos e células K (Killer), que se li am ao anticorpo complexado com a célula alvo, via o receptor de Fc ou via os fatore s C3 , C3 i e C3d do complemento depositados na mem rana da célula alvo. A li aç ão do anticorpo via receptor de Fc, estimula as células fa ocitárias a produzire m mais leucotrienos e prosta landinas, que terminam por aumentar a resposta infl amatória. Quininas e moléculas quimiotáticas como o C5a, leucotrieno B4 (LTB4) e peptídeos da fi rina tam ém contri uem nesse processo de quimiotaxia. Diferente s classes de anticorpos produzem raus variáveis na capacidade de induzir esta r eação, dependendo da afinidade com que se li a a C1q ou com a capacidade de se l i ar ao receptor de Fc das células participantes da reação. Componentes do compl emento ou I G a em como opsoninas ao se li arem ao antí eno, com isso as células fa ocitárias fa ocitam com maior facilidade. As opsoninas, além de aumentar a a tividade fa ocitária, potencializar a capacidade dos fa ócitos de produzir inter mediários do oxi ênio reativo, tam ém promovem o aumento da capacidade de destru ição do pató eno assim aumentando o dano imunopatoló ico. Isso pode ser o servad o nos neutrófilos do liquido sinovial de pacientes com artrite reumatóide, onde a capacidade deles produzirem superóxido é maior do que a dos neutrófilos encont rados na circulação. É suposto que isso ocorra devido a ativação dos neutrófilos presentes na junta por mediadores como os complexos imunes e fra mentos do comp lemento. 41

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Os mecanismos pelos quais as células efetoras destroem a célula alvo na reação d o tipo II é idêntico ao que acontece na destruição de micror anismos só que, com o a célula não conse ue fa ocitar al o maior que ela, os neutrófilos fazem a exo citose de seu conteúdo lisosomal, deste modo lesando a célula alvo e as células adjacentes. Em al umas reações como a que acontece com os eosinófilos ao rea ir com os Schistosomas, a exocitose do conteúdo dos rânulos é enéfica, mas quando os alvo é o tecido do hospedeiro que foi sensi ilizado com anticorpos o dano te cidual é inevitável. As células K tam ém podem se li ar a células reco ertas com anticorpo via receptor de Fc, a partir daí elas de ranulam citotoxinas capazes de destruir vários tipos de células, o mecanismo pelo qual elas atuam parece ser idêntico ao das células T citotóxicas. No entanto a maior ou menor atividade da célula K parece depender da quantidade de antí eno expresso na superfície da cé lula alvo. Al umas formas de expressão da reação de Hipersens ilidade do Tipo II Reação contra hemácias e plaquetas Estas reações são as mais comuns de serem o servadas, elas podem ocorrer em circunstâncias como, a transfusão san uínea inco mpatível, onde a pessoa que rece e as hemácias é sensi ilizada pelos antí enos p resentes na superfície desta; na Doença Hemolítica do Recém Nascido, é outra das formas de expressão deste tipo de hipersensi ilidade, onde a mulher rávida é s ensi ilizada pelas hemácias fetais; e tam ém nas Anemias Hemolíticas Autoimunes onde o indivíduo é sensi ilizado pelos próprios eritrócitos. Com relação as plaq uetas, ela aparece no Lupus Eritematoso Sistêmico, onde elas promovem a trom oci topenia e reações com neutrófilos e linfócitos. Reações Transfusionais Estas rea ções ocorrem quando o receptor possui anticorpos para as hemácias do doador. São conhecidos mais de 20 rupos san uíneos, o que era mais de 200 variantes enét icas. Cada rupo san uíneo consiste de um locus no ene que é capaz de expressar um antí eno na mem rana da hemácias a al umas células do san ue. Em cada sistem a existem dois ou mais fenótipos. No sistema ABO encontramos 4 fenótipos, A, AB, B e O o que corresponde aos 4 rupos san uíneos. Uma pessoa com determinado ru po san uíneo é capaz de reconhecer eritrócitos não próprios e por isso é capaz d e montar anticorpos para estas hemácias com antí enos alo ênicos. Os rupos A, B , AB, O e Rh são fortes imunó enos, seus epítopos aparecem em vários tipos celul ares e estão localizados em unidades de car ohidrato de licoproteínas. A maiori a das pessoas desenvolve anticorpos para os rupos alo ênicos sem que tenham tid o contato com hemácias não próprias, isto porque umas série de micror anismos ex pressa antí enos parecidos com os do rupo ABO. Já o sistema Rhesus é de extrema importância pois ele é a principal causa da Doença Hemolítica do Recém Nascido. Os antí enos Rhesus são proteínas lipídio dependentes distri uídas na superfíci e celular. 42

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Existem outros rupos san uíneos mais raros como os epítopos do sistema MN, que são expressos na porção N-terminal licosilada da licoforina A que é uma licop roteína presente na mem rana da hemácia. A anti enicidade é determinada pelos am inoácidos 1 e 5. Associado ao sistema MN temos tam ém os antí enos Ss, que são e xpressos pela licoforina B. De modo eral pode-se dizer que as reações transfus ionais causadas por estes rupos menores são mais raras, a menos que, o receptor seja su metido a transfusões repetidas com estes rupos. A forma mais simples d e se sa er se o san ue de uma pessoa é compatível ou não com outro, é a reação d e prova cruzada, nesta reação misturamos o san ue do doador com o do receptor, s e houver a presença de anticorpos para o sistema ABO alo ênico será possível o s ervar a a lutinação de hemácias. Deve-se tomar cuidado com os rupos san uíneos menos comuns e mais fracos pois estes causam a lutinação mais randa, só percept ível com o auxílio de um microscópio ou por vezes só detectável com o Teste de C oom s. Se uma pessoa é transfusionada com o san ue total, faz-se necessário veri ficar se o soro do paciente não apresenta anticorpos para o san ue do receptor. A transfusão com san ue incompatível leva a uma reação imediata com sintomas clí nicos como fe re, hipotensão, náusea, vômito e dor a dominal. A ravidade da rea ção quantidade de hemácias administrada. Os anticorpos para o sistema ABO são e ralmente da classe I M, mas tam ém temos a participação da I G onde, as células sensi ilizadas com esta classe são destruídas pelas células fa ocitárias do fí a do e aço, não podemos esquecer que tam ém há a participação do sistema compleme nto. A destruição das hemácias pode levar ao choque circulatório e a necrose tu ular a uda do fí ado. A reação hipera uda de ór ãos transplantados, é outra que se deve a formação de anticorpos para o ór ão doado, ela é o servada em tecidos que são revascularizados lo o após o transplante, como no caso de transplante de fí ado. As reações mais severas que ocorrem na rejeição de transplante se devem aos antí enos do rupo ABO e/ou das moléculas do MHC expressos nas células, ond e o dano tecidual é feito pelo sistema complemento nas veias san uíneas e tam ém devido ao recrutamento e ativação de neutrófilos e plaquetas. Doença Hemolítica do Recém Nascido Esta doença ocorre devido a formação de anticorpos maternos, d a classe I G, que rea em com as hemácias do feto. Estes anticorpos, são produzid os na primeira vez no momento do parto que uma mãe Rh-, tem um filho Rh+. Por es se motivo o primeiro filho não apresenta a Doença Hemolítica, pois a mãe só é se nsi ilizada no momento do parto. Na Se unda vez que esta mãe tiver uma criança R h+, os anticorpos I G para as hemácias Rh+, atravessarão a placenta e rea irão c om as hemácias fetais assim, as levando a destruição. O antí eno mais comumente envolvido nesta doença é o Rhesus D (RhD), mas ele tam ém pode envolver o sistem a Kell (antí eno K) aliás, as reações mais comuns hoje em dia se devem ao antí e no K pois este é o menos lem rado, pois ao se falar em Rh sempre se pensa no ant í eno D que é o mais comum. 43 depende da

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Anemias Hemolíticas Autoimunes Este tipo de doença parece ocorrer espontaneament e com a pessoa produzindo anticorpos contra si mesma. Pode-se suspeitar de uma a nemia hemolítica autoimune se o tivermos resultado positivo para o teste indiret o para anti lo ulinas., este teste identifica anticorpos presentes para as hemác ias do paciente. O teste indireto para anti lo ulinas pode ser usado para detecç ão de anticorpos para as hemácias em transfusões san uíneas erradas e tam ém no dia nóstico da Doença Hemolítica do Recém Nascido. As doenças Hemolíticas Autoim unes podem se divididas em três tipos, dependendo da forma como elas se apresent am. Elas podem ser devido a presença de anticorpos autoreativos que rea em com a s hemácias acima de 37oC, pode ser devido a reação de anticorpos capazes de rea ir com as hemácias a aixo dos 37oC ou ainda, pode ser devido a reação de anticor pos para dro as fixadas na mem rana das hemácias. Reações com autoanticorpos reativos a quente (37oC ou mais) Esse tipo de reação normalmente ocorre com anticorpos formados para o sistema Rh. Eles são diferente s dos anticorpos formados para as transfusões incompatíveis pois são formados pa ra epítopos diferentes. É claro que existem anticorpos reativos a quente para ou tro rupo de hemácias, mas eles são muito raros. A maioria das anemias hemolític as tem causa desconhecida, mas al umas são associadas com outras doenças autoimu nes. Este tipo de anemia parece ocorrer como o resultado de uma limpeza dos erit rócitos sensi ilizados por macrófa os do aço. Reações com anticorpos reativos a frio (37oC ou menos) Os anticorpos responsáveis por este tipo de reação normalm ente estão presentes em maior quantidade que os anticorpos reativos à quente. El es eralmente são anticorpos da classe I M, e por isso capazes de ativar forteme nte o complemento. Em eral são anticorpos reativos para o rupo san uíneo Ii. E stes epítopos I e i, são expressos como resultado de uma licosilação incompleta do core polissacarídico, na verdade eles são os percursores polissacarídicos qu e darão ori em aos epítopos do sistema ABO. A reação dos anticorpos com as hemác ias se dá na circulação periférica, principalmente no inverno, pois a temperatur a das extremidades corporais eralmente fica a aixo dos 37oC. Em al uns casos po de levar a necrose periférica devido a formação de microtrom os nos capilares. A anemia severa tam ém está relacionada com a capacidade do anticorpo fixar o com plemento. A maioria das reações deste tipo são o servadas em pessoas idosas, não se sa e o motivo disto, sa e-se apenas que o número de clones de autoanticorpos é limitado. Al umas vezes ela ocorre após uma infecção por Mycoplasma pneumonia e, talvez porque este tipo de micror anismo induza a 44

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formação de uma rande variedade de anticorpos. Supõe-se inclusive que devido a reação cruzada com epítopos de al umas actérias é que essa reação possa ser des encadeada. Reações à dro as li adas às hemácias Este tipo de reação ocorre devid o a anticorpos li ado à dro as que por sua vez estão aderidas à mem rana das hem ácias, ou devido a que ra do mecanismo de auto tolerância. Dro as ou seus meta ó litos podem levar a reações de hipersensi ilidade contra hemácias ou plaquetas e isto parece ocorrer de diversos modos, dentre estes, destacamos a li ação da dr o a as células san uíneas com a formação de anticorpos para esta dro a. Isto foi o servado nos casos de Trom ocitopenia Purpúrica onde após a administração de S erdormida ocorria a destruição das plaquetas. A administração de dro as como Pen icilinas, Quininas e Sulfonamidas pode levar ao desenvolvimento das anemias hemo líticas. Tam ém pode ocorrer devido a formação de imunocomplexos adsorvidos na m em rana de hemácias, e consequente dano devido ao complemento. Outra das formas de ativação da anemia hemolítica se deve a dro a induzir a reação alér ica e por isso são formados anticorpos para os antí enos eritrocitários. Isso foi o serva do em pacientes em que se administrou α-metildop , só que est re ção cess p rtir do momento que dministr ção do medic mento é suspens . Re ções envolvend o neutrófilos e linfócitos Neste c so os nticorpos form dos são lt mente espec íficos, isso é observ do nos c sos de Lupus Eritem toso Sistêmico, no ent nto el es pouco contribuem no qu dro do Lupus. Anticorpos p r pl quet s A m iori dos c sos em que se observ form ção de nticorpos p r pl quet s é n trombocitos e purpúric idiopátic . A trombocitose purpúric idiopátic é um doenç em que remoção d s pl quet s d circul ção é celer d pelos m cróf gos do b ço, e remoção se d pel derênci os receptores dest s célul s. T mbém costum ocorr er form ção de nticorpos p r pl quet s pós s infecções por b ctéri s ou ví rus, m s t mbém pode est r ssoci do com doenç s utoimunes como o Lupus Eritem toso. No c so do Lupus Eritem toso, pode-se detect r nticorpos p r c rdiolip in deridos s pl quet s. Os uto nticorpos p r c rdiolipin e outros fosfol ipídios podem inibir co gul ção, e por isso est r em lguns c sos ssoci do co m trombose de vei s e bortos recorrentes. Re ções contr tecidos Em ger l est re ção ocorre em processos utoimunes, molécul reconhecid como ntígeno é lgum proteín d membr n celul r. Exemplos deste tipo de re ção ocorrem n Sí ndrome de Goodp sture, Pênfigo e n Mi steni Gr vis. N Síndrome de Goodp sture observ mos presenç de nticorpos c p zes de re gir com um glicoproteín d membr n de célul s b s is do glomérulo. Norm lmente cl sse de nticorpo envol vid é IgG e em pelo menos 50% dos p cientes com est síndrome, há p rticip ção de 45

 

     

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nticorpos fix dores do complemento. O result do dest re ção lev necrose sev er e deposição de fibrin nos glomérulos. M s est síndrome pode t mbém envol ver os pulmões, isto porque há presenç de ntígenos n s célul s pulmon res qu e re gem cruz d mente com os nticorpos p r s célul s dos glomérulos. No Pênfi go temos produção de nticorpos p r molécul intr celul r de desão o que c us um sério comprometimento d pele e mucos s com form ção de bolh s. Os p c ientes present m uto nticorpos p r um d s proteín s do desmossom , o que lev form ção de junções entre s célul epidérmic s. Os nticorpos c b m por se p r r s célul s um d s outr s lev ndo form ção d epidermite. N Mi steni G r vis encontr mos fr quez muscul r ocorre devido presenç de nticorpos p r os receptores d cetil colin presentes n superfície d membr n celul r. A m iori dos nticorpos envolvidos nest doenç t mbém são d cl sse IgG. Nem sem pre s doenç s utoimunes envolvem re ção de hipersensibilid de do tipo II, po r exemplo, no c so em que di bete é c us d por um doenç utoimune, embor s e detectem nticorpos d cl sse IgG p r s célul s p ncreátic s, m ior p rte dos d nos imunop tológicos são c us dos por célul s T utore tiv s. T mbém nos c sos em que detect mos nticorpos p r molécul s intercelul res, se supõe que pr imeiro dev ter h vido um ruptur d célul p r então d r origem estes ntic orpos. TESTE DE COOMBS O Teste de Coombs é um prov bem sensível que revel p resenç de qu ntid des pequen s de nticorpo, sendo execut d de du s mod lid de s: Diret e Indiret . A primeir destin -se pesquis de nticorpos fix dos às hemáci s fet is dur nte gr videz e segund pesquis os nticorpos que mãe desenvolveu p r o s ngue d cri nç . COOMBS DIRETO Ess é melhor re ção que s e dispõe té o momento p r que l bor tórios de pequeno e médio porte poss m di gnostic r eritrobl stose fet l e, é t mbém, v lios embor m is difícil no di gnóstico de nemi s hemolític s dquirid s. P r se re liz r este teste necessit -se do soro de Coombs. No comércio podem-se encontr r soros de Coombs tivos p r componentes nti g m e nti não g m . M teri l necessário: Tubos de ens io 7 5x70mm Solução de N Cl 0,85% Soro de Coombs Micropipet de 50μl San ue o paci ente Centrífu a clínica e até 3000 rpm 46

 

                       

 

 

 

     

 

 

 

 

   

 

 

   

     

 

       

                                                                                                                                                                                         

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Pipetas e 1,0 ml ra ua a em écimos Méto o 1. Colher o san ue o paciente com anticoa ulante, lava-lo 3 vezes com salina e fazer uma suspensão a 5% com a sali na. 2. Tomar ois tubos, os numeran o como 1 e 2, colocar neles 50μl e suspensã o e hemácias a 5%. 3. A icionar 2 otas o soro e Coombs no tubo 1 e homo enei zar os tubos. 4. Centrifu ar a 1000 rpm por 2 minutos. 5. Ler a reação ro an o o tubo entre os e os para ressuspen er o botão e hemácias. Resulta o: Presença e a lutinação no tubo 1 e ausência e a lutinação no tubo 2 – Prova positiva Ca so a hema lutinação não seja macroscópicamente visível, coloca-se uma ota a am ostra sobre uma lâmina e vi ro e examina-se ao microscópio. O resulta o é a o conforme a intensi a e a a lutinação em: A lutinação forte Gran es rupos a lut ina os Pequenos rupos a lutina os Raros rupos a lutina os Traços – rupos e 4 a 5 hemácias a lutina as Observação: O tubo 2 é o controle, ele não eve aprese ntar a lutinação nunca. COOMBS INDIRETO Esta reação é usa a para a etecção e a nticorpos no soro o paciente. Material: Tubos e ensaio 75x70mm Soro e Coombs Micropipeta e 50μl Solução salina e 0,85% Suspensão e lóbulos vermelhos norm ais O Rh positivo lava os e suspensos a 5% em salina. Albumina bovina a 20% em s alina. Técnica: 1. Separar o soro o san ue antes e completar 24 horas e colhi o e colocar 50μl em ca a um e ois tubos e ensaio, numeran o-os como 1 e 2. 2 . Acrescentar 50μl e suspensão e hemácias em ca a tubo e homo eneizar. 3. A ic ionar 50μl e albumina bovina 20% no tubo 2 e incubar a 37oC por 15a 20 minutos. 47

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4. Lavar 3 vezes com salina, esprezan o o sobrena ante completamente após a últ ima centrifu ação. 5. Acrescentar 50μl o soro e Coombs sobre os lóbulos lava os e misturar. 6. Esperar cerca e 10 minutos e centrifu ar a 1000 rpm por 1 min uto. 7. Ressuspen er, elica amente, os lóbulos vermelhos observan o a hema lut inação. Resulta o: A ausência e a lutinação in ica a prova ne ativa ou ausência e anticorpos circulantes para o antí eno (hemácias). Se houver a lutinação em qualquer um os tubos, a prova e Coombs é positiva. Deve-se usar o maior número e hemácias com anti enici a e iferente para se i entificar a especifici a e o anticorpo. Po e-se também eterminar o título e anticorpos, proce en o-se il uições sucessivas tais como 1:2, 1:4, ... 1:128. Repete-se o teste com ca a ilu ição. Consi era-se o título como a maior iluição o soro, on e se verifica a he ma lutinação. As reações falso positivas po em ser encontra as quan o: O soro es tiver contamina o com bactérias. A centrifu ação for excessiva. Os reticulócitos ultrapassam a 15%. A si erofilina que acompanha os reticulócitos po e rea ir co m a anti-si erofilina, que po e ser encontra a no soro e Coombs. As reações po em ser falso ne ativas quan o: Usamos tubos sujos. Lava em insuficiente as hemá cias. Usamos antissoros inativos. Usamos antisoro contamina o com soro humano. I ncubamos em temperatura iferente e 37OC por tempo inferior a 15 minutos. Obser vação: Po emos encontrar a prova e Coombs ireta ne ativa ou in ireta positiva na incompatibili a e e rupo san uíneo (por estação ou transfusão). Na ausênci a e transfusão anterior a 2 ou 3 meses, a prova ireta positiva (com a in ireta positiva ou ne ativa) in ica a presença e anticorpo iri i o para as próprias hemácias o paciente. Suspeita-se, nesse caso, a presença e crioa lutinininas. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES Material: Tubos e ensaio 75X70mm Micropipeta e 50μl e 100μl Suspensão e lóbulos vermelhos normais O Rh positivo lava os e suspensos a 5% em salina 48

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Solução salina 0,85% Solução e Poli Etileno Glicol (PEG) Soro e Coombs Técnica : 1. Separar um tubo e i entifica-lo. 2. Colocar no tubo 50μl o soro o pacient e. 3. Colocar 50μl a suspensão e lóbulos vermelhos 4. Centrifu ar por 1 minut o a 1000 rpm. 5. Ressuspen er elica amente as hemácias observan o a presença e a lutinação e/ou hemólise. 6. Acrescentar 100μl e PEG no tubo e homo eneizar. 7. Incubar em banho maria a 37oC por 15 minutos. 8. Observar a presença e hemól ise no sobrena ante. 9. Lavar 4 vezes com salina, ecantan o totalmente o sobren a ante e forma a arantir a retira a completa o PEG. 10. A icionar 50μl o sor o e Coombs no tubo. 11. Centrifu ar por 1 minuto a 1000 rpm. 12. Ressuspen er a s hemácias elica amente observan o a presença e a lutinação e/ou hemólise. Res ulta o: A presença e a lutinação e/ou hemólise no tubo em qualquer uma as fase s é in icativa e reação positiva. A ausência e hemólise e/ou a lutinação no tu bo em to as as fases é in icativa e reação ne ativa. Observação: O PEG é usa o como forma e aumentar a sensibili a e a reação antí eno anticorpo quan o se a iciona o soro e Coombs. Esta técnica auxilia no ia nóstico a oença hemolític a autoimune, nas iscrepâncias o sistema ABO, em provas cruza as incompatíveis, no estu o a incompatibili a e entre a mãe e o feto, e nas investi ações transf usionais hemolíticas. REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO III A Reação e Hipersensibili a e o Tipo III é também conheci a como a Doença os Imunocomplexos. Ela ocorre quan o o com plexo antí eno-anticorpo forma o não é removi o pelas células fa ocitárias, est e mo o o complexo acaba se epositan o em al umas re iões o or anismo, on e sof rerá ação o sistema complemento e e al umas células efetoras. O local e epos ição os imunocomplexos é em parte etermina o pela localização o antí eno nos teci os e em parte pela forma como eles se epositam. 49

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As oenças os imunocomplexos po e ser ivi i a e mo o enérico em três rupos: Imunocomplexos forma os evi o a uma infecção persistente, imunocomplexos evi o a uma oença autoimune e imunocomplexos evi o a inalação e material anti êni co. No caso e uma infecção persistente os efeitos combina os e uma infecção pe rsistente com baixa replicação anti ênica e também, evi o a fraca resposta os anticorpos, leva a formação e imunocomplexos e a eposição estes nos teci os. As oenças as quais po emos incluir neste processo são: lepra, malária, en ue h emorrá ica, hepatites virais e a en ocar ite estafilocócica. Nas oenças autoimu nes o processo é na ver a e uma complicação a oença evi o a pro ução contínua e anticorpos para antí enos próprios. Conforme o número e imunocomplexos no s an ue vai aumentan o, os sistemas responsáveis pela remoção estes (monócitos, e ritrócitos e via o complemento), ficam sobrecarre a os e os complexos vão se e positan o nos teci os. As oenças em que observamos isto ocorrer com maior frequ ência são na artrite reumatói e, lupus eritematoso sistêmico e poliomiosite. Com relação a inalação e material anti ênico, os imunocomplexos são forma os na superfície corporal lo o após a exposição ao antí eno. Tais reações são mais obs erva as nos pulmões após exposições repeti as ao antí eno. Em eral os antí enos são fun os, polém e outros materiais oriun os e plantas e materiais animais. O s exemplos típicos escritos na literatura são o a Doença o Feno ou Doença Pul monar o Fazen eiro e a Doença Pulmonar os Cria ores e Pombos. Nestas oenças encontramos a presença e anticorpos circulantes para actinomicetos ou anticorpo s para antí enos o pombo. Em ambas as oenças encontramos o qua ro e alveolite alér ica e ela, eralmente ocorre após repeti as exposições ao antí eno. Nesse caso o anticorpo envolvi o é a classe I G e não a I E como ocorre na reação o tipo I. Neste caso quan o o antí eno entra no or anismo por inalação ocorre a f ormação e imunocomplexos locais nos alvéolos levan o ao processo inflamatório e fibrose. A precipitação os anticorpos para actinomicetos é encontra a em 90% os pacientes com a Doença Pulmonar os Fazen eiros. No entanto ela também é obse rva a em al umas pessoas sem a oença e que não apresentam a sintomatolo ia típi ca, o que su ere que há o envolvimento e outros fatores tais como as Reações e Hipersensibili a e o Tipo IV. Mecanismos a Reação o Tipo III Os imunocomplexos são capazes e ar início a u ma série e processos inflamatórios, entre eles a interação com o sistema comple mento, eran o fra mentos C3a e C5a, estas frações estimulam a liberação e amin as vasoativas como a histamina e 5-hi roxitriptamina, e também fatores quimiotát icos para mastócitos e basófilos, não esquecen o que C5a também apresenta esta f unção quimiotática. Os macrófa os também são estimula os a liberar citocinas com o o TNFα e IL-1. Além disso, os complexos inter gem diret mente com b sófilos e pl quet s, vi receptor de Fc, induzindo liber ção de min s v so tiv s. As m in s v so tiv s liber d s pel s pl quet s, b sófilos e m stócitos 50

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A Doenç do Soro Ess doenç t mbém é c us d por complexos imunes circul ntes q ue se deposit m n s p redes dos v sos e tecidos lev ndo doenç s infl m tóri s como glomerulonefrite e rtrite. A doenç do soro é n verd de um complic ção d soroter pi , onde doses m ciç s de nticorpos p r ntígenos como o veneno d e ofídios e toxin do b cilo diftérico c b m por estimul r o sistem imune mont r nticorpos, que re girão com estes que for m plic dos como p rte de um t r t mento. Isto porque os nticorpos us dos n soroter pi são ger lmente de ori gem nim l ssim, qu ndo se plic um soro nti-ofídico em um p ciente, como est e é produzido em equinos, o p ciente c b por mont r nticorpos p r s proteín s dos equinos. Est re ção ocorre por excesso de ntígeno, e como os imunocompl exos form dos são pequenos eles lev m muito tempo circul ndo té que sej m f goc it dos pelos monócitos. A form ção dos imunocomplexos é seguid de um qued br upt dos componentes do sistem complemento. A sintom tologi clínic d doenç do soro se deve deposição dos imunocomplexos e d fr ção C3 n membr n b s l de pequenos v sos. Qu nto m ior qu ntid de de nticorpos form dos, m is cresce o t m nho do imunocomplexo e isso f cilit su destruição. N re ção de Arthu s foi observ do que o complemento é import nte p r que re ção se desenvolv , pois ele é que tr i os neutrófilos p r o sítio de infl m ção. O TNFα ge umen t ndo re ção medi d por célul s, t nto ssim, que se for feito o tr t mento c om nticorpos p r TNF, verific -se que sintom tologi clínic d Re ção de Ar thus diminui. A remoção dos imunocomplexos depende deste est r recoberto por C3b p r que monócitos, princip lmente do fíg do e b ço, f ç m f gocitose. Os eri trócitos t mbém são import ntes neste processo pois eles possuem em su membr n o receptor de C3b, o CR1, com isso eles c rreg m os 51

 

promovem retr ção d s célul s endoteli is deste modo ument ndo perme bilid de v scul r e permitindo que ocorr deposição do complexo imune n p rede dos v sos, este complexo por su vez continu estimul r form ção de m is C3 e C 5 . As pl quet s t mbém se greg m no colágeno d membr n b s l jud do pel in ter ção d região Fc do complexo imune deposit do, form ndo ssim microtrombos. As pl quet s greg d s continu m produzir min s e estimul r produção de C 3 e C5 , lém disso como el s liber m f tores de crescimento celul r, p rece qu e estão envolvid s n prolifer ção celul r. Os polimorfonucle res t mbém são tr ídos p r o sítio infl m tório por C5 , eles tem o p pel de f gocit r os imunoc omplexos só que não conseguem, pois os imunocomplexos estão deridos p redes d os v sos. Por esse motivo eles f zem exocitose de su s enzim s. As enzim s dos polimorfonucle res, no soro, são r pid mente in tiv d s devido presenç de in ibidores neste no ent nto, qu ndo nos tecidos s enzim s c b m por destruir o t ecido dj cente o imunocomplexo pois os inibidores qu se não estão presentes.

 

                                         

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         

 

   

 

 

   

   

       

 

 

 

     

 

 

 

   

   

 

       

           

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

     

         

 

 

 

   

 

 

         

   

   

 

   

   

 

 

     

   

   

   

   

 

       

   

 

 

     

 

imunocomplexos opsoniz dos té o fíg do e b ço onde os complexos são removidos p elos m cróf gos tecidu is. No ent nto, neste processo m ior p rte do CR1 é t m bém removid e por isso, nos c sos em que há form ção contínu dos imunocomple xos, eficiênci de su remoção é diminuíd . Os imunocomplexos deridos s hemá ci s t mbém podem ser liber dos n circul ção devido ção enzimátic do F tor I, o qu l cliv C3b lig do membr n d hemáci em C3dg, que é um fr gmento men or deste modo os imunocomplexos c b m sendo removidos por célul s f gocitári s que present m o receptor p r porção Fc dos nticorpos. Em p cientes com b ix os níveis de complemento, princip lmente d vi clássic , lig ção dos imunocom plexos s hemáci s é pequen . P rece que deficiênci do complemento se deve o esgot mento c us do pel doenç dos imunocomplexos ou por um f tor hereditário como no c so d deficiênci de C2. Com isso esses imunocomplexos circul ntes p s s m pelo fíg do e c b m sendo liber dos, dest form c b m se deposit ndo em t ecidos como pele, rins e músculos, onde eles promovem re ções infl m tóri s. O t m nho dos imunocomplexos t mbém influênci n deposição destes, em ger l qu nto m ior ele for, m is r pid mente ele é elimin do, ger lmente em minutos, enqu nto que os menores podem persistir por di s. Isso se deve c p cid de dos imun ocomplexos m iores fix rem melhor o complemento e por isso se lig r melhor s he máci s. Os gr ndes complexos são t mbém liber dos m is lent mente d s hemáci s p el ção do F tor I. A cl sse do nticorpo t mbém tem p rticip ção n remoção do s complexos circul ntes pois nticorpos d cl sse IgG por se lig rem melhor s h emáci s do que os d cl sse IgA, são liber dos m is lent mente ssim dificilment e estes irão se deposit r em órgãos como rins, pulmões e cérebro. Qu ndo s célu l s f gocitári s estão s tur d s, ocorre um umento do número de imunocomplexos circul ntes e consequente umento d deposição destes complexos em loc is como o s glomérulos ren is e outros órgãos. A deposição dos imunocomplexos em determin dos tecidos p rece ocorrer devido o umento d perme bilid de v scul r, qu l se deve ção de m stócitos, b sófilos e pl quet s liber ndo s min s v so tiv s. T nto isto é verd de que se for dministr do um nti-hist mínico em nim is com hipersensibilid de, o efeito infl m tório diminui. M s deposição dos imu nocomplexos p rece ocorrer t mbém em loc is onde pressão s nguíne é elev d e há lt turbulênci como n bifurc ção de rtéri s e em filtros v scul res como no plexo coróide e no corpo cili r dos olhos. Algum s vezes os imunocomplexos s e deposit m em determin dos órgãos como no c so do Lupus Eritem toso Sistêmico, onde deposição ocorre nos rins, e no c so d Artrite Reum tóide em que depos ição se d n s junt s. É provável que o complexo ntigênico form do promov lgu m especificid de que órgão irá se lig r. Um evidênci deste f to é que em r tos o se dministr r um endotoxin ocorre liber ção de DNA, o qu l se lig membr n b s l dos glomérulos. Posteriormente é que ocorre form ção de ntico rpos p r o DNA que irá se lig r o loc l em que o DNA se encontr e í ocorre form ção do complexo imune. T mbém c rg do complexo form do 52

     

   

 

   

 

   

 

             

   

 

 

 

     

       

 

 

   

 

 

                         

 

 

                     

 

   

 

               

 

 

         

 

   

       

   

 

 

 

 

     

 

   

 

     

 

 

 

 

 

 

 

         

 

 

 

 

 

     

 

 

 

     

 

 

 

     

 

 

 

                                                                                                                                                                                                                                   

 

   

 

     

 

   

 

   

 

     

   

 

                   

p rece ser import nte pois complexos com c rg positiv p recem se deposit r n membr n b s l dos glomérulos que present m c rg neg tiv . Detecção dos imunoc omplexos Os imunocomplexos deposit dos podem ser pesquis dos com o uxílio d im unofluorescênci dos tecidos em que re ção está ocorrendo. A pesquis pode ser feit p r pesquis de determin d cl sse de imunoglobulin ou do complemento . De cordo com o p drão de fluorescênci observ do pode-se dizer se o órgão est á muito ou pouco comprometido. Por exemplo, em p cientes com deposição contínu de IgG sub-epteli l como nos p cientes com glomerulonefrite o prognóstico é ru im, já nos p cientes em que os complexos estão loc liz dos no mesângio o prognós tico é melhor. Nem todos os imunocomplexos dão origem um respost infl m tóri , no Lupus Eritem toso Sistêmico por exemplo, pode-se encontr r complexos depos it dos n pele com p rênci norm l. No c so de complexos circul ntes pode-se f zer pesquis dos complexos lig dos hemáci s e dos complexos livres no pl sm . Como os complexos lig dos s hemáci s são menos lesivos que os complexos livre s circul ntes, norm lmente se procur pelos últimos. O problem de se dos r os c omplexos livres está just mente n ção que o F tor I exerce n s hemáci s liber ndo os complexos, por isso todo cuid do deve ser tom do no momento d colet do s ngue, com sep r ção imedi t do pl sm d s célul s s nguíne s, tudo com fi n lid de de torn r o result do o m is próximo do re l possível. A precipit ção d os complexos com Polietilenoglicol (PEG) e estim tiv de qu nto de IgG foi pre cipit do é norm lmente us do p r identific r s IgGs de lto peso molecul r. O PEG promove greg ção dos imunocomplexos; por isso o soro do p ciente o ser c entrifug do, tem os imunocomplexos precipit dos. O precipit do então pode ser qu ntific do por técnic s como imunodifusão r di l ou nefelometri . Os complexos circul ntes t mbém podem ser identific dos pel su finid de pelo complemento C1q, onde C1q está fix do em um suporte sólido, onde se dicion o soro do p cie nte e em seguid um conjug do p r imunoglobulin s m rc do p r que leitur se j feit em um p relho. Outros receptores t mbém podem ser us dos p r se lig r os imunocomplexos como o receptor C3 de célul s B tumor is (célul s RAJI), ou receptor Fc de pl quet s. Deve-se tom r cuid do com dos gem feit com p ciente s suspeitos de terem doenç s utoimunes pois muit s d s vezes estes present m uto nticorpos p r os componentes do sistem de teste utiliz do. No Lupus Eritem toso Sistêmico por exemplo, os p ciente produzem nticorpos p r linfócitos e D NA, que se lig m s célul s RAJI, d ndo result dos f lso positivos p r form ç ão de imunocomplexos. Do mesmo modo nticorpos p r C1q são encontr dos em p cie ntes com Doenç s do Tecido Conectivo, pois C1q tem estrutur semelh nte o do co lágeno, com isso ument possibilid de de se obter result dos f lso positivos. Algum s d s metodologi s não específic s p r ntígenos p r detecção de imun ocomplexos circul ntes são present dos n t bel const nte d págin seguinte. 53

   

         

     

   

   

 

 

           

 

 

 

                 

   

 

 

 

   

 

 

 

   

     

 

 

 

 

 

 

   

                       

         

         

 

 

 

 

 

 

   

                                       

             

     

 

     

 

   

 

 

       

 

           

   

   

   

 

 

   

   

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

     

 

 

 

 

     

 

       

     

   

   

   

   

 

 

 

 

                                       

 

 

 

         

       

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Métodos não específicos p r ntígenos p r detecção de imunocomplexos circul ntes MÉTODOS BASEADOS NAS PROPRIEDADES FÍSICAS Técnic s dependentes do t m nho e densid de Ultr centrifug ção n lític Centrifug ção com gr diente de s c rose Filtr ção em gel Ultr filtr ção Eletroforese e eletrofoc liz ção Técnic s depend entes de precipit ção Precipit ção com PEG Crioprecipit ção Métodos b se dos n s c r cterístic s biológic s Técnic s dependentes do complemento Teste de consumo do microcomplemento Técnic s C1q dependentes Precipit ção em gel de C1q Teste d o desvio de C1q Ens ios C1q-PEG (C1qBA) Ens ios C1qSP Técnic s C3 dependentes En s ios de célul s RAJI Conglutinin Ens ios de f se sólid nti C3 Técnic s Fc de pendentes Técnic s ntiglobulin s Testes RF Lig ção proteín A do est filococo Técnic s celul res Teste de greg ção pl quetári Teste de inibição d citotoxi cid de celul r dependente de nticorpo Liber ção de enzim s de m stócitos e eosi nófilos Ens ios de inibição de m cróf gos Testes de inibição de roset s Color çã o intr citopl smátic de leucócitos polimorfonucle res

 

 

                     

 

 

     

   

 

   

 

 

 

 

   

   

           

   

 

 

 

 

         

                 

 

 

 

     

 

 

   

 

   

   

 

 

     

 

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Tudo indic que conglutinin desempenh um p pel n resistênci celer ndo o processo de f gocitose.

às infecções

 

 

MÉTODO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO CONGLUTINANTE (Segundo Coombs e Cols.) 1 - Prep r r diluições sucessiv s do soro in tiv do, em que se desej pesquis r o ntico rpo. 2 - Adicion r o ntígeno (estreptococos, s lmonel , riquétsi , ou o que se desej r) previ mente diluído, us ndo um dose fix . Norm lmente us r diluições t endo turv ção correspondente o 2o tubo de Esc l de M c F rl nd. Se o soro co ntiver o nticorpo do ntígeno correspondente o ntígeno, h verá form ção do co mplexo Ag-Ac. 3 - Adicion r o complemento de c v lo. Se s p rtícul s ntigênic s não forem sensíveis à lise, pode-se us r complemento de cob i . Form -se, nest e c so o Complexo Ag-C. 4 - Adicion r conglutinin (K), ou sej soro bovino qu e contém. Se for us do o soro de boi, este deve ser in tiv do. A K é resistent e à in tiv ção. 5 - Incub r 37°C por 30 minutos. 6 - Ler o teste e verific r s e houve ou não conglutin ção. Se o soro contiver nticorpos v mos ter conglutin ção té determin d diluição. Est corresponde o título d re ção. Há um compon ente sérico denomin do de mobilid de bet , import nte p r re ção que é ch m d o de f tor tiv dor de conglutinogênio (KAF). AcAgC1,3b,2 ,4b + KAF + K + C ++ C onglutin ção.

 

                 

CONGLUTINAÇÃO E IMUNOCONGLUTINAÇÃO A conglutin ção é outr re ção n qu l, lém d form ção complexo Ag-Ac é indispensável h ver fix ção do complemento. Fund mento: Hemáci s sensibiliz d s por hemolisin , glutin m-se fortemente em presen ç de soro bovino, um vez que, o mesmo contém um substânci protéic design d conglutinin (K), contid n fr ção euglobulin . Est fr ção pode ser isol d e purific d por dsorção o Zimoz m e C ++ e posterior eluição pelo sequestro de C ++ por EDTA (Ácido etileno di minotetr cético). Seu peso molecul r é de 75. 000 e o coeficiente de sediment ção de 7,8S. É termoestável 56°C, resistente à ção do merc ptoet nol, d neur minid se e d p p ín , m s perde su tivid de pel ção d tripsin e d pepsin . Os complexos Ag-Ac, pós à fix ção do comple mento, são glutin d s por ção d conglutinin sobre o complemento fix do. A re ção de conglutin ção se f z n presenç de soro de c v lo que fornece C1, C4, C 2 e C3, porém se este for deficiente de outros componentes, não se verific hemó lise.

 

 

 

   

   

       

     

 

 

 

 

     

 

               

 

             

   

                 

   

 

 

     

 

 

 

             

       

       

   

   

   

 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

                     

 

 

         

           

     

 

 

     

       

       

 

 

 

 

 

   

 

   

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

   

   

 

 

   

 

   

     

 

TITULAÇÃO DAS IMUNOCONGLUTININAS 1 - Prep r r um suspensão 2% de hemáci s de c rneiro sensibiliz d s com hemolisin (do mesmo modo que se f z n fix ção do c omplemento). 2 - Tom r um tubo 13 x 100 mm e coloc r dentro do mesmo 2 ml de hem áci s sensibiliz d s, 0,2 ml de soro de c v lo sem in tiv r e 0,2 ml de soro de c v lo in tiv do. O uso do soro fresco de c v lo é p r se ter um excesso de C4. Temos ssim seguinte re ção: H + A → HA HA + C → HAC HAC1,4,2,3 Há, no c so, excesso de C4. 3 - Em um micropl c , f zer diluições sucessiv s do soro in tiv do, que se quer determin r o título de conglutinin . P r isto, sep r r um fileir d pl c , dicion r 20 µl de solução s lin c d um de 10 ori fícios, previ mente, m rc dos. Adicion r 20 µl do soro no primeiro orifício e di luir sucessiv mente 1:2, 1:4, ... té 1:256, desprez ndo os 20 µl últimos. Sep r r dois orifícios p r controle do sistem do item 2. 4 - Adicion r 20 µl d m istur (item 2), n s diluições do soro té 1:256 e nos dois orifícios controles. Agit r levemente, esper r cerc de 10 minutos, centrifug r 500 rpm, git r le vemente e ler observ ndo té que diluição ocorrerá glutin ção. A hem glutin ção é c us d pelos nticorpos p r C3 e C4, isto é, IK. Re ção neg tiv : usênci de glutin ção Re ção positiv : presenç de glutin ção. 57

 

IMUNOCONGLUTININAS As ch m d s conglutinin s, são predomin ntemente, d cl sse d s IgM e são encontr d s em muit s espécies de nim is. Estes nticorpos re gem com C3 e C4, fix dos. Form m-se por loimuniz ção e utoimuniz ção, dur nte os p rocessos reumáticos, infecções crônic s e doenç s uto-imunes. As imunoconglutin in s não necessit m de C ++ p r que re ção ocorr . Podem ser do tipo IgM ou I gG, nti C3 e C4, m s quel s produzid s pelos processos utoimunes continu m so b form IgM, mesmo pós um longo período de estimul ção. Pode-se estimul r su produção em nim is inocul ndo-se b ctéri s combin d s com nticorpos heterólog os, os qu is re gem com complemento do nim l inocul do que expõem ou modific m determin ntes do C3 e C4. A titul ção d s imunoconglutinin s (IK) se f z por con glutin ção. As imunoconglutinin s possuem propried des opsoniz ntes, isto é, est imul dor s de f gocitose.

               

Observ ção: Este teste tem pouc plic bilid de n prátic , visto que há um i ção enorme de re ções p r pesquis de nticorpos m is eficientes.

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HIPERSENSIBILIDADE DE CONTATO A hipersensibilid de de cont to é c r cteriz d po r eczem s n região de cont to com o produto lergênico. Substânci s irrit ntes p r pele gem de modo diferente do processo desenc de do n re ção do tipo IV embor por vezes re ção clínic sej muito p recid . As porções dos lergenos que desenc dei m re ção do tipo IV, ch m d s de H ptenos, são substânci s tão pequen s ( present ndo o peso molecul r inferior 1kD ), que por si só não são c p zes de desenc de r respost imune, ou sej não são substânci s imunogênic s. Est s substânci s tem c p cid de de penetr r n pele e se conjug r, ger lm ente de form cov lente, com s proteín s orgânic s. Existem dois tipos de célul s princip is que p rticip m no desenc de r d respost do tipo IV, são el s s célul s de L ngerh n e os Quer tinócitos. Como hipersensibilid de de cont to é 58

                                                                                                                                                   

HIPERSENSIBILIDADE TIPO IV De cordo com cl ssific ção de Gell & Coombs, est re ção é quel que lev m is de 12 hor s p r que se desenvolv m os sintom s cl ínicos, e envolvem re ções medi d s por célul s em detrimento re ção medi d p or nticorpos. Cl ro que est definição é muito br ngente, pois há c sos, como n re ção t rdi de um respost feit por IgE, que envolve lém dos nticorpos respost control d por célul s TH. Diferente d s outr s re ções de hipersensi bilid de, re ção do tipo IV não pode ser tr nsferid de um nim l p r o outro vi soro, m s pode ser tr nsferid pel s célul s T. El está ssoci d com pr oteção conferid pel s célul s T m s nem sempre corre em p r lelo com el . Nem s empre há correl ção entre Re ção de Hipersensibilid de do Tipo IV e imunid de protetor . As célul s T responsáveis pel re ção do tipo IV for m especific ment e sensibiliz d s por um encontro prévio e gem recrut ndo outr s célul s p r o sítio d re ção. São cl ssific dos três tipos de re ção de hipersensibilid de do Tipo IV, são el s, Hipersensibilid de de cont to, Re ção tuberculínic e Re ção gr nulom tos . T nto hipersensibilid de de cont to qu nto Re ção tube rculínic , ocorrem num período de 48 72 hor s o p sso que, Re ção gr nulom tos ocorre num período de 21 28 di s em médi . N re ção gr nulom tos , os gr nulom s form dos se devem greg ção e prolifer ção dos m cróf gos, e est p ode dur r sem n s. Devemos lembr r que re ção do Tipo IV pode ocorrer junto co m s outr s re ções de hipersensibilid de, ssim como pode ser oriund d compli c ção de um del s.

 

     

 

     

     

 

 

 

   

       

 

 

 

 

 

 

 

 

     

                                                                                                       

 

   

           

O título conglutin nte é d do pel recíproc d orre hem glutin ção.

m ior diluição do soro em que oc

           

 

 

   

   

   

     

     

 

 

 

 

     

   

 

 

 

   

 

   

 

       

 

 

 

                 

       

   

   

 

   

 

 

 

   

   

   

 

 

   

     

     

       

 

   

inici lmente um re ção epidérmic , s célul s de L ngerh n são s princip is cé lul s present dor s de ntígeno envolvid s present ção. As célul s de L nger h n present m os receptores CD1, o MHC de cl sse II e os receptores de Fc em su membr n . Em estudos re liz dos in vitro foi demonstr do que s célul s de L n gerh n, gem melhor como APC do que os monócitos. Os quer tinócitos express m s molécul s de MHC de cl sse II e ICAM-1 em su membr n , el s tom m p rte d int egrid de estrutur l d epiderme. Est s célul s podem liber r citocin s como IL -1, IL-3, IL-6, IL-8, GM-CSF, M-CSF, TNFα, TGFα e TGFβ. A IL-3 li erada pode ati var as células de Lan erhan, co-estimular a resposta proliferativa, recrutar mas tócitos e induzir a secreção de citocinas com ação imunosupressora como a IL-10 e TGF-β, que diminuem a resposta imune e induzem a aner ia clonal em células TH1 . Os queratinócitos podem ser ativados por uma série de estímulos, incluindo-se aler enos e su stâncias irritantes. Os queratinócitos ativados produzem citocina s estimulatórias como TNFα e GM-CSF, os qu is tiv m s célul s de L ngerh n. O desenc de r d Hipersensibilid de de Cont to P r re ção de cont to ocorrer é necessári um primeir et p de sensibiliz ção, que lev de 10 14 di s, nest et p o h pteno bsorvido combin com um proteín e í é f gocit do pel célul de L ngerh n, qu l migr rá d epiderme té região p r cortic l dos lifonod os region is. Nos linfonodos el s present m o h pteno em ssoci ção com o MHC d e cl sse II os linfócitos CD4+, d ndo ssim origem um popul ção de célul s T CD4+ de memóri . Em um segund f se, o se entr r em cont to com o lergeno de novo, este c us um pequen diminuição do número de célul s de L ngerh n d ep iderme, s qu is irão se desloc r e present r o ntígeno n pele e linfonodos à s célul s T CD4+ de memóri . As célul s T CD4+ então p ss m liber r γ-IFN o qu al in uz a expressão e ICAM-1 e moléculas e MHC e classe II na membrana e qu eratinócitos e células en oteliais os capilares érmicos. Ocorre também a ativa ção os queratinócitos que liberam citocinas pró-inflamatórias como a IL-1, IL-6 e GM-CSF. Células T CD4+ sem especifici a e anti ênica a acabam sen o atraí as pela ação as citocinas e po em se li ar aos queratinócitos via ICAM-1 e MHC e classe II. A e ranulação e a liberação e citocinas por mastócitos ocorre lo o após contato com o aler eno. O TNF-α e IL-1 liber dos pel s célul s, princip l mente pelos m cróf gos, são potentes indutores d molécul endoteli l de desão. As citocin s liber d s produzem um sin l quimiotático p r m cróf gos cheg rem té junção dermoepiteli l e epiderme. Os m cróf gos cheg m derme e epiderme em torno de 48 hor s pós cont to sendo que o pico de célul s presentes no loc l de infl m ção se dá entre 48 e 72 hor s. A m iori dos linfócitos presentes nest re ção são CD4+ com poucos CD8+. Após o pico máximo d re ção el começ ser suprimid pel ção de eicos noídes como Prost gl ndin E (PGE), produzid po r m cróf gos e quer tinócitos tiv dos. A PGE inibe produção de IL-1 e IL-2; o mesmo tempo, o que p rece, célul T se lig os quer tinócitos e ssim o h pteno lig do o MHC de cl sse II sofre 59

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degr d ção por enzim s celul res. A supressão é medi d por vários f tores, entr e estes, dest c m-se liber ção de linfocin s inibitóri s evit ndo o esp lh men to d re ção; liber ção de TGFβ pelos mastócitos, queratinócitos ativados e li nfócitos, ini indo e loqueando os efeitos proliferativos das IL1 e IL-2; a próp ria IL-1 li erada pelos queratinócitos, após contato deste com o aler eno, atua ini indo o meta olismo oxidativo dos macrófa os e diminuindo a produção dos medi adores pró-inflamatórios; a IL-10 suprimindo a expressão das moléculas de classe II, a produção de citocinas e a proliferação dos linfócitos TH1 específicos. Em ratos foi o servado ainda que a irradiação por raios ultra violeta, ini em a de rmatite de contato, induzindo um ini idor específico da IL-1. Foi o servado que as reações a aler enos e su stâncias irritantes são parecidas, já que as duas su stâncias podem lesar as células de Lan erhan e, ao mesmo tempo induzir a li era ção de citocinas com isso, outras células de Lan erhan podem ser estimuladas a s e tornarem potentes APC as quais mi rarão até os lifonodos e darão início a resp osta imune. A sinalização por TNFα, γ-IFN e GM-CSF ocorre em pelo menos meia hor a após contato com a substância aler enica ou irritante, sen o que se observa um aumento a pro ução e RNAm co ifican o GM-CSF nas primeiras uas horas pós con tato. Al uns pro utos químicos po em ain a in uzir a expressão e ELAM-1 e VCAM1 em torno e uas horas após contato e ain a in uzir a expressão e ICAM-1 cerc a e 8 horas epois. ICAM-1 é o li ante e LFA-1 que po e ser encontra o em célu las linfói es e mielói es, e também é importante para manter estas células na pe le. As células T e memória ecorrentes o estímulo promovi o pelas APC nesta re ação ficam nos capilares érmicos, e por isso o esenca ear a reação, quan o o se un o contato com o aler eno, é mais eficiente na pro ução e sintomas clínic os. REAÇÃO TUBERCULÍNICA Esta forma e hipersensibili a e é observa a quan o se inocula por via sub-cutânea um antí eno solúvel, como o bacilo a tuberculose (p roteínas a bactéria morta). Na re ião em que foi injeta o o antí eno, se observ a a formação e um e ema em torno e 48 horas pós inoculação. Reações semelhante s po em ser observa as quan o se a minstra antí enos solúveis e micror anismos como Mycobacterium leprae e Leishmania tropica em pessoas sensibiliza as. Por es te motivo o teste e sensibili a e cutânea é utiliza o para saber se uma pessoa foi exposta previamente a um etermina o antí eno. Esta forma e hipersensibili a e também po e ser in uzi a por antí enos que não sejam oriun os e micror anis mos como o berílio e o zircônio. A reação tuberculínica envolve vários tipos cel ulares, mas os monócitos são os principais participantes esta. Lo o após a inoc ulação o antí eno, ocorre a ativação e células T específicas, que passam a sec retar citocinas como o TNFα e TNFβ que atuam nas células endoteliais e dos vasos , as induzindo a expressar moléculas de adesão como a E-selectina, ICAM-1 e VCAM -1. Estas moléculas se li am a receptores presentes nos leucócitos, assim os rec rutando para o sítio da reação. Nas primeiras 4 horas pós inoculação se o serva o influxo de neutrófilos, que vão sendo aos poucos 60

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su stituídos por macrófa os e células T nas 10 horas se uintes. Este infiltrado celular vai aumentando de forma que aca a rompendo o feixe de colá eno da derme, esta reação atin e o seu pico máximo em 48 horas pós inoculação. Encontramos ta nto células T CD4+ como CD8+, sendo que existe quase o do ro de células CD4+, ta m ém são encontradas células CD1+ como as células de Lan erhan e células tipo La n erhan neste infiltrado. Os macrófa os constituem aproximadamente 80% das célul as presentes no infiltrado, sendo que os macrófa os e linfócitos presentes expre ssam o MHC de classe II o que contri ui para aumentar a eficiência de macrófa os e de células apresentadoras de antí enos. Os queratinócitos presentes apresenta m as moléculas HLA-DR no período compreendido entre 48 e 96 horas após o apareci mento do infiltrado linfocitário. Provavelmente os macrófa os são as principais células apresentadoras de antí eno nesse tipo de reação, muito em ora células CD 1+ tam ém estejam presentes. Tam ém a forma como as células de Lan erham e outra s circulam entre a derme e os linfonodos é parecida com a que ocorre na hipersen si ilidade de contato. A reação tu erculínica se resolve sozinha em cerca de 5 a 7 dias, no entanto se o antí eno persistir no local, pode haver o desenvolvimen to de uma reação ranulomatosa. A infiltração su epitelial com asófilos não é c aracterística deste tipo de reação no entanto, ela pode ser o servada em al umas reações de hipersensi ilidade e testes cutâneos em que são usadas proteínas het erólo as. HIPERSENSIBILIDADE GRANULOMATOSA Esta reação é resultante da persistência de mic ror anismos ou partículas as quais os macrófa os não conse uem destruir. Em dete rminadas situações ela tam ém pode ser oriunda de imunocomplexos persistentes co mo os que aparecem nas alveolites. Este processo resulta na formação de ranulom a de células epiteliais. Histolo icamente ele difere do que se o serva na reação tu erculínica, no entanto ele é o resultado da sensi ilização por micror anismo s como o Myco acterium tu erculosis e M. leprae. A reação ranulomatosa tam ém p ode ocorrer como resultado a um corpo estranho presente no or anismo, como o que ocorre nas pessoas que tra alham na indústria de amianto, desenvolvendo a forma ção de ranulomas nos pulmões devido a inalação do pó do amianto, e tam ém uma s érie de outras su stâncias que os macrófa os são incapazes de di erir. Nesse cas o temos o que se chama de ranuloma não imunoló ico, pois não encontramos a pres ença de linfócitos nele. As células mais importantes neste tipo de ranuloma são as células epitelióides e as células i antes. As células epitelióides são oriu ndas de macrófa os ativados num processo crônico em que há a li eração contínua de citocinas e TNF, que potencializam a formação do processo inflamatório. Quant o as células i antes, elas se ori inam da fusão de células epitelióides, al uma s vezes são classificadas como células de Lan erhan i antes, em ora não tenham características comuns com 61

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elas. Ao que parece as células i antes podem ser oriundas de um está io termina l de diferenciação de monócitos e/ou macrófa os. O ranuloma oriundo de uma ativ ação imune tem a participação de células epitelióides e macrófa os na re ião cen tral, sendo que, al umas vezes tem a participação de células i antes. Em doença s como a tu erculose a área central do ranuloma pode ser uma zona de necrose, c om a destruição completa das estruturas celulares. A re ião central de macrófa o s e células epitelióides é circundada por uma camada de linfócitos, onde ocorre a deposição de fi ras de colá eno levando a formação de uma considerável zona de fi rose, ocasionada pela proliferação de fi ro lastos e aumento da síntese de c olá eno. Como exemplo de reação ranulomatosa temos a reação de Mitsuda o servad a contra os antí enos do M. leprae. As Reações Celulares Em experimentos executa dos em ratos foi demonstrado que células T expressando o TCRαβ são as que desenc adeiam a resposta imune frente a infecção acteriana. As células T sensi ilizada s com o antí eno apropriado e por células apresentadoras de antí eno, entram num processo de transformação linfo lastóide, onde ocorre o aumento da síntese de D NA, antes de entrar em divisão. Após as células T serem estimuladas por células APC, elas li eram uma série de citocinas capazes de atrair e ativar macrófa os, dentre as citocinas, temos o γ-IFN, linfotoxina, IL-3 e GM-CSF. Numa infecção po r actérias, temos os macrófa os li erando IL-12 fazendo com que os linfócitos T aumentem a li eração das citocinas que já estão sendo li eradas. Essa IL-12 é c apaz de estimular a população de linfócitos TH1 e suprimir a de linfócitos TH2. As reações ranulomatosas podem ser ativadas ainda pela li eração de TNF oriundo dos macrófa os, que aca am sendo a fonte de auto ampliação da reação, com a tra nsformação dos macrófa os em células epitelióides, e nos casos em que o antí eno não pode ser destruído as células vão se fusionando, dando ori em as células i antes que envolvem o antí eno. As reações do tipo IV tam ém podem envolver os l infócitos T CD8+, os quais lesam as células mais pela sua ação citotóxica. Como exemplo temos a ação do pentadecatecol, que é uma su stância solúvel em lipídeos , e pode atravessar a mem rana celular e assim modificar as proteínas intracelul ares. Estas proteínas modificadas dão ori em a peptídeos modificados no citossol , os quais são translocados pelo retículo endoplasmático e che am a superfície c elular através do MHC de classe I. Estas moléculas são então reconhecidas pelas células T CD8+ as quais matam a célula modificada fazendo a exocitose de enzimas como a perforina. Tam ém as células CD8 li eram γ-IFN que ajuda na formação da hipersensi ilidade tardia.

Al umas situações em que o servamos a Reação do Tipo IV Existem várias doenças e m que o servamos isto, a maioria se deve a a entes infecciosos como mico actéria s, protozoários e fun os, em ora isso tam ém seja o servado em doenças como a 62

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Sarcoidose onde não há um a ente infeccioso esta elecido para tal. As doenças ma is comuns em que esta reação de apresenta são: Lepra, Tu erculose, Esquistossomo se, Sarcoidose, Doença de Crohn. Há uma situação que não é doença, mas incomoda astante as pessoas que é a picada de insetos, inicialmente a reação que ocorre pode ser do tipo I, por ser mediada por I E, mas a evolução da resposta imune le va a uma reação de hipersensi ilidade tardia com a formação de ranuloma como o o servado na reação tu erculínica. Uma característica comum nestas infecções é q ue o a ente infeccioso é persistente e promove o estímulo anti ênico crônico. A ativação dos macrófa os pelos linfócitos pode limitar a infecção só que, o estím ulo contínuo leva a destruição tecidual devido a li eração de produtos oriundos dos macrófa os como o oxi ênio reativo e intermediários das hidrolases. Em ora a reação de hipersensi ilidade seja induzida pelos linfócitos T ativados, nem sem pre a reação é controlada, de forma que a imunidade protetora e a reação de hipe rsensi ilidade tardia nem sempre acontecem ao mesmo tempo. Por este motivo é que al umas pessoas que tem hipersensi ilidade tardia não apresentam proteção ao me smo antí eno que as levou a desenvolver esta hipersensi ilidade. Um dos exemplos que podemos citar é a lepra. A lepra é dividida em 3 tipos, tu erculoíde, inter mediária e lepromatosa. Na lepra tu erculoíde a pele apresenta pequenas áreas hi popi mentadas que tem um intenso infiltrado de leucócitos e células epitelióides , mas sem a presença do acilo, já na lepra lepromatosa se o servam múltiplas le sões confluentes que apresentam numerosos acilos, macrófa os e al uns linfócito s. Já a lepra intermediária, como o próprio nome diz, apresenta características tanto da lepra tu erculóide quanto da lepromatosa. Na lepra tu erculóide a imuni dade protetora está normalmente associada com a imunidade mediada por células, s ó que esta vai declinando a medida que a doença caminha para o quadro lepromatos o, com a produção de anticorpos não protetores para o M. leprae. Na lepra interm ediária a reação se apresenta com o quadro típico de hipersensi ilidade do tipo IV, sendo que nela as lesões hipopi mentadas de pele contendo o acilo, se torna m inchadas e inflamadas, porque o or anismo é incapaz e montar a reação de hiper sensi ilidade tardia. Nestas lesões o serva-se o infiltrado de linfócitos secret ando γ-IFN. Esse processo ocorre nos nervos periféricos, onde as células de Schw ann contém o M. leprae; o que é a causa mais importante da destruição nervosa ne sta doença. Outro exemplo, é a tu erculose, nela o serva-se um alanço entre os efeitos dos macrófa os ativados controlando a infecção e/ou causando danos tecid uais nos ór ãos infectados. Nos pulmões a reação ranulomatosa leva a formação d e “ uracos” (necrose caseosa), que contri uem para o espalhamento da actéria. A s reações são frequentemente acompanhadas de fi rose extensa. O servase na re iã o central do ranuloma a presença de uma área de necrose, circundada por células epitelióides e células i antes com células mononucleares na re ião periférica.

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No caso da esquistossomose a reação ranulomatosa se processa contra o ovo dos e squistossomas, levando a formação do ranuloma ao redor do mesmo. Na Sarcoidose, a causa exata da doença é desconhecida, sa e-se que é uma doença crônica, com q uadro clínico al umas vezes parecido com o da lepra, onde macrófa os se acumulam em vários tecidos como pulmões, lifonodos, ossos, tecido nervoso, e pele, forma ndo o ranuloma, frequentemente acompanhado de fi rose. Essa doença acomete mais o tecido linfóide, promovendo o edema dos linfonodos. Até o momento não se enco ntrou um a ente infeccioso para tal doença, mas há a desconfiança de que al uma mico actéria possa estar envolvida com ela pois a patolo ia é semelhante. A doen ça de Crohn tam ém é uma doença em que não há a participação de um a ente infecc ioso, ela acomete o colo e o íleo, as vezes mais na porção terminal do íleo e po r isso tam ém chamada inicialmente de ileíte terminal. Hoje em dia já é sa ido q ue esta doença pode acometer qualquer porção do trato alimentar. Esta doença, no s Estados Unidos pelo menos, tem acometido mais a adolescentes e pessoas por vol ta dos 20 anos de idade, com maior incidência em pessoas do sexo feminino, mas i sto não impede que ela ocorra em qualquer idade. Nela temos a presença de os lin fócitos e macrófa os se acumulando em várias camadas do intestino, levando a for mação do ranuloma e fi rose. Esta reação parece começar com a infiltração de ne utrófilos na camada epitelial, reco rindo então o intestino com a re ados de lin fócitos, o que leva a infiltração destes nas criptas e a posterior formação da f ístula. Esta reação ranulomatosa leva a diminuição do diâmetro interno do intes tino e a formação de fístulas que che am até outros ór ãos. REAÇÕES IMUNOLÓGICAS A VÍRUS Os vírus são parasitos intracelulares o ri atórios, constituídos por RNA ou DNA, e fazem uso do maquinário celular para a monta em de novos vírus. Temos tam ém os prions que são apenas proteínas infectantes, er almente associadas com doenças neuroló icas nos seres humanos e em animais (como a Doença da Vaca Louca nos ovinos ou a Doença de Creutzfeld-Jako nos humanos) . Os vírus, dependendo do tipo, podem promover a doença de várias formas, como u ma infecção a uda que o próprio or anismo conse ue de elar, como no caso da rip e promovida por vírus influenza; como uma infecção latente e persistente, confor me o o servado nas infecções pelo vírus Herpes simples e citome alovírus ou como uma infecção persistente, em que o or anismo não conse ue montar uma resposta e ficaz no com ate ao a ente viral como é o servado nas infecções por vírus da Hep atite B e C. No caso dos prions, não há o está io a udo, estes a entes persistem como uma infecção lenta, que dura por anos sem induzir uma resposta imune. 64

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A resposta inicial que o or anismo monta contra os vírus faz parte das defesas i natas, como a li eração de interferon, ativação de células NK e macrófa os. O in terferon é li erado pelas células que estão infectadas por vírus, este interfero n pode ser o α ou β, o qual ativa mecanismos antivirais nas células vizinhas. Al ém disso, na resposta inflamatória a uda, como ha a li eração de γ-interferon, i nterlecina-1 e fator de necrose tumoral (TNF), estes a em induzindo a expressão de ICAM-1, que aca a por facilitar a interação das células T e as células aprese ntadoras de antí enos (Rueckert, R.R., 1996). Antes de falarmos mais so re a açã o do interferon é om lem rar que existem três tipos de interferon, o α-IFN que é liber do princip lmente pelos linfócitos, o β-IFN que é produzido mais pelos f i ro lastos e por fim o γ-IFN que é li erado mais por linfócitos e macrófa os. P ois em, os interferons ativam uma série de enes dos quais dois exercem ativida de antiviral direta, um deles promove a atividade de uma proteína quinase que te m a propriedade de ini ir a fosforilação e loquear a translação proteíca; e o o utro de produzir a 2’5’-oli oadenilato sintetase que ativa uma endonuclease late nte capaz de de radar o RNA viral. Existem outros mecanismos mais específicos co mo a ativação do ene Mx, que ini e a transcrição primária dos enes do vírus in fluenza, mas não tem ação so re outros vírus. O γ-IFN tam ém aumenta a eficiênci a da resposta imune adaptativa, estimulando o aumento na expressão das moléculas de MHC de classe I e II e promover a ativação de macrófa os e células NK. O Papel das Células NK As células NK se tornam ativas em aproximadamente 2 dias após o início da infecção viral, elas são mais eficientes nas infecções por víru s da família Herpesviridae, mais especificamente para os citome alovírus (CMV). Não se sa e que moléculas da célula infectada por um vírus que a NK reconhece, n o entanto há uma correlação inversa entre MHC de classe I e a ação da NK. Isto é curioso uma vez que várias famílias de vírus ini em a expressão do MHC de class e I, talvez como uma forma de escapar do reconhecimento efetuado pelas células T . O γ-IFN é capaz de ativar a função das células NK assim como de uia-la ao sít io de infecção. Numa fase mais avançada da resposta imune, as NK atuam exercendo sua atividade matadora pela citotoxicidade dependente de anticorpo. Participação das células T e B Aos poucos a resposta imune vai se adaptando e en volve além das células T citotóxicas, envolve tam ém células TH, células B e pla smócitos. Os plasmócitos produzem anticorpos que são os principais responsáveis por evitar a propa ação do vírus. Estes anticorpos são montados para as proteína s virais existentes nas células infectadas, tam ém temos anticorpos para as lic oproteínas virais atuando contra o envelope viral ou partes deste expressos nas células hospedeiras. Auxiliando o papel dos anticorpos, temos a participação da via clássica do complemento que atua tanto nas 65

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partículas virais livres como nas células que estão replicando vírus. No entanto para que o complemento ataque a mem rana de uma célula infectada, há a necessid ade de que hajam pelo menos 5x106 partículas na mem rana celular. Por outro lado as células NK conse uem atuar em células com apenas 103 moléculas de I G li ada s ao antí eno viral presente na mem rana celular, elas se li am a I G via o rece ptor FcγRIII (CD16), destruindo a célula hospedeira por um mecanismo dependente de perforina. As células T apresentam uma série de funções na infecção por vírus , na verdade a maior parte da resposta feita pelas células B produtoras de antic orpo é timo dependente, e por isso requer a participação de células CD4+ para qu e haja a troca de isotipo das imuno lo ulinas a serem produzidas e para a matura ção. As células T CD4+ tam ém atuam na indução de células CD8+ citotóxicas e no recrutamento e ativação de macrófa os ao sítio de infecção. Durante a replicação do vírus em uma célula, qualquer proteína viral pode ser processada e incorpora da ao MHC de classe I, isto aca a levando as células T a reconhecerem a célula i nfectada. Um exemplo disto ocorre na replicação do citome alovírus (CMV) em que a expressão de sua proteína imediata precoce, a pp63, aca a estimulando a respos ta mediada por células T, ao ser montada junto como o MHC de classe I. As célula s CD4+ são importantes na medida em que podem recrutar macrófa os do mesmo modo em que fazem na reação de hipersensi ilidade do Tipo IV e assim acelerar a destr uição das partículas virais. Citocinas como o γ-IFN li eradas pelas células T sã o capazes de ativar monócitos que por sua vez li eram TNF que tam ém possui ação antiviral. No sarampo ocorre a indução de células T CD4+, que são capazes de re conhecer e matar células infectadas apresentando o MHC de classe II, isto parece ocorrer devido a via de apresentação do antí eno, em que há a fa ocitose, de ra dação e apresentação a célula T pelas células apresentadoras de antí eno. A resp osta imune nem sempre é eficiente pois os vírus desenvolvem mecanismos de escapa r, a mais comum delas é a variação anti ênica como é o servado nos vírus Influen za A, que tem alta taxa de mutação. A mutação viral ocorre justamente nas porçõe s anti ênicas que seriam reconhecidas por anticorpos específicos, nos vírus infl uenza isto ocorre na hema lutinina e na neuraminidase que em ora sejam imuno êni cas, não servem para a produção de vacinas devido a mutação que ocorre. Em outro s casos como os anticorpos conse uem remover os vírus da circulação, isto pode f azer com que os vírus possam permanecer no interior das células como a se prote er da ação dos anticorpos, assim levando a infecção intracelular persistente. Co mo exemplo temos os herpesvírus e os citome alovírus, que apenas saem das célula s quando o sistema imune está deficiente. Só que os herpesvírus e citome alovíru s ainda apresentam licoproteínas que atuam como receptores para a porção Fc da I G, com isso o anticorpo se li a ao vírus como se li aria a uma célula fa ocitá ria, e aca a não tendo a propriedade de desencadear o complemento ou ainda, ativ ar a fa ocitose. 66

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Vírus como o Epstein-Barr e Adenovírus conse uem fazer com que a célula monte pe quenas moléculas de RNA que competem com a proteína quinase e deste modo ini em a ativação do γ-IFN. Além disso os Adenovírus e CMV induzem a codificação de pro teínas que são capazes de ini ir o transporte das moléculas de MHC de classe I a mem rana celular, deste modo os vírus escapam do reconhecimento feito pelas cél ulas T. Al uns vírus possuem enes que codificam receptores homólo os aos de cit ocinas, quando não codificam citocinas. Formas solúveis dos receptores de IL-1β, TNF e γ-IFN, são li eradas pelas células infectadas e com isso ini em a ativida de destas citocinas. Como exemplo temos o vírus Epstein-Barr que codifica uma pr oteína homólo a a IL-10 e que exerce a mesma função da IL-10 in vitro. Durante i nfecções crônicas ocorre a formação de imunocomplexos nos fluidos corporais ou n a superfície de células como é o caso das infecções pelo vírus da hepatite B ou CMV. Nestes casos os anticorpos são ineficazes na presença de randes quantidade s de vírus, com isso estes imunocomplexos são depositados no fí ado ou vasos san uíneos, onde ocorre a resposta inflamatória que leva a destruição tecidual. Em casos como o vírus da Den ue, os anticorpos aca am se li ando aos vírus formando um imunocomplexo que se li a via Fc ao macrófa o e desta forma o vírus conse ue entrar na célula que irá replica-lo mais facilmente. Além disso estes imunocomp lexos formados com o vírus da Den ue promovem a ativação do complemento que aca a lesando o tecido onde ele está, isto leva ao mecanismo que desencadeia a fe re hemorrá ica e a síndrome do choque o servada na den ue. Outro mecanismo que al uns vírus apresentam para resistir as defesas or ânicas, é que eles possuem a ca pacidade de infectar células do sistema imune como linfócitos ou macrófa os, com o ocorre na SIDA. Enquanto a célula está num está io não ativado o vírus permane ce em seu está io latente, no momento que a célula é ativada, os vírus entram em replicação. Temos vários exemplos disto, como os vírus Epstein Barr tem tropism o pelos linfócitos B; HTLV, HIV, vírus do Sarampo, Vírus do Herpes Humano tipo V I infectam linfócitos T e HIV e CMV infectando macrófa os. No caso do HIV, a doe nça se caracteriza por um lon o período de latência do vírus, onde não ocorre qu alquer resposta imunoló ica. O HIV entra no linfócito T CD4+ se li ando via p12 0 (uma licoproteína do envelope do HIV) ao CD4 do linfócito. O HIV tam ém pode entrar em outras células ao se li ar via p120 ou por estar li ado a anticorpos em células como macrófa os, e células apresentadoras de antí eno. Durante o perí odo de latência do HIV, parece existir um provírus, inte rado ao DNA do hospedei ro sem que ocorra qualquer transcrição do mesmo. Ao que parece o TNF e a IL-6 li erada no estímulo da resposta imune pode servir como sinal para o início da tra nscrição viral, podendo assim ocorrer a contaminação de outras células e consequ ente li eração de mais citocinas. A eliminação do 67

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HIV não ocorre por uma série de fatores, mas os mais importantes deles se deve a alta mutação que o vírus sofre e a pro ressiva imunodeficiência que ocorre devi do a destruição das células T CD4+. Al uns vírus podem ainda induzir a doenças a utoimunes, podendo ser devido a lesão induzida por estes ou por simular determin adas moléculas parecidas com as próprias. A lesão induzida por vírus se deve a p rópria resposta inflamatória que ocorre, levando a lesão tecidual constante, e e xpondo proteínas oriundas do interior das células, o que leva a produção de anti corpos para estas. Quanto aos vírus que expressam proteínas semelhantes a proteí nas próprias, quando estas são processadas e apresentadas as células T, ocorre a que ra da tolerância imunoló ica com a consequente produção de anticorpos às pr oteínas próprias. IMUNIDADE A BACTÉRIAS A imunidade a actérias está relacionada a estrutura do mi cror anismo invasor e ao seu mecanismo de pato enicidade. Baseado nisso há difer enças entre a resposta imune que ocorre entre actérias Gram positivas, Gram ne ativas, mico actérias e espiroquetas. No caso de actérias Gram ne ativas estas são mais suscetíveis a ação do sistema complemento e a ação de células citotóxic as, já nos demais tipos de actéria há a necessidade de que sejam fa ocitadas pa ra que sejam mortas. Quando a actéria apresenta fím rias, fla elos ou estão rec o ertas pela cápsula, estas estruturas podem impedir ou dificultar a ação das cé lulas fa ocitárias e do complemento, mas podem ser atin idas pelos anticorpos. A s actérias podem ainda estimular o sistema imune via toxinas, sem invadir o or anismo, neste caso a ação é feita pelas toxinas acterianas ou apenas invadindo o or anismo. Em eral, ocorre a invasão da actéria ao or anismo com a li eração de endo e exotoxinas acterianas. Conforme já discutido anteriormente, as prime iras arreiras a entrada de actérias no or anismo, são compostas pelas defesas inespecíficas como a pela inte ra, o ácido estomacal, os ácidos raxos presentes na pele, pH do trato urinário, a flora acteriana normal, etc. A se unda linha de defesa compreende o reconhecimento de al uns componentes acterianos comuns p elo sistema de defesa inato. Este tipo de reconhecimento é de lar o espectro, e ocorrem antes que células T específicas e anticorpos específicos sejam montados, o servamos isso ocorrer com vários tipos de cocos. Estes mecanismos envolvem o rcconhecimento de moléculas comuns a todas as actérias por células como as NK, ranulócitos e monócitos, tam ém temos a participação da proteína C reativa, que ao se li ar a superfície de al umas actérias é capaz de desencadear o sistema complemento. A ativação do sistema complemento leva a produção dos fatores C3a e C5a que aca am por ativar a de ranulação de mastócitos e asófilos, assim como chamar neutrófilos para o sítio de infecção. Com a histamina e leucotrieno li er ados pelos mastócitos temos o aumento da permea ilidade vascular, tam ém com a s ecreção de IL-8, pelos mastócitos atuando junto com os fatores quimiotáticos do complemento, temos mais células che ando ao local. 68

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O complemento conse ue ser eficaz na destruição de actérias que apresentam uma i-camada lipídica, como é o caso das actérias Gram ne ativas, pois esta é sens ível ao MAC (complexo de ataque a mem rana). A ativação do MAC leva a de ranulaç ão de mastócitos e a contração da musculatura lisa, assim como a atração e ativa ção de neutrófilos. As células NK quando estimuladas por IL-12 ou TNF, passam a li erar γ-IFN, que aca a ativando mais macrófa os. Quando as arreiras inespecíf icas são vencidas pela actéria, entra em ação a resposta mediada por anticorpos . Os anticorpos são muito importantes quando se trata da neutralização de toxina s acterianas, pois a mesma é executada quando o anticorpo se li a a porção da t oxina que normalmente se li aria na célula. Da mesma forma os anticorpos podem s e li ar a toxinas ou enzimas presentes na matriz extracelular da actéria, imped indo assim o espalhamento da actéria e as vezes interferindo com a motilidade acteriana ao se li ar ao fla elo. Anticorpos da classe I A podem ter papel impor tante em evitar a entrada de actérias nas mucosas, pois ao se li ar a actéria, impede que esta consi a se aderir as células epiteliais. Por exemplo, anticorpo s para a proteína M dos estreptococos do rupo A são específicos para os estrept ococos de ar anta. Al uns anticorpos tam ém são capazes de loquear a captação de ferro e outros nutrientes ao se li ar a determinados sítios da mem rana acte riana. No entanto a função mais importante dos anticorpos, é a de ativar a via c lássica do complemento pois quando a actéria não é destruída por este, ela é ma is facilmente fa ocitada por estar opsonizada por C3 . No entanto al umas actér ias podem escapar do sistema complemento por serem fracos ativadores ou porque a estrutura acteriana que é atacada pelo complemento está lon e da actéria, com o é o caso das cadeias lon as do antí eno O presentes no lipopolisacarídeo (LPS) . Outras actérias já conse uem se livrar do complemento porque possuem mecanism os de faze-lo como no caso em que C3 ao se depositar na capsula de actérias ri cas em ácido siálico, este é inativado pelo fator H e I presentes no plasma, por serem atraídos pela cápsula. Como exemplo temos as actérias como Neisseria men in itidis, E. coli e os estreptococos do rupo B. No caso dos estreptococos do rupo A, a proteína M é um aceptor para o fator H, deste modo o complexo C3 B é f acilmente dissociado, além disso ela possui um ene que codifica uma protease pa ra C5a. Células fa ocitárias tam ém atuam capturando actérias, aliás, a maioria das actérias Gram ne ativas podem ser mortas pelo contato com as células NK ou T citotóxicas. Provavelmente isto ocorre por um mecanismo que lisa a i camada lipídica que compõe a mem rana. A li ação das células fa ocitárias as actérias pode ocorrer de várias maneiras: • • • Li ação a lectinas presentes na superfíci e acteriana Li ação da actéria a lectinas presentes nos fa ócitos Li ação ao c omplemento depositado na mem rana da actéria 69

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• Li ação aos anticorpos li ados ao micror anismo via Fc. Assim que o micror anism o é fa ocitado ele é exposto a uma série de mecanismos que poderão destrui-lo, um deles é á produção de intermediários do oxi ênio reativo, onde uma enzima presente na mem rana da célula fa ocitária é capaz de reduzir o oxi ênio (O2) no anion superóxido (~O2-), que tem efeito tóxico so re a actéri a. Tam ém temos a produção de produtos intermediários nitro enados, que resultam na produção do óxido nítrico que é tóxico para actérias e células tumorais. Pa ra a produção destes intermediários nitro enados, os macrófa os precisam ser ati vados pelo γ-IFN e pelo TNF. Existem ainda proteínas catiônicas com propriedades parecidas com a dos anti ióticos como os peptídeos catiônicos da cisteína e ar inina presentes nos rânulos de neutrófilos. Estas proteínas são capazes de form ar canais ions permeáveis na camada i-lipídica das actérias, sendo mais eficie ntes no pH 7,0. Há tam ém proteínas catiônicas que atuam em pH diferente como a Catepsina G e a Azurocidina, que tem eficácia contra as actérias Gram ne ativas . Não podemos esquecer que os fa olisossomos tam ém apresentam um pH alcalino as sim que o micror anismo é fa ocitado, sendo que esse pH depois de al um tempo se torna ácido. Al uns micror anismos morrem apenas devido a aixa do pH outros ai nda precisam sofrer a ação de enzimas lisosomais que atuam no pH aixo. Al umas actérias Gram ne ativas morrem pela ação da lisozima que atua na camada de pept ideo licana. Su stâncias como lactoferrina (produzida por neutrófilos) tam ém te m sua participação uma vez que estas se li am ao ferro e o tornam indisponível p ara as actérias. Al uns produtos micro ianos podem estimular os monócitos e mac rófa os sem a participação dos linfócitos, mas tam ém podem ser ativados por cit ocinas li eradas pelas células NK. Das linfocinas li eradas por células T a mais importante na ativação dos fa ócitos talvez seja o γ-IFN. O γ-IFN tam ém tem o papel de potencializar os mecanismos oxi ênio dependente e oxi ênio independente das células fa ocitárias. As linfocinas possuem dois efeitos principais, um de ativar e outro de atrair fa ócitos isso pode ocorrer de forma diferente dependen do da actéria, por exemplo, no caso da infecção por L. monocyto enes, é a ativa ção celular que ocorre primeiro para que a célula fa ocitária consi a destruir a actéria via ativação dos produtos do oxi ênio reativo, já nas infecções por M. tu erculosis, é mais importante a mo ilização de células ao redor da actéria j á que esta é resistente a fa ocitose e por isso é mais importante para o or anis mo fazer sua imo ilização. Nem sempre as defesas celulares são eficientes, tanto assim que al uns micror anismos conse uem escapar do fa ossomo indo para o cito plasma do fa ócito. Outras actérias como o M. leprae conse uem fazer que as cél ulas não fa ocitárias, e portanto sem atividade anti actericida, as removam da c irculação antes que elas sejam encontradas por células fa ocitárias profissionai s ou sofram a ação de outros mecanismos capazes de destruí-las. Para que as act érias então sejam alcançadas elas tem de ser expulsas destas células, e quem con se ue fazer isso são as células T 70

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citotóxicas, elas matam a célula contendo a actéria ao reconhecer qualquer alte ração no receptores de mem rana expressos (principalmente o MHC). Um rande núme ro de células T apresentando os receptores γδ se proliferam nas infecções bacter ianas, não se sabe ain a qual o papel exato elas nas infecções sabe-se apenas q ue elas tem ação citotóxica nas células infecta as. Fibroblastos também po em pa rticipar no combate aos micror anismos provavelmente pro uzin o eriva os nitro ena os. No entanto quan o a resposta imune é exacerba a, po em ocorrer reações i n esejáveis como é o caso o choque provoca o por exotoxinas, que acontece evi o a pro ução maciça e citocinas em resposta a liberação e pro utos bacterianos libera os urante episó ios septicêmicos. A exotoxina (LPS) e bactérias Gram-n e ativas eralmente está implica a neste qua ro e choque, mas também po e ocorr er com bactérias Gram-positivas. Essa sín rome o choque tóxico po e levar o in iví uo infecta o a ter febre, colapso circulatório, coa ulação intravascular e n ecrose hemorrá ica, que leva a falha e múltiplos ór ãos, como ocorre nas infecç ões causa as por Rickettsia rickettsii, causa ora a Febre as Montanhas Rochosa s. Existe um fenômeno que acontece quan o a bactéria é capaz e causar necrose h emorrá ica evi o a reação sistêmica que ocorre envolven o o sistema circulatóri o, promoven o coa ulação intravascular ifusa e trombose. A en otoxina (LPS) é o componente ativo que ispara este mecanismo, promoven o mu anças en oteliais, eposição e fibrina, acúmulo e e ranulação e neutrófilos e plaquetas, sen o qu e os me ia ores esta reação são o TNFα, γ-IFN, IL-12 e IL-1. Este fenômeno é ch ama o e Reação e Shwartzman, e é observa o na menin ite menin ocócica on e num primeiro episó io e septicemia temos o espalhamento os sítios inflamatórios q ue são pequenos e subclinícos mas que permanecem sensíveis a ação as citocinas. Num se un o momento em que ocorre um novo episó io e septicemia ocorre o esen ca eamento e uma resposta inflamatória mais forte com ran e pro ução e citoci nas que levam ao esenvolvimento e necrose nestes sítios. Além o fenômeno e S hwartzman, temos em al uns casos como na infecção por micobactérias o esenvolvi mento a reação e hipersensibili a e tar ia, me ia a por células T, a qual acab a levan o a necrose teci ual na re ião central o processo celular, conforme já escrito na reação o tipo IV. As bactérias também po em apresentar o que se cha ma e Superantí enos, eles tem a capaci a e e se li ar iretamente as re iões v ariáveis as ca eias β dos receptores de antí eno de certos su sets de células T , e além disso fazer a li ação cruzada destes com o MHC de células apresentadora s de antí enos. Como resultado disso as células T são ativadas sem que haja o pr ocessamento e a apresentação do antí eno como peptídeos li ados ao MHC. Estes su perantí enos podem ser encontrados nos estafilococos, estreptococos, micoplasmas e outras actérias. Eles são os 71

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responsáveis pela li eração maciça de citocinas e linfocinas o que aca a estimul ando uma rande quantidade de su populações de células T. As actérias tam ém p odem apresentar o que se chama de Proteínas do Choque Térmico, elas tem papel na captura, empacotamento e transporte de al umas moléculas. As sequências de amin oácidos destas proteínas são extremamente conservadas e existe a especulação de que tais proteínas, por serem semelhantes as proteínas humanas possam estar envo lvidas com o desencadeamento da autoimunidade. Elas tam ém parecem ser o alvo da imunidade protetora de vários micror anismos, e ainda parece que as células T p odem reconhecer quais proteínas são do pató eno. IMUNIDADE A FUNGOS São classificados quatro tipos de infecção por fun os, em ora se sai a pouco so re os mecanismos precisos de como o sistema imune rea e neste tipo de infecção, parece que as reações são parecidas com aquelas que acontecem com as actérias. As principais cate orias das infecções por fun o são: • • Mic oses superficiais: são produzidas por fun os chamados de dermatófitos, e estão n ormalmente restritas aos componentes não celulares queratinizados da pele, ca el o e unhas. Micoses su cutâneas: é causada por fun os saprofíticos que podem caus ar a formação de nódulos crônicos e ulceras em tecidos su cutâneos se uido de tr auma, como exemplo temos a cromomicose, esporotricose e micetoma. • Micoses resp iratórias: fun os saprófitas do solo podem provocar infecções su clínicas ou a u das dos pulmões, ou ainda lesões ranulomatosas. Como exemplo temos a histoplasm ose e coccideomicose. • Candidiases: Produzido pela Candida al icans, que normal mente é um comensal e eralmente causa infecções superfíciais na pele e mucosas. Ao que parece as infecções fún icas são controladas por reações mediadas por cé lulas, isto é o servado nas infecções cutâneas em que elas são auto limitadas. A resistência é aseada na reação de hipersensi ilidade do tipo IV uma vez que al uns pacientes a apresentam frente a antí enos fún icos. As doenças crônicas par ecem ser o resultado da falta ou da falha na monta em da Reação do tipo IV. A im unidade por células T parece estar envolvida em outras infecções fún icas já que a resistência pode ser transferida via células T. Supõe-se que as células T li erem citocinas que sejam capazes de ativar macrófa os a destruir fun os. Nas mic oses respiratórias, o quadro da resposta imune é parecido com o o servado na lep ra, onde há um infiltrado de linfócitos, células epitelióides e i antes ao redo r do fun o, tentando imo iliza-lo. A candidiase costuma aparecer como resultado de um distúr io fisioló ico do or anismo, seja por stress, uso de dro as imunoss upressivas ou no caso de doenças que pertur am o sistema imune 72

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como a AIDS, deficiências imunes e doenças autoimunes. Isso prova que o sistema imune está em com ate permanente, evitando que o fun o se espalhe. Há evidências de que neutrófilos e polimorfonucleares estejam envolvidos na imunidade em al u ns processos respiratórios como na mucormicose. É possível que proteínas catiôni cas sejam importantes no processo de proteção contra o fun o, uma vez que pacien tes com fa ócitos apresentando a deficiência no meta olismo da redução do oxi ên io conse uem matar o levedos e hifas normalmente. No entanto o meta olismo do óx ido nítrico é importante na defesa contra o Cryptococcus, e este meta olismo par ece ser importante no com ate a vários fun os. RESPOSTA IMUNE A PARASITOS As infecções parasitárias podem estimular várias form as de resposta imune, ela pode ser mediada por anticorpos, mediada por células o u envolver am os os tipos de resposta, tudo depende do parasita envolvido. Paras itas como os protozoários, por serem maiores que vírus e actérias, apresentam u ma rande quantidade e variedade de antí enos. Al uns protozoários ainda podem a presentar alterações em seus antí enos de superfície dependendo do está io de de senvolvimento destes, deste modo, temos respostas imunes está io específicas. Co mo exemplo temos a Malária, onde o esporozoíta (forma infectante oriunda do mosq uito), que induz a monta em de anticorpos que não são capazes de rea ir com os m erozoítas (forma infectante das hemácias). Os protozoários ainda apresentam dife rentes formas de entrada nas células do hospedeiro, na Malária, os merozoítas te m a capacidade de se li ar a receptores presentes nas hemácias e usar uma or ane la própria, contendo enzimas, para fazer a entrada (as roptrias). Outro exemplo são as Leishmania spp. que ha itam os macrófa os, usando os receptores do comple mento para fazer com que as células as fa ocitem, além disso elas podem entrar n as células usando o receptor manose-fucose presente na superfície do macrófa o. A resistência que al umas pessoas apresentam as infecções por determinados paras itas parece ser determinada por um fator enético, pois, foi o servado que al um as pessoas carre ando al uns enes de MHC tinham menor capacidade de montar anti corpos para al uns peptídeos do esporozoíta da malária porque suas células T não eram sensi ilizadas. Tam ém foi o servado que a população ne róide do oeste da África é mais resistente a malária do que a população de ori em caucasiana pois a primeira possui al uns antí enos de HLA que a última não possui. Outra o serva ção feita na população africana, é que al umas pessoas não apresentam o antí eno Duffy nos seus eritrócitos, com isso elas são resistentes a infecção pelo Plasm odium vivax, já que este usa este antí eno como receptor para fazer sua entrada na célula. O desenvolvimento da imunidade depende da interação que ocorre entre várias células e dos vários tipos de células que atuam secretando os vários medi adores presentes na resposta imune. Podese dizer que os anticorpos são mais efic ientes contra os parasitas presentes no san ue e tecidos e que a resposta mediad a por células atua nos parasitas intracelulares. No entanto o tipo de resposta c apaz de 73

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conferir proteção varia conforme o parasita. Por exemplo, o anticorpo juntamente com a ação do complemento pode lesar al uns parasitas extracelulares, mas tem u ma ação mais eficaz quando tem a participação de células efetoras. Na Malária, p or exemplo, anticorpos conse uem evitar que as formas extracelulares consi am en trar nas células, e a resposta mediada por células conse ue evitar o desenvolvim ento da doença nos hepatócitos. Os mecanismos de ação do sistema imune O sistema complemento é de novo importante no processo de defesa inespecífica, mas tam ém há a participação de macrófa os, neutrófilos, eosinófilos e plaquetas na primei ra linha de defesa. Na infecção pelo S. mansoni por exemplo, este entra através da pele, e o primeiro loqueio é realizado por macrófa os, neutrófilos e eosinóf ilos. Outro exemplo está na malária e na infecção produzida por tripanossomídeos , os mesmos são removidos da circulação pelas células fa ocitárias do fí ado e aço. Os macrófa os ainda li eram citocinas como a IL-1, IL-12 e TNFα e f tores e stimul dores de colôni que ument m tivid de do sistem imunológico tiv ndo e promovendo prolifer ção de célul s. A liber ção de citocin s como IL-10, IL-12, prost gl ndin s e TGFβ podem ter ação anti-inflamatória e imunossupresora . Os macrófa os são importantes na defesa contra pequenos parasitos, no entanto elas li eram vários fatores citotóxicos capazes de destruir os parasitas sem os fa ocitar. Quando ativados por citocinas, os macrófa os podem matar pequenos par asitas como os presentes nos está ios eritrocitários da malária, assim como os randes, como os esquistossomas. Os macrófa os ainda podem atuar da mesma forma q ue as células matadoras através da citotoxicidade dependente de anticorpo, ao en contrar o parasito reco erto com I E ou I G aumentando ainda mais a eficiência c ontra parasitas como os esquistossomas. Eles tam ém li eram citocinas como TNFα e IL-1que inter ge com outr s célul s, como por exemplo com os hep tócitos, os f zendo se torn r resistentes os p r sitos d m lári . Os intermediários do oxig ênio re tivo são ger dos pelos m cróf gos e gr nulócitos pós f gocitose de p r sitos d m lári e outros como os T. cruzi, T. gondii , Leishm ni spp. como f orm de destruir estes p r sit s. T mbém qu ndo tiv dos por citocin s os m cróf gos liber m m is superóxido e peróxido de hidrogênio que os m cróf gos não tiv dos, ssim como seu mec nismo de produção de oxigênio re tivo é ument do. A sí ntese de óxido nítrico pelos m cróf gos é estimul d por citocin s como γIFN e T NFα, e é b st nte ument d qu ndo o estímulo é feito pelos dois. O óxido nítric o t mbém pode ser produzido por célul s epiteli is e contribui p r resistênci do hospedeiro que em doenç s como leishm niose, esquistossomose e m lári e ind , é um d s form s de controle. Tod s s funções dos m cróf gos efetores sã o mpli d s logo que infecção tem início sem que h j tu ção d s célul s T pois célul s como s NK podem liber r γIFN quan o estimula o pela IL-12 libera a pelo macrófa o. Mais ain a, os macrófa os secretam TNFα, em respost lguns 74

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produtos p r sitários como fosfolipídios contendo ntígenos dos p r sit s d m l ári , e isto tiv m is m cróf gos. Embor o TNFα t mbém pos ser secret do por outr s célul s, os m cróf gos ind são os princip is responsáveis por su produ ção. O TNFα ind tiv outr s célul s como eosinófilos e pl quet s m t r s l rv s do S. m nsoni, sendo que o γ-IFN ain a po e aumentar mais esta ativi a e. Os neutrófilos também tem a capaci a e e matar pequenos parasitas com mecanismo s que os macrófa os também apresentam como os mecanismos oxi ênio epen ente e o xi ênio in epen ente, incluin o a pro ução e óxi o nítrico. No entanto os neutr ófilos possuem uma ativi a e respiratória mais intensa o que os macrófa os e se us rânulos secretórios contém proteínas altamente citotóxicas. Os neutrófilos p o em ser ativa os por citocinas como γIFN, TNFα, e GM-CSF. A destruição extr cel ul r por neutrófilos é medi d por peróxido de hidrogênio enqu nto que os compon entes liber dos pelos grânulos estão envolvidos n destruição intr celul r. Os n eutrófilos t mbém possuem receptores p r Fc e complemento e por isso p rticip m d respost citotóxic medi d por nticorpos, como ocorre n infecção pelo S. m nsoni. Deste modo eles são m is de strutivos que os eosinófilos contr vári s espécies de nem tódeos . Os eosinófil os p rticip m m is n s infecções por vermes, p rece que eles estão envolvidos n defes contr os estágios tecidu is dos p r sit s que são muito gr ndes p r se r f gocit dos. A re ção re liz d pel IgE que forç degr nul ção dos m stócit os promove tr ção dos eosinófilos o sítio onde está o p r sit e ind mpli fic su tivid de ntip r sitári . No ent nto nem sempre os eosinófilos consegu em evit r que o p r sit promov infecção, m s podem limit r mesm . Os eosin ófilos podem m t r os helmintos por mec nismos oxigênio dependente ou oxigênio i ndependentes e mesmo não tendo mesm c p cid de de f zer f gocitose que os n eutrófilos, eles podem degr nul r em respost lter ção de su membr n . Além disso eles podem ser tiv dos por citocin s como o TNFα e GM-CSF. No ent nto m iori d s tivid des dos eosinófilos são control d s por mec nismos ntígeno es pecíficos como no reconhecimento que eles f zem d s IgE lig d s ntígenos, pro cedendo ssim degr nul ção sobre este. Os eosinófilos possuem ind um proteí n ch m d de Proteín Básic Princip l (MBP) que jud destruir os esquistoss om s. Aind em lguns processos p r sitários, como n infecção pelo esquistossom , pode h ver p rticip ção em conjunto de eosinófilos e m stócitos, onde os pr odutos liber dos pelos m stócitos promovem o umento d tivid de dos eosinófilo s. Os ntígenos é que c us ri m degr nul ção dos m stócitos, sem que houvesse p rticip ção d IgE, e os produtos liber dos promoveri m tr ção e o umento d tivid de dos eosinófilos no sítio de infecção. A p rticip ção d s pl quet s pode se d r contr vários tipos p r sitários, dentre estes se dest c ção co ntr form l rvári do T. gondii e T. cruzi. Assim como outr s célul s do sist em imune, su tivid de citotóxic é ument d pel ção d s citocin s como γIF N e TNFα. Assim como os m cróf gos e outr s célul s do sistem imune, s pl quet s present m o receptor Fcε m sua 75

 

         

                                                                     

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m mbrana, com isso las também pod m x rc r a atividad citotóxica d p nd nt d anticorpo quando s liga a IgE. Na r sposta parasitária as células T controlam o d s nvolvim nto da imunidad , isso pod s r obs rvado na malária ond a monoc itos o aum nto do baço é acompanhado do aum nto do núm ro d células T d p nd nt s. Outro x mplo inclui o acúmulo d macrófagos nos granulomas qu s formam m torno do ovo no fígado inf ctado p lo squistossoma, também s obs rva a os inofilia m inf cçõ s por h lmintos, o r crutam nto d osinófilos mastócito s para a mucosa int stinal nas inf staçõ s por v rm s. Os mastócitos os osinó filos são important s n st control das inf staçõ s por v rm s h lmintos, só qu l s costumam prolif rar m lhor quando sofr m ação d citocinas lib radas p las células T, como as IL-3, GM-CSF IL-5. No ntanto o aum nto da lib ração d IL-3 pod s r pr judicial ao hosp d iro, na m dida qu st pod causar a xac rbação da r sposta imun assim aum ntar a diss minação dos parasitas. O tipo d célula T r sponsáv l para o control da inf cção varia d acordo com o parasit a com o stágio da inf cção ainda, d p nd do tipo d citocina qu stá s nd o lib rada. Por x mplo, células T CD8+ CD4+, prot g m o hosp d iro contra dif r nt s fas s da inf cção por Plasmodium, as células CD4+ atuam no stágio m qu o parasita s ncontra no int rior das h mácias, nquanto as células CD8+ atua m no stágio m qu o parasita s ncontra no fígado. As células CD8+ atuam m d ois stágios dif r nt s, m um d l s la lib ra γIFN que inibe a multiplicação os parasitas nos hepatócitos, e estroem os hepatócitos infecta os. Os hepatócit os expressam o MHC e classe I, mas não o MHC e classe II, lo o as células CD4+ não tem a capaci a e e as reconhecer, o mesmo mo o, como os eritrócitos não e xpressam o MHC e classe I, as células CD8+ não tem a capaci a e e fazer o reco nhecimento estas. A resposta imune contra o T. cruzi e T. on ii, não epen e ap enas as células T CD4+ e CD8+, mas também e células NK e a pro ução e antico rpos. As células NK são estimula as pela IL-12 secreta a pelos macrófa os, e uma vez ativa os eles liberam γIFN. As infecções crônicas estão associa as a baixa pro ução e γIFN e isso mostra porque os pacientes com SIDA são facilmente infec ta os e sucumbem na infecção por T. on ii, já que a população e células CD4+ e stá sen o estruí a. Conforme já ito anteriormente, as células TH po em ser iv i i as em TH1 e TH2, no está io inicial a infecção temos quase que o equilíbrio entre as uas populações, e a população que irá prevalecer, será etermina a pe lo tempo e pelo curso que a infecção tomará e também o a ente parasitário em qu estão. Na malária, por exemplo, as células TH1 atuam iminuin o a parasitemia o s esporozoítas o P. vivax. A população e linfócitos TH1 ao liberar γIFN promov e a ativação e macrófa os a matar protozoários como o T. cruzi e T. on ii, ass im como aumenta a ativi a e contra outros parasitas. 76

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Em pessoas com a Leishmaniose cutânea ifusa e Leishmaniose visceral pro ressiva , as mesmas se caracterizam pelo ran e pro ução e IL-10, que é pro uzi a pela população e TH2 e que por isso inibe a população TH1, e talvez por isso a infec ção não seja tão bem controla a pelo sistema imune. Estu os in vitro emonstrara m que a IL-4 inibe a ativi a e o γIFN, e isto evita que os monócitos sejam ativ a os contra a L. onovani. Isto su ere que se usarmos IL-12 como terapia na Leis hmaniose, ela possa exercer ação anta onista sobre as IL-4, IL-10 e TGFβ, ativan do tam ém, de forma indireta, a ação da população TH1. Na infestação por vermes, a principal característica da resposta imune é a produção de I E e a eosinofili a, am as dependem da ação das citocinas li erada pelos linfócitos TH2. No entant o se o serva uma certa contri uição dos linfócitos TH1, que ainda não foi em es clarecida. Na esquistossomose a resposta promovida pela população de linfócitos TH2 parece ser importante na resistência a reinfecção quando o paciente foi su m etido ao tratamento com dro as. A resposta pela população TH2 parece ser estimul ada pelos ovos do esquistossoma. Em al umas infecções parasitárias o sistema imu ne não conse ue destruir o parasita, neste caso o ocorre a formação do ranuloma , com células se a lomerando ao redor do mesmo. Isto é o servado na esquistossom ose, onde ocorre a formação do ranuloma ao redor do ovo, esta reação é dependen te de linfócitos TH1, e é uma resposta local crônica mediada por células, onde h á a participação de citocinas como o TNFα e o γIFN. Os macrófa os acumulam e lib eram fatores o fibrino ênio que estimulam a formação o teci o ranulomatoso e acabam levan o a fibrose. Na esquistossomose a formação o ranuloma ocorre em r esposta a liberação e um antí eno solúvel secreta o ao re or o ovo que ficou p reso no fí a o. Embora essa reação pu esse beneficiar o hospe eiro, isolan o o f í a o a ação as toxinas secreta as pelo ovo, ela acaba sen o a causa patoló ic a a oença, promoven o reações irreversíveis no fí a o e a per a e sua função. Tanto essa reação é controla a por células T, que na sua ausência não se observ a a formação o ranuloma. As células TH2 também são importantes para expulsar o s vermes o intestino, pois elas ativam os mastócitos a liberarem pro utos que i ntera em com os eosinófilos, os quais contribuem no processo e expulsão o verme. As células TH2 po em in uzir os linfócitos B (via IL-4 e IL-5) a pro uzir anticorpos a classe I E e ain a a proliferação e mast ócitos (via IL-3, IL-4, IL-9 e IL-10) e ain a a hiperplasia as células secretor as e muco. Os vermes acabam sen o lesa os pela ação os anticorpos junto com a e ranulação os mastócitos sensibiliza os pela I E. Os mastócitos e ranulam hi stamina que aumenta a permeabili a e o epitélio intestinal e com isto permite q ue o complemento e os anticorpos presentes no plasma che uem à luz intestinal, a lém isso eles po em promover o aumento o peristaltismo intestinal, como forma e expulsar o parasito. Vários parasitos po em promover uma hiper ama lobulinemi a não específica, a qual po e ser evi o a liberação e substâncias os parasito s, que atuam como mitó enos as células B. Como exemplo, os níveis e imuno lobu linas I M se mostra aumenta o na tripanosomiase e na malária e 77

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I G na malária e na leishmaniose visceral. Quan o temos a pro ução e anticorpos específicos, temos estes atuan o e iferentes maneiras contra o antí eno, como exemplos, temos os anticorpos atuan o iretamente sobre o parasita o promoven o a ação o complemento sobre este, como ocorre na malária contra os esporozoítas ou na oença e cha as, iretamente sobre os tripanosomas; os anticorpos também po em neutralizar a ação o parasita bloquean o sua li ação à célula hospe eira , como acontece com os merozoítas, que só entram nos eritrócitos via roptria, à qual é bloquea a pelos anticorpos; po e ocorrer também o aumento a fa ocitose f eita pelos macrófa os, a qual é aumenta a quan o há também a participação o com plemento, via a interação os anticorpos com o receptor Fc os macrófa os e o c omplemento com o receptor para C3; também temos o mecanismo e citotoxici a e ce lular me ia a por anticorpos, muito eficaz nas infecções promovi as por T. cruzi , S.mansoni e al uns vermes filariói es, nesse caso células como macrófa os, neu trófilos e eosinófilos se li am aos parasitos recobertos por anticorpos via rece ptor e Fc ou e C3 e fazem a exocitose em cima o parasita. Foi observa o que epen en o o tipo e anticorpo envolvi o a resposta é iferente, como exemplo ci tamos a esquistossomose, on e a resistência é conferi a por anticorpos a classe I E, e a I G4 parece bloquear a ação a I E. Isto é muito observa o em crianças , pois elas apresentam alta pro ução e I G4 e com isso ficam susceptíveis a rei nfecções pelo esquistossoma Por vezes fica ifícil iferenciar entre uma respost a me ia a por células e por uma resposta me ia a por anticorpos, como ocorre na esquistossomose, on e temos a atuação e ambas as respostas. Nela o anticorpo é capaz e se li ar ao ovo e ativar o complemento, bem como a resposta me ia a por células como macrófa os, neutrófilos, plaquetas e eosinófilos. Os macrófa os e neutrófilos atuam provavelmente pela liberação e oxi ênio reativo e metabólitos o óxi o nítrico, e os eosinófilos atuam liberan o a MBP. Esta ação celular é a in a potencializa a pelas citocinas como a TGFα. Aind os nticorpos podem sensi biliz r o m stócitos f zerem degr nul ção de medi dores infl m tórios, incl uindo os que tiv m eosinófilos. Mec nismos de Esc pe dos p r sit s P r sit s co mo Leishm ni podem esc p r do sistem imune us ndo os receptores do complemen to p r entr r nos m cróf gos e ssim esc p r do met bolismo oxid tivo dos mesmo s. Outro exemplo em que o sistem imune s vezes é benéfico o p r sit , está em que o TNFα estimul o S. m nsoni produzir m is ovos. Alguns p r sit s t mbém podem resistir ção do sistem complemento, como é o c so d s Leishm ni , onde L. donov ni por ser resistente o complemento se esp lh com f cilid de n s v íscer s. No c so do T. cruzi, ele consegue esc p r d ção do complemento porque em su membr n existe um glicoproteín que possui tivid de semelh nte o F t or Aceler dor de Dec imento (DAF), p rece que os esquistossom s t mbém possuem u m molécul simil r o DAF. Os p r sit s intr celul res conseguem esc p r d des truição de vários modos, por exemplo, os que vivem no interior de m cróf gos con seguem esc p r d ção dos met bólitos de oxigênio e 78

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enzim s lisosom is, isso é observ do no T. gondii, que consegue evit r degr d ção pelos met bólitos do oxigênio e com Leishm ni , que entr n célul o se lig r os receptores do complemento e ssim esc p r d ção do f gossom . Além d isso Leishm ni possui enzim s que inibem produção dos met bólitos do oxigên io, como superóxido desmut se que protege dos r dic is do oxigênio, e ind present um c m d de Lipofosfoglic n (LPG) que tu como um escudo contr os met bólitos do oxigênio e o t que enzimático. Aind , um glicoproteín , Gp6 3 tu inibindo ção d s enzim s lisosom is do m cróf go. A Leishm ni spp. t mbém consegue inibir ou diminuir expressão d s molécul s de MHC d cl sse II d os m cróf gos de onde el s estão, com isso c p cid de dest s célul s estimul r em s célul s TH, é diminuíd . Alguns p r sit s podem ind se “esconder” do sis tem imune tr vés de v ri ções ntigênic s, como se observ nos p r sit s c us dores d m lári . Outros p r sit s, como é o c so dos esquistossom s, podem dqu irir um c m d de ntígenos do hospedeiro, de form que o sistem imune não con segue os reconhecer. Os esquistossom s poderi m se cobrir com molécul s do grupo s nguíneo A e B ssim como molécul s de MHC de cl sse II. Outros p r sit s como lgum s espécies de protozoários, como Ent moeb histolytic , e lguns helmin tos podem esc p r do t que do sistem imune form ndo cistos protetores. Os p r sit s t mbém podem present r c r cterístic s físic s que lhe conferem proteção, como é o c so dos esquistossomose, que tem um fin c m d que os protege de su bstânci s tóxic s l nç d s pel s célul s efetor s do hospedeiro, nos nem tódeos, su membr n froux pode ser desc rt d qu ndo está sob o t que do sistem i mune, cestódeos podem esc p r do t que de neutrófilos secret ndo um inibidor d el st se, o que f z p r r tr ção dest s célul s. Vários p r sit s podem resi stir o t que do met bolismo oxid tivo, como s flilári presentes nos linfonod os, onde el s secret m um glut tion peróxid se, os esquistossomose tem em su membr n um glut tion S tr nsfer se. Alguns nem tódeos e trem tódeos podem evi t r ção de imunoglobulin s secret ndo prote ses que cliv m imunoglobulin , removendo porção Fc. Os p r sit s t mbém podem present r tivid de imunosupre ssor , pois lguns podem destruir célul s linfóides ou o próprio tecido linfóide devido liber ção de um f tor linfocitotóxico, ou por interferir com função dos m cróf gos. Os m cróf gos podem ser recobertos com poliss c rídeos e glicoco njug dos que os vermes liber m e ssim s tur m o m cróf go, interferindo com seu process mento. N m lári , por exemplo, os m cróf gos cumul m hemozoín , que é um produto de degr d ção d hemoglobin , qu l interfere com su s funções. M uitos produtos p r sitários são c p zes de estimul r os m cróf gos liber r s prost gl ndin s e outr s molécul s imunosupressor s s qu is interferem com re spost infl m tóri . Outr s vezes os próprios vermes liber m prost gl ndin s, co mo é o c so de lgum s filári s e cestódeos. Antígenos solúveis liber dos em gr ndes qu ntid des pelos p r sit s podem tr p lh r respost imune um vez que e l s gem como um mec nismo de “distr ção” p r este. Um exemplo 79

           

       

 

       

             

 

 

 

 

 

   

 

 

     

 

Consequências imunopatoló icas as infecções parasitárias As respostas imunoló i cas al umas vezes ao invés e serem benéficas po em preju icar o hospe eiro. Na Leishmaniose visceral o aumento a ativi a e os macrófa os e linfócitos no fí a o e baço leva a hepato e esplenome alia. Na esquistossomose, a resposta imunopa toló ica se eve a formação os ranulomas ao re or os ovos, coman a os pelas c élulas T. A I E pro uzi a nas infestações por vermes po em levar uma ran e quan ti a e e mastócitos a e ranularem, levan o a pro ução o choque anafilático, c omo observa o no rompimento o cisto hi ático na infecção pelo E. ranulosus. Po e ocorrer a formação e autoanticorpos como observa o nas tripanosomiases e na malária, provavelmente evi o a ativação policlonal, com isso acabam sen o pro u zi os anticorpos para as hemácias, linfócitos e DNA. Po e ain a ocorrer a pro uç ão e anticorpos para os parasitas, mas que rea em cruza amente com os teci os o hospe eiro, como exemplo, temos a car iomiopatia, aumento o esôfa o e o me ac olon observa os na Doença e Cha as, que se eve a ação e anticorpos no ân lio nervoso e as células T que rea em cruza amente com o T. cruzi. 80

   

disso está no ntígeno solúvel S ou nos ntígenos termo resistentes do P. f lcip rum, que se lig m os nticorpos e ssim permitem que p r sit esc pe. T mbém m uitos dos ntígenos de membr n são liber dos sob form solúvel, como é o c so do LPG liber do pel Leishm ni e vários ntígenos de superfície liber dos pelo s esquistossom s. A supressão ntigênic t mbém ocorre por supressão d respost d Hipersensibilid de do tipo IV, fet ndo os linfócitos T CD4+ ssim como o b l nço entre s popul ções TH1 e TH2. N Leishm niose, foi observ do que s cultu r s de célul s T de p cientes com L. donov ni não er m c p zes de secret r IL2 ou γIFN quan o cultiva as com o antí eno específico. A expressão o MHC e cla sse II assim como a secreção e IL-1 se apresenta iminuí a, e a secreção e pro sta lan inas está aumenta a. Na filariose as células TH1 não proliferam em respo sta a antí enos específicos e a resposta realiza a por anticorpos permanece inta cta. Na ver a e o que se observa nos pacientes altamente infecta os com filarias e esquistossomas é que há ran es quanti a es e I G4, a qual tem efeito bloque a or sobre a ação a I E. Ain a na esquistossomose, anticorpos a classe I M e I G2 pro uzi os para al uns carbohi ratos os esquistossoma, são capazes e inibi r as funções citotóxicas os ranulócitos e estão correlaciona os com a suscepti bili a e a reinfecção. A IL-2 pro uzi a por linfócitos TH1 po e mostrar-se efic iente em al umas infecções por protozoários como ocorre na malária, e na oença e cha as, isto parece se ever a interferência que o parasita po e executar nos receptores a IL-2.

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A pro ução em excesso e al umas citocinas po e contribuir para as manifestações clínicas e al umas oenças um exemplo isto está na malária a u a, on e temos febre, anemia, iarreia e alterações pulmonares provavelmente evi o a ação o T NFα. Algum s vezes o poder imunosupressivo de lguns p r sit s é tão intenso que torn o hospedeiro susceptível infecções por vírus e b ctéri s. PRINCÍPIO DOS IMUNOENSAIOS As técnic s imunológic s se b sei m n re ção entre o ntígeno e o nticorpo, e b se do neste princípio, qu lquer molécul que se com porte como um ntígeno pode ser identific d por est s técnic s. N s re ções de precipit ção um d s c r cterístic s d re ção entre o ntígeno e o nticorpo, é que o complexo form do entre o ntígeno e o nticorpo se precipit em proporçõe s combin d s ou próximo zon de equiv lênci . Isso é melhor observ do n re çã o de preciptin , onde um ntígeno e um nticorpo são mistur dos em solução, tend o concentr ção de nticorpo fix , v i se ument ndo os poucos qu ntid de de ntígeno. Aos poucos o número tot l de imunocomplexos v i ument ndo e depois c omeç diminuir. Se for feito um gráfico d re ção de preciptin , teremos este dividido em três zon s diferentes, num primeir et p , temos o excesso de ntic orpo, nesse c so qu ntid de de ntígeno é insuficiente p r se complex r com t odos os nticorpos, logo não observ mos precipit ção. Em um segund et p , te mos qu ntid des equiv lentes de ntígeno e nticorpo, logo ocorre precipit ção de todo ntígeno e nticorpo presente. Por fim, num terceir et p , temos m is ntígeno do que nticorpo, e isto lev redução do volume precipit do, pois oc orre solubiliz ção do complexo ntígeno nticorpo form do devido o excesso de ntígeno presente. Este fenômeno ocorre in vitro com tod s s re ções que envol v m form ção do complexo ntígeno- nticorpo, e por isso, s vezes obtemos resu lt dos f lso neg tivos, qu ndo não diluímos um soro o suficiente, pois ocorre um fenômeno ch m do de pró zon , onde há t nto nticorpo, que re ção frente um ntígeno não ocorre de m neir dequ d , que permit ser visu liz d . A m iori dos imunoens ios pode ser dividid em dois gr ndes grupos, são eles os métodos competitivos e os métodos não competitivos. Nos métodos competitivos, substânc i ser n lis d ( n lito) e um substânci igu l que será n lis d só que m rc d (m rc dor), são mistur d s junto com um nti- n lito ( nticorpo p r s ubstânci ser n lis d ). Após incub ção por um determin do tempo, se mede qu ntid de de m rc dor lig do ou concentr ção de n lito presente n mostr . Nos métodos não competitivos, um excesso de imunore gente (pode ser nticorpo o u ntígeno), é dicion do, de form que o n lito forme um imunocomplexo com o i munore gente. O imunocomplexo é então qu ntific do e rel cion do com qu ntid d e de n lito presente n mostr . 81

 

 

 

 

 

                       

     

 

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Os métodos não competitivos são m is sensíveis que os métodos competitivos. A se nsibilid de d detecção feit pelos ens ios competitivos é limit d pel concent r ção de nticorpo us do, por outro l do sensibilid de dos métodos não competi tivos é determin d pel lig ção não específic dos imunore gentes m rc dos. Os métodos não competitivos podem ser us dos p r detecção de um molécul simple s desde que sej m us dos m rc dores f cilmente detectáveis e com b ix lig ção n ão específic . T nto os métodos competitivos qu nto os não competitivos requerem medição dos imunocomplexos n presenç de nticorpos e/ou ntígenos livres. N os imunoens ios “heterogêneos” (competitivos ou não competitivos), isto é feito se sep r ndo os imunocomplexos dos imunore gentes livres. Nos imunoens ios “homo gêneos”, modul ção do sin l ocorre como result do d imunore ção, lém do m is form ção dos imunocomplexos pode ser detect d sem sep r ção do imunore gen te lig do ou livre. 82

 

 

 

   

 

 

   

   

   

 

     

 

 

   

 

     

           

 

 

 

 

     

 

 

   

   

 

 

 

 

     

     

 

 

   

         

     

 

   

 

Ens ios Competitivos ) Com imobiliz ção do nticorpo Neste tipo de imunoens i o o nticorpo p r o n lito em questão é fix do em um suporte sólido (pl c de poliestireno, micropérol s, tubos, etc), por dsorção ou por lig ção cov lente. Os sítios livres do suporte sólido, que poderi m lig r substânci s inespecífic s , são bloque dos com um proteín como lbumin , fim de evit r interferênci n re ção. A mostr com o n lito é então coloc d no suporte sólido junto com o m rc dor (um substânci igu l o n lito só que m rc d ). O n lito então co mpete com o m rc dor pelos nticorpos fix dos no suporte sólido. Após um período de incub ção, o suporte sólido é l v do p r f zer remoção dos re gentes que não se lig r m e em seguid se procede leitur do sin l que o m rc dor emite. Este sin l é invers mente proporcion l qu ntid de de n lito presente, ou sej , qu nto m is n lito presente, menor o sin l e vice vers . O nticorpo p r o n lito us do deve ser o m is específico possível senão teremos lig ção de subs tânci s não específic s ele, o que lev re ção com result do f lso positivo. Se o nticorpo puder ser m rc do com biotin ou um h pteno (como substânci s co m os grupos nitrofenil), sem que h j um redução signific tiv de su finid de , então f se sólid recobert com estrept vidin ou um nticorpo p r h pteno pode ser utiliz do. A v nt gem de se f zer isso é que est configur ção pode ser plic d p r diferentes tipos de ens io. A f se sólid t mbém pode ser recober t com nticorpos com finid de p r porção Fc dos nticorpos p r o n lito ( nti n lito). Por exemplo, pode-se us r nticorpos de c br específicos p r porção Fc de nticorpos de coelho específicos p r o n lito fim de revestir o suporte. Est configur ção ssegur que o nticorpo p r o n lito será fix do o suporte sólido pel porção Fc e deste modo fic rá disposto de form propri d p r se lig r o n lito com m ior eficiênci . Consequentemente menos nticorp os p r o n lito são necessários p r c d ens io qu ndo comp r mos com o métod o direto ( nticorpo p r o n lito fix do no suporte). Qu nto m is t rde se dic ion o m rc dor pós dição do n lito, melhor será o result do obtido com r e ção, ument ndo-se ssim sensibilid de. Neste c so o melhor procedimento é s e incub r f se sólid com o n lito, té que o equilíbrio sej lc nç do, e po steriormente se dicion r o m rc dor e proceder nov incub ção p r que se lc n ce um novo equilíbrio. b) Com imobiliz ção do ntígeno Antígenos proteícos pod em ser imobiliz dos diret mente nos suportes de poliestireno por dsorção físic desde que estej m purific dos. No c so dos h ptenos, estes são inici lmente lig dos proteín c rre dor e então incub dos com f se sólid . Após o bloqueio, se dicion mostr e o nticorpo m rc do específico p r o n lito. O n lit o presente n mostr compete com o n lito imobiliz do por um determin do númer o de nticorpos m rc dos. Est re ção termin com l v gem do suporte sólido fim de remover os nticorpos não lig dos o n lito fix do no suporte 83

       

     

   

 

 

 

 

   

           

           

   

     

 

 

 

     

 

 

         

   

   

 

 

   

     

       

 

 

 

                 

 

 

   

     

 

   

 

       

   

 

         

 

 

 

                         

   

     

 

               

       

   

 

   

 

 

   

                                   

   

 

             

         

 

       

   

 

   

 

   

 

 

 

 

 

 

   

   

 

 

     

   

 

 

   

 

     

 

 

                           

         

                             

 

 

 

     

     

   

                       

 

                 

 

   

   

 

 

 

 

       

   

           

   

 

   

   

   

       

sólido. Qu nto m ior qu ntid de de n lito n mostr menor será qu ntid de de nticorpos m rc dos lig dos f se sólid . Se m rc ção diret dos nticorpo s p r o n lito não for possível, então pode-se us r um nti-soro bruto. Assim que imunore ção é complet d , detecção do nticorpo lig do f se sólid é f eit se us ndo um nti globulin m rc d . Ens ios Não Competitivos ) Ens ios tipo s nduíche (dois sítios) Estes ens ios s ão us dos p r detecção de ntígenos m cromolecul res, onde lig ção simultân e de dois nticorpos o ntígeno é possível sem interferênci estéric . A mo str é coloc d no suporte sólido o qu l está recoberto com nticorpos específic os p r o n lito ( nticorpos de c ptur ) e posteriormente bloque d . Posteriorm ente se procede incub ção p r que o nticorpo se ligue o n lito e em seguid se procede l v gem p r remover tudo que não se ligou. Agor em um segund et p se dicion um excesso de nticorpos m rc dos p r o n lito ( nticorpos d e detecção) e procede-se nov incub ção. Feito isso se l v o suporte sólido p r remoção dos nticorpos que não se lig r m e se procede leitur dos nticor pos lig dos. A esse processo se dá o nome de ens io s nduíche de du s f ses. A q u ntid de de n lito presente n mostr corresponde qu ntid de de nticorpos detect d n f se fin l. Neste ens io t mbém pode se dicion r mostr junto c om o nticorpo m rc do fim de se reduzir um et p no processo e por isso ch m do de processo de s nduíche de um et p . A leitur e interpret ção desse pro cesso se dá d mesm form que o processo de du s f ses. Este processo de um f se, embor rápido, pode present r problem s, como qu ndo concentr ção de n l ito super qu ntid de de nticorpos de c ptur e de detecção, d ndo v lores in feriores o que poderi se observ r. Pois neste c so o nticorpo de c ptur ( qu ele presente n f se sólid ), fic s tur do e um gr nde qu ntid de do n lito f ic em solução. A detecção do nticorpo é distribuíd entre s du s f ses do n lito. Os imunocomplexos form dos em solução são l v dos n et p seguinte incu b ção e ssim, um pequen qu ntid de dos nticorpos de detecção fic lig d o n lito que se ligou o nticorpo d f se sólid , logo o sin l detect do será me nor. C sos como estes em que há gr nde qu ntid de de n litos, lev ndo um resu lt do b ixo é observ do o se dos r m rc dores tumor is em p cientes com câncer, onde os ltos níveis de m rc dores presentes n s mostr s dão origem um sin l b ixo nos ens ios não competitivos de um p sso. Este efeito d gr nde qu ntid d e de n lito, pode ser detect do, se repetindo dos gem d nálise com mostr diluíd . A mostr diluíd dá um sin l m ior se houver o excesso de n lito. A ltern tiv mente, mostr é n lis d pós dição de um solução p drão conce ntr d do n lito. Qu ndo o efeito do excesso de n lito está presente, este pod e ser elimin do se 84

 

   

 

 

 

     

   

 

   

       

 

 

 

               

 

   

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

       

   

               

 

             

                   

 

 

 

 

 

 

 

   

 

 

 

   

 

       

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         

               

 

                   

   

   

 

 

   

 

   

     

 

     

 

         

 

 

 

 

     

ument ndo concentr ção do nticorpo de detecção té o ponto em que h j um ex cesso deste em rel ção o n lito. No ent nto diminuição d sensibilid de pode ser observ d devido lig ção não específic ssoci d lt detecção de nti corpos m rc dos. Pode-se minimiz r isto diluindose s mostr s vári s vezes nte s de proceder o ens io, desde que sensibilid de do teste permit isto. Os ens ios de du s et p s f zem uso de dois nticorpos monoclon is epecificos p r dife rentes epítopos dos ntígenos. Contudo combin ção de nticorpos monoclon is co m policlon is pode ser us d . Algum s vezes os mesmos nticorpos policlon is pod em ser us dos como nticorpos de c ptur e detecção. Como os ens ios de du s et p s us m dois nticorpos, eles present m melhor especificid de que os métodos d e competição. N verd de substânci s que re gem cruz d mente interferindo com os ens ios competitivos, não cheg m interferir nos ens ios de du s et p s porque norm lmente est s substânci s não se lig m os dois nticorpos de c ptur e de detecção. b) Imunoens ios p r nticorpos específicos e ens ios de c ptur de cl sses de imunoglobulin s Ens ios não competitivos us dos n determin ção de nti corpos específicos são incluídos neste grupo. A f se sólid é recobert com o n tígeno. Antígenos proteícos t mbém podem ser us dos p r recobrir o suporte sóli do, onde os h ptenos são primeir mente conjug dos com proteín s c rre dor s. A mostr diluíd é incub d junto com f se sólid . O nticorpo lig do f se sól id é então qu ntific do us ndo-se um nti globulin m rc d . Este tipo de ens io é especi lmente útil n pesquis de hibridom s p r produção de nticorpos monoclon is. Nos ens ios de c ptur de cl sse de imunoglobulin , f se sólid é recobert com nticorpos p r cl sse que se desej qu ntific r presentes n mostr . Após incub ção d mostr com f se sólid se procede-se l v gem qu e irá remover tudo que não se ligou por não ser específico. Posteriormente o nt ígeno de interesse é dicion do e c ptur do pelos nticorpos específicos lig dos n f se sólid . A lig ção do ntígeno é determin d pel dição de um nticorpo m rc do p r o ntígeno. Como exemplos deste tipo de ens io temos determin çã o de IgM no di gnóstico d infecção gud e determin ção de IgE p r lguns l ergenos específicos. Os ens ios de c ptur de cl sse de imunoglobulin s são m is específicos se comp r dos com queles que empreg m o ntígeno fix do no suporte sólido, especi lmente p r nticorpos de cl sses que se present m em pequen q u ntid de, já que todos os outros nticorpos são removidos ntes d dição do n tígeno. c) M pe mento de epítopos Nos c sos em que temos vários nticorpos monoc lon is p r o mesmo ntígeno, pode ser necessário se determin r se eles se lig m diferentes epítopos que se sobrepõe. Um f se sólid recobert com o ntígeno purific do é incub do com nticorpos monoclon is m rc dos junto com diferentes concentr ções de outro nticorpo monoclon l, só que este não está m rc do. Se os dois nticorpos se lig rem o mesmo epítopo sobreposto, então, devido competi ção que ocorre entre 85

 

     

   

 

 

       

         

                   

           

   

           

 

   

 

     

         

   

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                             

     

 

   

 

               

     

   

 

 

 

   

     

   

 

 

   

       

 

 

   

   

                   

 

 

     

 

   

 

         

 

 

   

                                                                       

         

 

 

 

 

 

   

 

     

 

 

                                 

 

       

   

 

 

       

 

 

 

 

 

   

 

   

 

   

Imunoens ios Não Competitivos P r p r H ptenos com Grupos Amino 86

Molécul s Pequen s ) Ens ios de dois sítios

   

eles o sin l diminui conforme concentr ção do nticorpo não m rc do ument . O sin l perm necerá o mesmo se os dois nticorpos se lig rem diferentes epítopo s. Um configur ção levemente modific d pode ser us d se um prep r ção ntigê nic purific d não estiver disponível p r recobrir o suporte sólido. Nesse c s o, o nticorpo monoclon l p r o ntígeno desej do, é coloc do p r recobrir o s uporte sólido. Posteriormente se dicion solução ntígenic não purific d , p rocede-se incub ção e l v gem p r remoção de tudo que não se ligou, inclu indo-se í s proteín s inespecífic s. Posteriormente se dicion o nticorpo mo noclon l m rc do junto com o nticorpo monoclon l não m rc do e incub -se mos tr . A interpret ção d leitur se d do mesmo modo que no procedimento descrito cim . Imunoens ios P r Antígenos Imobiliz dos n F se Sólid Este grupo envol ve detecção de proteín s ntigênic s em Western Blots. As proteín s são primei r mente sep r d s por um gel de poli cril mid e tr nsferidos por eletroeluição p r um membr n de nitrocelulose. A membr n é então incub d com um solução proteíc como lbumin ou leite desn t do, fim de bloque r os esp ços v zios d nitrocelulose. A seguir se dicion o nticorpo de interesse p r proteín , incub -se por um determin do tempo e posteriormente se procede l v gem do exce sso de nticorpo, e o imunocomplexo form do é detect do pel dição de um imuno globulin p r o nticorpo que se ligou o ntígeno. Este procedimento oferece lt sensibilid de, m ior té do que se us sse um nticorpo m rc do específico p r o ntígeno. Existem outr s técnic s p r detecção de imunocomplexos só que es t s serão descrit s os poucos, conforme necessid de. N s re ções de imunoblot podemos l nç r mão de nticorpos monoclon is ou policlon is. Cl ro que os ntic orpos monoclon is são m is específicos m s eles podem f lh r qu ndo se tr t de f zer lig ção com proteín s que tenh m se desn tur do dur nte eletroforese. Por outro l do, o soro policlon l contém nticorpos que inter gem com epítopos q ue perm necer m int ctos pós eletroforese e/ou tr nsferênci . Além do m is, m is de um nticorpo pode se lig r mesm molécul ntígenic . Deste modo os nt icorpos policlon is oferecem m ior sensibilid de e por isso são m is us dos no i munoblot. A m iori dos m rc dores us dos são enzim s como fosf t se lc lin e peroxid se. As enzim s se convertem de um substr to solúvel em um produto colo rido, fluorescente ou quimioluminescente. Como exemplo cit mos di minobenzidin , que é um do dor de hidrogênio p r peroxid se, e por isso dquire um cor m rrom , t mbém mistur de fosf to de bromocloroindol com o zul de nitrotetr z ol, dá um precipt do de cor púrpur , pode ser us do como substr to p r fosf t se lc lin .

       

 

 

 

   

   

     

   

     

 

 

 

     

   

           

             

     

                       

 

   

 

   

     

   

     

 

     

 

   

 

 

 

   

 

         

   

     

 

 

   

 

     

 

 

 

                 

 

 

                 

                 

           

 

     

 

   

 

   

 

   

 

 

     

   

         

     

   

         

 

 

 

       

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

   

           

 

   

       

         

                 

           

     

 

 

 

   

 

     

           

 

   

             

 

 

         

Neste tipo de ens io, substânci s contendo o grupo mino n mostr são inici lm ente biotinil d s se us ndo o ester de biotin N-hidroxisuccinimid em excesso. Feito isso mostr é incub d com um nticorpo p r o H pteno que está recobri ndo f se sólid . Nest et p o H pteno biotinil do é c ptur do pel f se sólid , sendo que biotin livre com lgum s molécul s biotinil d s são l v d s pós um tempo de incub ção. Posteriormente os imunocomplexos são dissoci dos no pH 1 ,0 e solução é post p r re gir frente nticorpos p r o H pteno m rc dos c om um enzim que é c ptur d por um f se sólid recobert com etrept vidin . A tivid de d enzim lig d f se sólid é rel cion d diret mente concentr ç ão de h pteno presente n mostr . Est configur ção só será bem sucedid se o s ítio de biotinil ção estiver longe o suficiente do sítio onde está o epítopo, fim de permitir lig ção simultâne d estrept vidin e do nticorpo p r o H p teno. Oligopeptideos constituídos de 9 minoácidos for m determin dos por este m étodo em concentr ções inferiores 50 mol. H ptenos pequenos, como Tiroxin , podem ser determin dos por este método pen s se for introduzido um “esp ç dor” entre porção biotinil d e o sítio do epítopo. Este tipo de ens io cheg se r té 50 vezes m is sensível que os ensáios de competição us ndo os mesmos ntic orpos m rc dos. b) Ens io idiométrico Neste tipo de ens io mostr é pipet d em um f se sólid recobert com um nticorpo p r o H pteno ( nticorpo primário ). Após re ção imune ter se complet do, se dicion um nticorpo p r idiotipo do tipo β, o qual irá se li ar aos sítios de li ação primários livres do antico rpo. Após a lava em se adiciona um anticorpo para idiotipo do tipo α, que se lig rá os complexos primários do nticorpo/H pteno. Este nticorpo só não se lig r á o nticorpo primário d f se sólid se o nticorpo do tipo β já estiver li ad o ao anticorpo da fase sólida. O sinal medido é proporcional a concentração de H apteno presente na amostra. c) Imunoensaios com o epítopo fixado à fase sólida ( SPIE-IA) Esta é uma confi uração de imunoensaio proposta nos últimos anos para p equenos Haptenos contendo rupos amino livres, os quais não fazem parte da estru tura do epítopo. O hapteno é primeiramente capturado por uma fase sólida reco et a com anticorpos para o Hapteno. O Hapteno é então covalentemente li ado as prot eínas da fase sólida, isto é ao anticorpo e as proteínas de loqueio. Isto é aco mpanhado se usando um rea ente homo ifuncional de li ação cruzada para rupos am ino primários, como o lutaraldeído ou disuccimidil su erato. A reação acontece em condições amenas as quais não rompem o complexo hapteno-anticorpo. A etapa de desnaturação se ue com a adição de metanol ou ácido clorídrico, que serve para dissociar o imunocomplexo e expor o Hapteno imo ilizado a detecção do anticorpo. O mesmo anticorpo monoclonal, marcado com acetilcolinesterase, é usado da mesma forma que na detecção do anticorpo. Ensaios deste tipo parecem ser de 70 a 200 vezes mais sensíveis que os ensaios de competição que empre am os mesmos anticor pos fixados a fase sólida e um hapteno conju ado a acetilcolinesterase como marc ador. 87

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d) Ensaios de li ação de fase líquida (LBA) Neste tipo de ensaio a reação ocorre em solução. O analito rea e com excesso de anticorpo marcado com peroxidase. Ap ós a reação ter se completado, as formas li adas e livres do anticorpo são separ adas por cromato rafia liquida de alto desempenho em uma coluna de troca catiôni ca. A reação enzimática pós coluna é realizada se misturando o su strato com o l íquido que sai da coluna passando em uma o ina, se uido por uma detecção fluori métrica. No caso de antí enos macromoleculares, a separação dos imunocomplexos d os anticorpos livres pode ser feita com a filtração em el de uma cromato rafia liquida de alta performance, já que a massa molecular do imunocomplexo é muito m aior que a do anticorpo livre. DETECÇÃO INDIRETA DE IMUNOCOMPLEXOS Neste caso a molécula carreadora do sinal ou eradora do sinal, como os radioisótopos, enzima ou marcadores fluorescentes ou quimioluminescentes, não estão li ados diretamente a um dos imunorea entes, mas estão li ados de forma não covalente e especificamente ao imunocomplexo assim q ue a reação se completa. A maior vanta em dos sistemas empre ando a detecção ind ireta é que a mesma molécula reveladora carre ando o imunorea ente pode ser usad a em uma variedade de imunoensaios. Além disso, o uso de sistemas de detecção in direta eralmente são responsáveis por ensaios de alta sensi ilidade, uma vez qu e mais moléculas carreadoras de sinal, se li am ao imunocomplexos do que em ensa ios onde a detecção do anticorpo está diretamente conju ado a molécula sinalizad ora. a) Detecção de imunocomplexos com uma imuno lo ulina marcada Neste tipo de ensaio o anticorpo de detecção não está marcado. Após a formação do imunocomplex o, um anticorpo marcado para anti lo ulina é adicionado, este se li ará as re iõ es constantes não variáveis do anticorpo. Esta técnica é especialmente útil quan do a marcação direta do anticorpo de detecção é difícil e resulta na perda de im unoreatividade. Anticorpos para imuno lo ulinas de várias espécies, marcados com moléculas fluorescentes ou enzimas estão disponíveis no comércio a um custo rel ativamente aixo. Além do mais esta confi uração promove a amplificação do sinal mais do que se uma imuno lo ulina marcada para cada antí eno fosse usada. Em su ma, uma simples molécula de imuno lo ulina marcada pode ser usada para detecção de vários anticorpos da mesma espécie. O pré requisito para a confi uração acima é que os anticorpos de captura e de detecção sejam de espécies diferentes, de f orma que a imuno lo ulina marcada não reaja com o anticorpo de captura fixado no suporte sólido. Alternativamente, fra mentos de Fa ou F(a )2, são empre ados c omo anticorpos de captura junto com anticorpos marcados para a re ião Fc do anti corpo de detecção. ) Proteína A 88

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A proteína A é uma proteína de 42kDa encontrada na parede celular do Staphylococ cus aureus. Ela se li a com alta afinidade a re ião Fc das imuno lo ulinas de vá rias espécies. Existem 4 sítios de li ação para os anticorpos, mas apenas dois d eles podem ser usados simultaneamente. A proteína A marcada é útil na detecção i ndireta de antí enos imo ilizados em um suporte sólido. Nestes ensaios, um antic orpo de detecção não marcado é adicionado a fase sólida e então o imunocomplexo formado é quantificado com a proteína A marcada. A proteína A tam ém pode ser us ada para a detecção de imunocomplexos em ensaios tipo sanduíche, asse urando que fra mentos Fa são usados ao invés do anticorpo total para reco rir o suporte s ólido. A proteína A não marcada tam ém pode ser usada como ponte entre duas molé culas de anticorpo, isto é, para a detecção de anticorpo do imunocomplexo e do a nticorpo marcado. A afinidade da proteína A para imuno lo ulinas depende da clas se da imuno lo ulina e a que espécie ela pertence. Por exemplo, a proteína A tem aixa afinidade para imuno lo ulinas I G1 de ratos, e tem alta afinidade pelas imuno lo ulinas de humanos e de coelhos. c) O sistema Biotina-Estreptavidina Con ju ados de estreptavidina com enzimas como a Fosfatase alcalina, peroxidase ou m oléculas fluorescêntes estão comercialmente disponíveis. Anticorpos podem ser ma rcados com várias iotinas sem que haja uma perda si nificativa de sua capacidad e de se li ar ao antí eno. Consequentemente, mais de uma molécula de estreptavid ina marcada pode se li ar a cada anticorpo. Além do mais uma amplificação é intr oduzida a qual resulta no aumento de sensi ilidade. Como a estreptavidina possui 4 sítios de li ação para a iotina, ela pode atuar como uma ponte entre duas mo léculas iotiniladas. Os imunorea entes iotinilados e a estreptavidina marcada são estáveis por lon o período de tempo. O sistema iotina-estreptavidina pode s er usado para a detecção de imunocomplexos dos se uintes modos: a) Os antí enos ou anticorpos de detecção podem ser marcados com iotina. Após a imunoreação ter se completado, o excesso de rea ente é removido com uma lava em e o imunocomple xo é quantificado pela adição da estreptavidina marcada. ) Os antí enos ou anti corpos de detecção são marcados com iotina. Após a imunoreação ter se completad o, o imunocomplexo é colocado para rea ir com um excesso de estreptavidina não m arcada. A estreptavidina não li ada é removida com uma lava em, e posteriormente se adiciona uma molécula iotinilada marcada. Ex: Fosfatase alcalina iotinilad a ou peroxidase iotinilada. Neste caso a estreptavidina é usada como ponte entr e o anticorpo de detecção iotinilado e a molécula iotinilada marcada. c) A est reptavidina é posta para rea ir primeiro com uma enzima iotinilada e forma comp lexos macromoleculares, os quais envolvem várias moléculas fazendo ponte com a e streptavidina. A proporção de streptavidina e enzima iotinilada pode ser optimi zada de forma que a estreptavidina não fique saturada e so re pelo menos um síti o de li ação para os imunorea entes iotinilados. 89

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d) Ensaios usando complexos enzima-anti-enzima Neste tipo de ensaio, a molécula er adora de sinal são complexos solúveis pré formados de uma enzima com anticorpos para a enzima (anticorpos policlonais ou monoclonais). Estes anticorpos para enz ima são da mesma espécie assim como o anticorpo de detecção usado no imunoensaio . Após a imunoreação ser completada os complexos enzima-anticorpo fazem uma pont e com o anticorpo de detecção ao se usar um anticorpo para imuno lo ulina. Compl exos de PeroxidaseAnti preoxidase (PAP) e Fosfatase alcalina-anticorpo são lar a mente usados na imunohistoquímica. 90

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CONTROLE DE QUALIDADE NOS IMUNOENSAIOS A finalidade de um imunoensaio é que este consi a determinar com precisão a quantidade ou a concentração de analito. Para os imunoensaios, o termo potência estimada é usado para estimar a concentração do analito, por exemplo, M, n /ml, mUI/ml. A sensi ilidade é definida como a qua ntidade mínima do analito que pode ser detectada com precisão. Al umas definiçõe s de sensi ilidade se referem a posição a soluta ou a su ida da curva de dose-ef eito do que ao limite mínimo de detecção. A especificidade se refere a capacidad e do imunoensaio medir unicamente o analito de interesse. O rau que outros anal itos rea em cruzadamente no imunoensaio é que afetam esta especificidade. A exat idão se refere ao ajuste que ocorre entre a resposta verdadeira e a resposta dad a pelo imunoensaio. A precisão se refere aos resultados em acordo que aparecem e m medições repetidas. Nos imunoensaios, a precisão é normalmente expressa como v ariação intra e inter-ensaio, calculados como coeficiente de variação. Erros esq uemáticos e erros randômicos Os erros esquemáticos são detectados nos valores re ais ou exatos em ensaios repetidos. Consequentemente, a inexatidão no imunoensai o se refere a erros esquemáticos. A validação dos imunoensáios, muitas das vezes se refere a investi ação destes erros esquemáticos que podem ocorrer, que devem ser corri idos ou eliminados. Com relação aos erros randômicos, estes são os qu e mais afetam a precisão. Os erros randômicos não podem ser eliminados mas podem ser minimizados. Os erros randômicos que se acumulam durante o processamento do imunoensaio, podem ser quantificados estatísticamente e usados para arantir li mites de confiança para expressão dos resultados. A avaliação da qualidade envol ve a determinação de que um imunoensaio está livre de erros sistemáticos assim c omo a estimativa dos erros randômicos. VALIDAÇÃO DE UM ENSAIO Para se validar um imunoensaio é necessário se determinar se os valores o tidos com o mesmo estão precisos e corretos. A validação de um ensaio normalmente ocorre em fases. A pri meira fase é para a avaliação da sensi ilidade e especificidade, a se unda fase é para se investi ar a exatidão do imunoensaio comparando-o com métodos de refer ência. Um o jetivo frequente é o ter resultados do desconhecido com o mínimo de manipulação da amostra. Deste modo a validação do imunoensaio tam ém envolve se sa er se a determinação dos constituintes da amostra possuem efeito si nificativ o no ensaio e/ou a identificação de que tipos de preparação de amostra são neces sários para se alcançar com exatidão a estimativa de potência. A fase final da v alidação é limitada a aplicação clínica do imunoensaio, a fim de sa er se ele fo rnece os dados desejados nas condições desejadas. A sensi ilidade do imunoensaio A sensi ilidade pode ser definida como a quantidade de analito necessária para produzir uma mudança na resposta a qual é si nificantemente diferente da respost a o tida na ausência do analito 91

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(dose zero de analito). Se a sensi ilidade não for aixa o suficiente para ser ú til na aplicação desejada, deve-se considerar a produção ou o tenção de outros r ea entes. Para se sa er o quão específico é o imunoensaio, inicialmente se monta um painel com um lar o espectro de compostos, em uma alta dosa em, normalmente de 1.000 a 10.000 vezes mais concentrado do que se costuma usar para a monta em de uma curva padrão. Su stâncias que apresentam uma ini ição mínima para a li aç ão do analito ao anticorpo ou anticorpos, não rea em cruzadamente de modo si nif icativo. Os compostos que ini em a li ação do analito ao anticorpo em altas dose s devem ser examinados em detalhes. A estraté ia típica, é de se construir curva s de doseefeito para aquele do analito usando um teste de similaridade (paraleli smo). Este procedimento determina se a su stância rea e de modo semelhante ao do analito de interesse e a sua relativa potência. Por comodidade, a reação cruzad a de uma su stância em particular em um imunoensaio é frequentemente expressa em percenta em. Deste modo uma potencia relativa de 0,01 corresponde a 1% de reaçã o cruzada. Um outro meio de se expressar a mesma coisa é dizer que a dose da su stância teste é 100 vezes maior do que a dose de referência do analito, levando a mesma resposta no imunoensaio. Outra estraté ia de se determinar a reação cruz ada envolve a determinação de uma série de reações as quais contém uma quantidad e fixa do analito de interesse (como uma dose que corresponda a aproximadamente metade da curva de dose-efeito). Procede-se uma série de reações, aumentando-se radativamente as quantidades da su stância de teste. A dose da su stância de te ste que não causa alteração si nificativa na resposta é o tida como a quantidade máxima da su stância de teste que pode estar presente em uma amostra e não inte rferir com esta na interação analito-anticorpo. Quando caracterizamos a especifi cidade de um imunoensaio, é importante que desenvolvamos uma estraté ia racional para monitorar a reação cruzada. A fim de ilustrar este ponto, suponha que temo s um imunoensaio para a dosa em da Testosterona. Quando construímos ou utilizamo s um ensaio para a Testosterona, é essencial sa ermos se este ensaio rea e cruza damente com outros hormônios andro ênicos como o 5α-dihidrotestosteron , ndrost enedion , dehidroepi ndrosteron e

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ndrostenediol; met bólitos do ndrogênio como 5α- ndrostenediol, ndrosteron e etiocol nolon ; percursores esteroid is como colesterol, pregnenolon , progeste ron , 17-hidroxipregnenolon e 17hidroxiprogesteron ; e esteróides em outr s cl sses que costum m est r presentes nos fluídos corpor is como estrogeneos, glicor ticoídes e miner locorticoídes. Se o ens io for us do p r medir Testosteron em p cientes que poss m est r recebendo esteróides sintéticos, como nticoncepcion is e glicorticoídes sintéticos, re ção cruz d com est s substânci s t mbém d eve ser pesquis d . Se o ens io for utiliz do p r o uso em um situ ção específ ic onde certos compostos estão presentes em lt s concentr ções, é desejável qu e se demonstre que estes não são c p zes de interferir. Um exemplo disso está qu ndo se us v o R dio Imuno Ens io (RIA) p r Testosteron p r di gnostic r o e feito

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d s prost gl ndin s n produção de ndrógenos, er necessário se demonstr r que Testosteron podi ser medid com ex tidão n presenç de lt s concentr ções de Prost gl ndin s. Se um imunoens io p r pequenos peptídeos está sendo desenvo lvido, re ção cruz d de outros peptídeos com estrutur s semelh ntes deve ser ex min d . A especificid de dos imunoens ios p r pequenos peptídeos pode norm l mente ser determin d se ger ndo pequenos fr gmentos peptídicos de um peptídeo s intético e se ex min ndo re ção cruz d . O mesmo conceito se plic construç ão de um imunoens io p r hormônios proteícos. Como exemplo temos os ens ios p r gon dotrofin corionic hum n (hCG). O hCG é composto de du s subunid des d iferentes, ch m d s de lf e bet . A subunid de lf é comum os hormônios pitu itários, hLH, hFSH e hTSH. A subunid de bet possui um sequênci de minoácidos que é muito semelh nte do hLH, únic diferenç é que do hCG possui um se qüênci dicion l de 24 minoácidos n porção c rboxi termin l. Um investig ção minucios de um ens io p r o hCG deve lev r em cont re ção cruz d que pode ocorrer com um série de proteín s hormon is produzidos pel glândul pituitári nterior e pel pl cent ssim como outros hormônios presentes nos fluídos cor por is. Um questão post sempre em dúvid , é que porcent gem devemos consider r um re ção cruz d signific nte? Re ções cruz d s menores que 0,001% (1 em 10 0.000) não são nenhum problem . Altos percentu is devem ser preci dos de cordo com o c so. Por exemplo, no c so d Testosteron , 5% de re ção cruz d p r out ro ndrógeno com um estrutur semelh nte, como o 5αdihidrotestosteron , não é m otivo de preocup ção; n verd de um imunoens io que discrimin estes dois ndróg enos este nível é muito útil. No ent nto qu ndo o mesmo imunoens io será us do p r medição só d Testosteron sem sep r ção d o 5α-dihidrotestosteron d o m teri l. Outro exemplo está se queremos dos r Progesteron dur nte gr vid ez, sem que tenh mos que sep r r os outros esteróides, nesse c so 1% de re ção c ruz d é lgo se pens r. T mbém 10% de re ção cruz d do hLH com um kit p r d etermin ção de hCG em mulheres grávid s é lgo b st nte sério, m s se este kit n ão for us do p r mulheres grávid s, ele pode ser us do. Como se vê, determin ção de que percentu l de re ção cruz d é signific tivo, depende d plic ção do kit e p r que fim di gnóstico se destin . Outro ponto se consider r nos inun oens ios é qu l epítopo o nticorpo fix do n f se sólid reconhece, pois de co rdo com isso s beremos se o kit é m is ou menos específico. A ex tidão Outr et p critic dos imunoens ois se refere su ex tidão, p r est belecer este conc eito, devemos comp r r os result dos obtidos do novo imunoens io com os result d os de um método bem conhecido e p droniz do. A escolh de imunoens io p r deter min r um n lito em p rticul r é norm lmente com o intuito de, p r f cilit r coloc ção d mostr e m teri is p r re gir. Muitos métodos de referênci são c omplexos e consomem muito tempo n execução pois c b m envolvendo 93

 

 

 

   

                                 

 

   

 

   

     

   

 

   

     

 

 

 

       

   

 

 

 

 

 

 

   

 

   

   

 

 

     

   

 

 

   

     

 

   

 

           

 

     

   

 

 

   

 

         

   

 

 

 

       

 

 

 

 

 

   

   

 

                   

   

       

   

 

 

 

 

 

   

     

   

                                     

 

 

 

   

 

 

         

     

 

 

 

       

     

 

 

 

 

 

 

 

             

 

   

   

         

 

     

   

   

 

 

   

 

       

             

                           

           

         

   

 

 

 

 

 

   

     

 

     

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 

vári s et p s de m nipul ção. Como medição destes ens ios é feit por métodos qu ímicos ou biológicos, não há um regr específic p r todos os ens ios. No ent nto, lgum s consider ções podem ser feit s, m iori dos ens ios p r esteríod es er v lid d frente ens ios de crom togr fi gás-líquido; imunoens ios p r proteín s podem ser v lid dos com bioens ios. Qu ndo se comp r os v lores obti dos no imunoens io e do método de referênci , deve-se ter conhecimento d s limit ções, ex tidão e precisão do método de referênci . Como substânci s constituint es d mostr podem influenci r n estim tiv de potênci Em um imunoens io, tud o que estej presente n mostr diferente do n lito constitui o que se ch m d e m triz d mostr . M trizes comuns de mostr incluem soro, pl sm , urin , s l iv , e extr tos de tecidos. Os fluídos corpor is são mistur s complex s de subst ânci s que podem interromper o imunoens io de vári s m neir s como: interferindo com lig ção do n lito o nticorpo primário, por competir com o composto ou de um m neir não específic , por promover um lig nte competidor como um esteró ide ou proteín s lig ntes de tiroíde, por interferir com os re gentes us dos p r sep r r form s lig d s e livres e/ou por interferir com o sistem de detecção (r diométrico, fluorescente ou enzimático). As m trizes que possuem m ior influê nci nos imunoens ios, norm lmente são observ dos como result dos imprecisos. Po r exemplo, o uso de imunoens ios p r dos r esteróides no soro ou pl sm lev result dos imprecisos porque m tirz d mostr contém proteín s de lt finid de p r estes hormônios. Outros tipos de efeitos promovidos pel m triz são m i s sutis. Se presentes, estes podem ser evidentes de um modo diferente n nálise do comport mento d s curv s dose-efeito p r o n lito estud do com um mistur p drão versus mostr m triz. No ent nto obtenção de curv s dose-efeito sem elh ntes ou p r lel s não prov que interferênci n mostr se deve o efeito d m triz presente n mostr . Os testes de simil rid de ou p r lelismo devem s er interpret dos em conjunto com testes de ex tidão. As estr tégi s p r determi n r se os efeitos m triz são signific ntes são: i) Comp r r s curv s prep r d s no t mpão diluente com quel s prep r d s com mostr m triz destituíd do n lito; ii) Determin r se o umento de mostr do n lito dicion d mostr m triz pode ser qu ntit tiv mente recuper d (teste de videz); iii) Test r os efe itos d dição de qu ntid des c d vez m iores de m triz, neste c so m triz re present um mostr que possui um qu ntid de desconhecid de n lito. No prime iro e no terceiro c sos, dificuld de em se mont r um curv dose-efeito com o mesmo tipo de ond (curv s semelh ntes ou p r lel s), é c us de preocup ção. Co mo form de torn r os testes de simil rid de signific tivos, eles devem ser pli c dos em vári s mostr s que representem s diferentes cl sses de mostr s que v enh m ser n liz d s. Existe um teste que permite um mostr desconhecid pod e ser test d em um nível com um dose simples onde liquot s d mostr são mis tur d s com qu ntid des crescentes do n lito. A 94

       

   

 

 

 

 

           

   

 

 

 

   

   

   

 

 

                                   

 

 

         

 

 

 

   

 

     

 

 

   

 

 

 

 

     

 

   

   

 

         

         

         

                           

       

   

   

       

   

 

       

 

 

       

Com rel ção o condicion mento do kit O kit deve ser condicion do n s condiçõe s dequ d s p r preserv ção do mesmo, sempre seguindo s recomend ções do f bri c nte. Um medid que muitos não tem em mente, por não 95

         

qu ntid de de n lito n s mostr s serem mistur d s deve equiv ler qu ntid d e de n lito presente n mostr origin l m is qu ntid de ser dicion d . Es te teste é rel tiv mente fr co p r determin ção dos efeitos de m triz, pois m triz é dicion d em um nível e mostr é norm lmente mistur d com o n li to puro. A demonstr ção de que qu ntid des dicion is de mostr m triz re gem d e modo semelh nte o n lito p drão são m is convincentes. Se for encontr do o e feito de m triz, o imunoens io deve ter seu protocolo lter do fim de evit r e st interferênci . Est revisão pode incluir o prep ro de um nov curv de c li br ção com um m triz semelh nte desconhecid m s destituíd do n lito, ou po de envolver et p s dicion is no prep ro d mostr . Como s ber se o imunoens io fornece um respost confiável A f se fin l d v lid ção de um imunoens io, é p roceder um teste com o mesmo se l nç ndo mão de mostr s selecion d s p r t l. Por exemplo, supondo que o teste sej p r determin ção do hCG como confirm ção de gr videz, m s se desej utiliz -lo p r determin ção do hCG produzido em l guns tumores. P r isso mostr s do soro de homens e mulheres não grávid s devem d r result dos neg tivos. Já s mostr s de mulheres em diferentes et p s d gr videz devem ser positiv s e s concentr ções obtid s devem ser equiv lentes o do método de referênci . Amostr s de p cientes que present m tumores produtores de hCG devem ser positiv s e mostr s de p cientes com tumores, m s não produto res de hCG devem ser neg tiv s. Nest f se de v lid ção do imunoens io, escolh de mostr s de referênci deve é muito import nte, já que os result dos oriund os de t is mostr s serão us dos p r est belecer os v lores norm is do ens io e os limites de detecção do mesmo. OUTRAS MEDIDAS PARA GARANTIR QUALIDADE Com rel ção mostr A colet d mostr t mbém ssegur o bom controle de qu lid de, el pode fet r ex tidão e interpret ção dos result dos. As mostr s ssim q ue entr m no l bor tório devem ter identific ção com d dos precisos, est r co ndicion do de form propri d , sem v z mentos e nem est r com m teri l em f lt p r s nálises que se desej f zer. Em ger l s interferênci s rel tiv s o m teri l envolvem o m teri l com hemólise, lipêmico ou com excesso de bilirrubin . No c so do soro ictérico é dificil se rejeit r o mesmo pois ger lmente se orig in de lgum est do p tológico do p ciente. Já o m teri l hemolis do, n m iori d s vezes envolve colet m l re liz d ou sep r ção do soro ntes d retr ç ão complet do coágulo e por isso se recomend inspeção do colet dor. Qu nto o soro lipêmico, já foi descrito que se for feit centrifug ção lt velocid de do soro, bo p rte dest pode ser removid .

   

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         

     

 

             

 

 

       

 

 

 

                   

         

   

       

Não signific tivo mínim 10 (em linh ) Não signific tivo 1,0

(mg de SiO2 /L) Cont min ntes orgânicos M teri l p rticul do P ss r por filtro d e Não signific tivo Não signific tivo

Com relação aos pa rões Existem três tipos e pa rão que costumam ser usa os no laboratório, os pa rões primários, secun ários e os materiais e referência. Os pa rões primários são aqueles em que há um certa quanti a e e um analito e po e ser usa o para se eterminar a concentração ireta e tem um coeficiente e ativ i a e e 1. Os pa rões primários normalmente são prepara os em á ua ou em soluçõ es proteícas com solventes or ânicos. Os pa rões secun ários são etermina os em comparação com um pa rão e valor já conheci o realiza o em um méto o e referê ncia conheci o. Os materiais e referência, são aqueles usa os na calibração e aparelhos, vali ar um ensaio ou estabelecer valores aos materiais. Os materiais e referência po em ser vacinas com a quanti a e 96

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c rvão tiv do Não deve ser superior o

Não signific tivo 0,22μm Não si nificativ

   

 

 

 

 

 

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b ctéri s (CFU/ml) pH Resistivid de (MΩ cm 1.0 o

25 C) Máximo de silic tos 0,05 0,1

     

conhecer o funcion mento dos refriger dores, é o condicion mento de kits em gel deir s do tipo frost-free, este tipo de equip mento não é o ide l devido gr n de v ri ção de temper tur p r os degelos const ntes, que ocorre neste. Est c r cterístic dos equip mentos frost-free, f z com que vid útil do kit diminu . T mbém medid s como condicion r o kit com d t de cheg d deste no l bor tó rio g r nte o controle do mesmo. Antes de se us r um kit novo deve-se coloc r d t de bertur do mesmo e test -lo com lgum s mostr s de v lores conhecidos e se est belecer um curv dose-efeito fim de se observ r se não há diferenç s signific tiv s entre o kit ntes us do e o novo. Deve-se t mbém observ r qu l id de d águ re gente, o Comite Intern cion l de P drões p r L bor tórios Clín icos cl ssific águ em três tipos, s ber I, II e III. A águ tipo III é us d p r l v gem de vidr ri e rins gem primári , do tipo II é us d p r pre p rções de cor ntes e re gentes serem estereliz dos e, por fim, águ do tipo I que deve ser us d p r os procedimentos l bor tori is, prep ro de soluções p drão, eletroforese e imunoens ios. A t bel b ixo present s c r cterístic s que c d tipo de águ deve ter. Especific ção Nível máximo Tipo I de 10 Tipo II 1000 Tipo III Não signific tivo

       

       

 

           

 

   

 

   

 

         

 

 

   

     

 

 

 

 

                             

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                 

 

 

     

 

     

 

 

 

 

 

 

       

 

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e antí eno expressa em uni a es ou esferas e látex, muito usa as para a quanti ficação e partículas. Outro tipo e material e referência po em ser os materia is certifica os, são materiais váli os para uma etermina a técnica e são acompa nha os a ocumentação apropria a quanto a seu uso.

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INTERFERÊNCIAS NOS IMUNOENSAIOS A exati ão e um imunoensaio po e ser comprometi a por uma varie a e e substâncias interferentes. Esta interferência po e ser p ositiva ou ne ativa e po e variar em ma nitu e epen en o a concentração a sub stância interferente presente na amostra. Estas fontes e interferência po em se r evi o a reação cruza a, anticorpos en ó enos, antí enos mascara os, interferê ncia com os mecanismos in ica ores (como inibi ores enzimáticos nos imunoensaios que usam enzimas) e ao efeito matriz. muito ifí nem sempre a, e este oportuni a e um ensai

Detectan o interferências urante a avaliação e um ensaio Várias análises e ro tinas executa as urante a avaliação e um ensaio permitem a etecção e interfe rências, a estraté ia é i entificar amostras com prováveis interferências presen tes e então caracteriza-las ou no mínimo eterminar em que con ições se suspeita que a interferência aparece. Em estu os e comparação (se utilizan o e ois mé to os e análise), amostras apresentan o resulta os inespera os, são aquelas pos síveis e ter um interferente. A fim e aumentar as chances e etectar estas am ostras, eve-se incluir amostras e pacientes com oenças e fí a o e baço e e pacientes com anticorpos interferentes como o Fator Reumatói e, Anticorpos Anti Nucleares e Anticorpos para Ratos. Após i entificar resulta os fora os limites para estu os futuros e remover estes pontos as análises estatísticas, um coefic iente e baixa correlação po e in icar a interferência que está contribuin o par a a ispersão. A fim e i entificar as possíveis interferências presentes, as am ostras po em ser coloca as em ois rupos, aqueles com o sinal mais positivo e a queles com o sinal mais ne ativo. É importante ter em mente que a interferência está sen o feita em um méto o por comparação; se a interferência afeta os ois m éto os e forma equivalente ela não po e ser etecta a pelo estu o comparativo. Em estu os e lineari a e, eralmente cita os como testes e paralelismo como no caso os imunoensaios, a não lineari a e sobre a iluição normalmente in ica a presença e al um tipo e interferência, este efeito é iminuí o pela iluição. Geralmente uma ou mais amostras com uma alta concentração e analito é iluí a c om o solvente recomen a o ou uma amostra com baixa concentração o analito. Em s uma estas amostras i entifica as pelo méto o a comparação como possivelmente te n o interferentes evem ser retesta as após a iluição. É bom ressaltar que se a não lineari a e reflete a presença e substâncias interferentes, a lineari a e não exclui a presença estes. 98

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Detectan o as interferências A etecção e uma interferência po e ser cil, pois esta po e promover a os sem a evi a exati ão. No entanto, nos sabemos a real concentração o analito em uma amostra esconheci mo o não temos base para jul ar a exati ão e um resulta o. A melhor e para etectar e caracterizar interferências é urante a avaliação o.

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Em estu os e recuperação, uma etermina a quanti a e o analito puro é aplica a em uma pequena quanti a e a amostra com alta concentração o analito, e esta a mostra é analisa a a fim e saber se é possível recuperar em resulta o, a quanti a e a mais o analito a iciona a (aumento e concentração). Resulta os iferent es aqueles que apresentam 100% e recuperação po em in icar a atribuição incorr eta os valores o calibra or ou a presença e uma substância interferente. Assi m como nos estu os e lineari a e, os estu os e recuperação evem ser realiza o s com amostras i entifica as no méto o e comparação e, se possível conten o al uma substância interferente. É claro que os interferentes mais comuns como lipem ia, ictericia e hemólise, também evem ser incluí os no estu o. Al umas vezes os efeitos estes possíveis interferentes po em ser observa os quan o se faz o est u o por comparação e méto os. Se estas amostras forem fora os limites é possív el e que não haja interferência ou que ambos ensaios apresentem o mesmo rau e interferência. Sempre que espécimes com substâncias interferentes são i entific a os, evemos obter a os laboratoriais e informações clínicas o paciente, espe cialmente em oenças a u as e crônicas e quan o se está fazen o uso e me icamen tos. Esta informação oferece in ícios para a provável causa e interferência alé m o que amostras e outros pacientes com os mesmos in ícios po em ser obti as p ara estu os comparativos e assim aju ar a i entificar a substância interferente. Mu anças no rau e interferência numa série e amostras o mesmo paciente po e m ser compara as com o curso clínico o paciente e com a osa em o me icamento, o que fornece in ícios para a causa a interferência. Finalmente, a tentativa e separar o analito a substância interferente ou e separar formas hetero êneas o analito po em ser realiza as por vários méto os e extração, cromato rafia o u eletroforese.

Detectan o inteferências urante a rotina Durante uma rotina não se tem i éia e que substância está causan o a inexati ão os resulta os. Normalmente a única i n icação que se tem é que os resulta os não estão e acor o com os a os clínico s o paciente. É importante lembrar que a substância interferente po e provocar resulta os falsamente normais enquanto que o resulta o real po e ser mais alto o u mais baixo. A avaliação inicial as interferências po e i entificar al umas co n ições clínicas ou certas terapias com ro as nas quais a interferência é comum . Este tipo e resulta o eve ser examina o com mais cui a o. Al umas vezes méto os automatiza os fornecem resulta os e leitura zero, a qual, se for atípica, p o e ser evi o a presença e um interferente. Em ensaios que fornecem uma alta f reqüência e resulta os anômalos, se faz necessário testar as causas e interfer ência prováveis, como testar a li ação não específica e proce er uas iluições as amostras. 99

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REAÇÕES CRUZADAS E ANALITOS HETEROGÊNEOS Um bom imunoensaio epen e e sua sensi bili a e e especifici a e a li ação antí enoanticorpo. Em al uns casos esta esp ecifici a e é comprometi a porque moléculas com epítopos i ênticos ou semelhante s conse uem se li ar ao rea ente e captura, promoven o o que chamamos e reação cruza a. Os problemas e as soluções para as interferências associa as as múltip las formas o analito (formas isoméricas e parcialmente e ra a as), são semelha ntes à aquelas causa as pela reação cruza a. Fontes e Reação Cruza a As fontes e reação cruza a são tantas que não nos é po ssível escrever to as, por isso serão cita as apenas al umas as principais. Re ação cruza a com analitos ran es Para ran es analitos como proteínas a reação cruza a se eve principalmente a presença e múltiplas proteínas com estrutura s emelhante ou a proteínas hetero êneas, um exemplo isso está nos hormônios lico protéicos como o hCG, LH e FSH, evi o a sua subuni a e α comum em todos. Atu lm ente est s re ções cruz d s pr tic mente for m elimin d s devido o desenvolvime nto de ntissoros p r subunid de β. Atualmente tam ém já se conhecem múltiplo s variantes destes hormônios protéicos como no caso do hCG, onde se sa e que exi stem formas livres das su unidades β, variantes do car ohidrato e varias formas parcialmente de radadas, tam ém já se conhecem os precursores destes hormônios q ue estão presentes no soro e as variantes enéticas que podem vir a estar presen tes. Por causa disto, al uns epítopos podem não estar presentes e isto pode alte rar o resultado do exame. Exemplo disto esta no LH, que se tiver formas enética s diferentes no soro, em al uns ensaios ele não é detectado. A hetero eneidade d e uma proteína e as variações de sua relativa distri uição em diferentes formas em amostras diferentes do mesmo paciente e em diferentes pacientes em datas dife rentes, podem causar diferenças si nificativas na exatidão dos resultados. Este pro lema pode ser ainda maior se o analito usado nos cali radores não for o mesm o presente no soro dos pacientes. Quando isto acontece, a amostra não pode ser d iluída em paralelo com os cali radores, pois isto leva ao erro através do limite analítico. Um exemplo disto está ao se dosar as cadeias leves de imuno lo ulina s monoclonais (proteína de Bence Jones) em uma urina, como existem diferentes ca li radores, com diferentes afinidades para um tipo de cadeia leve, se a imuno lo ulina da urina não for a mesma, podemos ter dosa ens acima ou a aixo do esperad o. Reação cruzada com analitos pequenos Os analitos pequenos podem ser hormônios não protéicos, vitaminas e dro as como exemplo citamos al uns hormônios esteroí dais que apresentam uma estrutura muito semelhante e possuem múltiplos meta ólit os com estrutura semelhante. Isto aca a se refletindo nos ensaio de dosa em de 100

 

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esteroídes na urina, devido a presença destes meta ólitos. Por exemplo, a Ciclos porina A possui uma quantidade enorme de meta ólitos, que mesmo que se use um en saio com anticorpos monoclonais para capturar a Ciclosporina, al uns destes meta ólitos podem interferir com o ensaio. Outro exemplo está na dosa em do Feno ar ital, se na amostra tiver tam ém o Pento ar ital, este pode interferir com a exa tidão do resultado dando valores mais altos. Outro exemplo, está quando dosamos anfetaminas, se o paciente estiver tomando medicamento como clopromazina, ou ado çantes com ciclamato, os meta ólitos destes podem interferir com o resultado, da ndo um valor maior do que o existente. Reações cruzadas com moléculas em estádos patoló icos Em casos como doenças renais ou hepáticas, a concentração de molécu las que podem rea ir cruzadamente em um ensaio pode estar aumentada, isto porque estas eralmente são meta ólitos do analito e tam ém porque o fí ado e o rim te m participação na produção e excreção destes analitos. Nós o servamos maior inte rferência na dosa em de dro as quando temos doenças que afetam o fí ado e o rim. Interferências positivas nos ensaios para Teofilina e Fenitoina ocorrem em paci entes com falha renal. Nos ensaios para di oxina se o serva a interferência do F ator Imunorreativo Parecido com di oxina que aparece em pacientes com doença ren al, hepática, mulheres rávidas ou neonatos. No caso de antí enos licoprotéicos as mudanças na doença se devem eralmente a pequenas divisões no car ohidrato. Por exemplo a concentração do Antí eno Carcioem rio ênico (CEA) pode aumentar de vido ao câncer coloretal ou doença do fí ado e as diferenças na divisão do car o hidrato são diferentes nos dois casos. Al umas vezes mudanças relacionadas a div isão dos car ohidratos de licoproteínas podem ser usadas para o dia nóstico dif erencial como acontece quando se usa a transferrina deficiente de car ohidrato p ara o dia nóstico de alcoolismo ou, como no caso em que a Concavalina A específi ca prostática é utilizada para o dia nóstico diferencial entre o câncer prostáti co e o da hiperplasia prostática eni na. Reação cruzada com anticorpos monoclon ais Nem sempre os anticorpos monoclonais conse uem ser totalmente específicos, p ois moléculas que apresentam epítopos com alto rau de homolo ia ao epítopo do a nalito, conse uem competir com o analito e assim falsear os resultados esperados . Exemplo disso ocorre nos “kits” que utilizam anticorpos monoclonais para a cap tura da ciclosporina onde meta ólitos desta podem rea ir com os anticorpos de ca ptura. REDUZINDO AS REAÇÕES CRUZADAS A exatidão de um imunoensaio depende da eliminação ou da redução da reação cruzada de compostos presentes na amostra a ser analisa da. O uso de anticorpos monoclonais já ajuda a reduzir astante esta reação cruz ada, no entanto, em al uns casos isto não elimina de vez o pro lema. Al umas vez es temos de lançar mão de imunoensaios com dois sítios de captura, pois como est es ensaios capturam dois epítopos diferentes, isto ajuda a reduzir a reação cruz ada. Infelizmente os 101

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Bloque ndo re ção cruz d A re ção cruz d t mbém pode ser bloque d nos ens i os onde se desej dos r nticorpos específicos p r determin do ntígeno de pelo menos du s form s. Num como form de sep r r os nticorpos pouco específicos, se dicion o soro substânci s c p zes de re gir cruz d mente. Isto se b sei n propried de de que nticorpos pouco específicos se lig m melhor s substânci s que re gem cruz d mente do que o ntígeno específico. Exemplo disto está n re ção de FTA-ABS onde nós f zemos dsorção do soro se dos r nticorpos p r o T. p llidum, neste c so se dicion o soro treponem s s prófit s como form de bloque r os nticorpos inespecíficos. T mbém podemos bloque r um re ção cruz d se dicion ndo nticorpos específicos p r o gente que re ge cruz d mente e ssim f zer com que este gente não interfir n re ção. Exemplo disto está n d ição de nticorpos p r cortizon no soro do p ciente onde se v i f zer dos gem do cortizol.

 

ensaios com dois sítios de captura existem apenas para moléculas que sejam rand es o suficiente para que se possa haver o reconhecimento de dois epítopos difere ntes. Separação de li antes antes de efetuar o imunoensaio Outra forma de se evi tar as reações cruzadas é se efetuando a separação de li antes inespecíficos ant es de se proceder a reação. Para tal devemos conhecer as propriedades fisicoquím icas da molécula que possa causar a reação cruzada, tam ém diferenças de tamanho , car a, solu ilidade e li ação protéica é que irão determinar a forma de se pro ceder a separação. Esta separação pode ser al o simples de ser feito como a extr ação or ânica feita para o cortizol presente na urina ou al o mais sofisticado c omo o uso da cromato rafia liquida de alta performance (HPLC) para separar a di oxi enina de seus meta ólitos. Tam ém pode-se fazer uso da filtração em el ou u ltrafiltração, como pode ser feito na separação de hormônios licoprotéicos como o hCG, LH e FSH das su unidades α livres dos mesmos. Outro exemplo está n modi fic ção químic que se pode f zer com s substânci s que poderi m interferir com re ção. Exemplo disto está n destruição do pentob rbit l com N OH p r que e ste não interfir com dos gem do fenob rbit l. As vezes o problem de um re ç ão está t mbém no controle d temper tur , se um re ção for incub d por pouco tempo, isto pode f zer com que prob bilid de de contecer re ções cruz d s sej m ior, exemplo disto ocorre nos ens ios p r esteroídes. Além do tempo de incu b ção é t mbém import nte ter cuid do com temper tur fim de reduzir possi bilid de de ocorrer re ções cruz d s. Além disso, const nte de equilíbrio d r e ção v ri de cordo com temper tur e s vezes substânci que re ge cruz d mente tinge o equilíbrio num temper tur diferente d quel em que o n lito tinge.

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A N turez dos Hetero nticorpos É import nte se conhecer os tipos de hetero ntic orpos como form de tent r evit r interferênci que eles podem produzir. Anticorpos Poliespecíficos Estes são nticorpos c p zes de re gir com um v ried de de ntígenos que presentem estrutur químic , form ou c rg semelh nte. Ge r lmente é difícil de est belecer qu ndo estes nticorpos estão interferindo n re ção. Em ger l os nticorpos poliespecíficos são nticorpos que present m fi nid de p r se lig r componentes celul res semelh ntes como membr n celul r o u estrutur s nucle res. Este tipo de nticorpo é muito observ do no lupus eritem toso sistêmico, onde temos produção de nticorpos poliespecíficos p r DNA. T mbém temos presenç de nticorpos poliespecíficos n tuberculose onde estes p odem se lig r o DNA de fit simples ou dupl , polinucleotídeos e c rdiolipin . No c so dos nticorpos do F tor Reum toíde que ger lmente são d cl sse IgM este s podem se combin r com DNA dupl fit , tireoglobulin , insulin , toxoíde tetâni co e lipopoliss c rídeo. N s infecções por M. lepr e observ -se produção de n ticorpos polire tivos p r mitocondri , DNA dupl fit , proteín s do citoesquele to e cetilcolin . 103

 

ANTICORPOS HETERÓFILOS E ANTICORPOS PARA ANIMAIS Anticorpos heterófilos são nti corpos c p zes de re gir com um gr nde qu ntid de de ntígenos. Historic mente eles for m definidos como nticorpos d cl sse IgM que p recem n mononucleose infeccios e que se lig m hemáci s de c rneiro. Estes nticorpos podem ser rem ovidos pel dsorção com hemáci s de boi m s não com célul s do rim de porco d Índi . Aproxim d mente 90% dos dolescentes e dultos jovens present m nticorp os heterófilos. Atu lmente todos nticorpos c p zes de interferir com os imunoen s ios são ch m dos de nticorpos heterófilos, ou nticorpos heterofílicos ou in d de hetero nticorpos. Os hetero nticorpos englob m nticorpos idiotípicos, F t or Reum tóide e nticorpos multiespecíficos. O mec nismo de interferênci dos he tero nticorpos é o mesmo mec nismo de interferênci que ocorre com nticorpos p r nim is. Estes nticorpos p r proteín nim is podem surgir como respost o tr t mento feito com soroter pi prévi , como plic ção de soro nti-ofídico, pois este soro é produzido em c v los, ou em pesso s que lid m muito com nim i s como os tr t dores. Deve-se de preferênci ter idéi de que nticorpo interfer ente está presente n mostr fim de se proceder dsorção do mesmo. É bem ve rd de que os nticorpos produzidos em lgum doenç s são difíceis de serem ident ific dos e removidos e por isso podem interferir com os ens ios de dois sítios d e c ptur , ens ios de nefelometri e turbidimetri .

 

   

   

 

       

 

 

 

 

     

 

 

   

 

   

     

 

 

   

 

     

       

   

 

 

 

 

 

       

     

       

         

 

 

           

 

 

 

     

 

 

 

 

     

 

   

 

 

       

 

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

           

   

 

 

 

 

     

   

 

 

     

               

 

   

 

 

       

 

 

 

 

         

           

           

       

                     

 

 

 

       

 

       

 

 

   

 

   

       

Ens ios de dois sítios de c ptur A interferênci m is comum que ocorre neste ti po de ens io é que o nticorpo heterófilo ou p r proteín nim l se lig o nt icorpo de detecção, e o se f zer dição do nticorpo de detecção este c b s endo lig do pelo nticorpo interferente t mbém. Isto é que c b lev ndo resul t dos f ls mente elev dos. Est lig ção do nticorpo interferente pode ocorrer p el inter ção d porção F b 104

 

Mec nismo de Interferênci dos hetero nticorpos e nticorpos p r proteín nim is Os hetero nticorpos podem c us r interferênci pelos três mec nismos descrito s b ixo e os nticorpos p r proteín s nim is podem promover interferênci p elos dois primeiros: i. Agreg ção de imunoglobulin s. Nos ens ios de dois sítios de c ptur o nticorpo interferente f z um lig ção cruz d (um ponte) entre o nticorpo de c ptur e o de detecção n usênci do n lito. Nos ens ios que us m dispersão de luz, o nticorpo interferente c b ument ndo o t m nho do im unocomplexo precipit nte. Este tipo de interferênci c b por elev r o result d o d concentr ção de n lito. ii. Bloque ndo o sítio de lig ção. Este ger lmente ocorre com os ens ios do tipo competitivo, lev ndo result dos f ls mente elev d os do n lito. Os ens ios de dois sítios de c ptur podem t mbém ser bloque dos. Se não houver um excesso do nticorpo de c ptur , isto pode lev r result dos f ls mente b ixos ou neg tivos. iii. Lig ção poliespecífic o ntígeno de c ptu r . Neste c so isto pode ocorrer em ens ios us dos p r se dos r os níveis de n ticorpos endógenos, e pode lev r result dos com v lores inferiores ou superior es o esper do.

 

O F tor Reum tóide O F tor Reum toíde é n verd de um grupo de uto nticorpos qu e se lig m múltiplos determin ntes ntigênicos n porção Fc d IgG. Se supõe q ue os F tores Reum toídes poss m ser ger dos como nticorpos nti idiotipos. Ass im como outros nticorpos os nticorpos p r f tor reum toíde present m diferen tes subcl sses que podem ser poliespecíficos, se lig r DNA dupl fit , tireogl obulin , insulin , toxoíde tetânico, lipopolis c rideo e DNA em form de histon

 

Est poliespecificid de dos nticorpos p rece ser porque os nticorpos são produ zidos p r reconhecer um sítio de lig ção m ior do que o necessário p r se lig r um simples epítopo e, por isso c b m se lig ndo outros lig ntes. A produç ão destes nticorpos heterófilos t mbém pode ser explic d pel form como reg ião v riável dos nticorpos é mont d , se record rmos mont gem d molécul de nticorpo, veremos que et p fin l dest envolve o re r njo cromossom l e tr nsloc ção de genes, onde os introns são excluídos com isso, temos produção de diferentes tipos de nticorpos.

 

 

 

 

             

           

   

 

         

       

     

 

 

                                                                                 

 

   

               

   

 

     

 

   

   

   

           

 

 

 

         

   

 

 

     

   

 

       

 

   

                                   

 

   

   

 

   

   

 

   

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

     

 

   

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       

   

 

   

       

       

   

 

 

 

 

   

     

           

     

   

 

   

do nticorpo interferente com F b do nticorpo de c ptur e/ou detecção, ou po de ocorrer pel inter ção d porção F b-Fc. Por exemplo, o F tor Reum tóide c us inter ção F b-Fc, e nticorpos p r idiotipo c us m inter ção F b-F b. É b om lembr r que est inter ção pode ocorrer mesmo sem presenç do n lito. Ens ios competitivos Os ens ios competitivos de f se sólid podem sofrer interfe rênci dos nticorpos heterófilos ou p r proteín s nim is devido o bloqueio q ue ocorre o sítio de c ptur do nticorpo. Já foi observ do que ens ios deste t ipo são menos fet dos que os ens ios de dois sítios de c ptur devido lt f inid de que os ntígenos m rc dos e não m rc dos possuem p r lig ção o sítio d e lig ção. Norm lmente gr ndes qu ntid des de nticorpos interferentes são os qu e c us m problem s, isto pode ocorrer se, por exemplo, for us d um gr nde qu n tid de de mostr . Exemplo disto ocorre nos r dioimunoens ios p r α-fetoproteín que us m gr nde qu ntid de de soro e possuem longo período de incub ção, ocorr endo result dos f lso positivos qu ndo o soro possui gr nde qu ntid de de ntico rpos heterófilos. Dependendo do tipo de nticorpo p r proteín nim l presente interferênci pode ser ind m ior do que que ocorre com nticorpos heterófi los. T mbém já foi descrit interferênci neg tiv nos ens ios de c ptur de f se líquid . Nos ens ios competitivos em que se us dois nticorpos t mbém pode ocorrer interferênci neg tiv , já que há form ção de imunocomplexos do nti corpo interferente com os dois nticorpos do imunoens io. Ens ios de dispersão de luz Qu se não há rel tos de interferênci neste tipo por dois princip is motivos, primeiro neste tipo de ens io form s poliméric s do n tígeno ger lmente promovem v ri ções mínim s, segundo, s técnic s de dispersão de luz tem sido us d s p r nálise de substânci s presentes em gr ndes qu nti d des (medid s em miligr m s), o que difere dos ens ios competitivos que medem q u ntid des pequen s. No ent nto em soros com ltos níveis do F tor Reum tóide (F R) pode ocorrer interferênci , em ger l est se deve form ção do complexo Ig M-FR com o nticorpo de detecção do ens io. T mbém o soro contendo lt s concent r ções de IgG e IgM-FR, o suficiente p r form r imunocomplexos circul ntes, e c rioglobulin s, podem interferir nos ens ios de dispersão de luz. Os imunocomplex os circul ntes podem ser precipit dos com dição de Polietilenoglicol (PEG) e ssim f cilit inter ção ntígeno nticorpo.

 

 

 

 

     

               

             

 

 

 

     

Ens ios us ndo o tos ens ios como A), e nticorpos rpos específicos 105

ntigeno fix do f se sólid p r detecção de nticorpos Mui queles us dos p r detecção de nticorpos nti-nucle res (AN nti tiroide nos, us m ntígenos p r f zer c ptur de ntico em conjunto

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

                     

           

 

       

 

 

 

   

   

     

   

   

     

 

 

                         

 

     

       

 

       

 

   

 

 

 

   

 

 

   

 

         

 

         

 

                   

   

                 

   

 

   

       

         

 

 

 

 

 

 

   

   

 

   

       

 

   

     

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

         

 

 

         

 

 

 

 

       

                 

RECONHECENDO ENDÓGENOS E REDUZINDO A INTERFERÊNCIA DOS ANTICORPOS É necessário s ber o tipo de ens io que est mos us ndo p r tent r reduzir est interferênci , se é um ens io onde se desej detect r o ntígeno, ch m do de ens ios p r ntígenos, ou se é um ens io p r detecção de nticorpos, ch m do de e ns io p r nticorpos.

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Detect ndo presenç de Anticorpos Heterófilos e Anticorpos p r Proteín s Anim is A presenç deste tipo de nticorpo em um p ciente pode reduzir eficáci de um imunoter pi e t mbém lev r os imunoens ios express rem result dos f lso positivos ou neg tivos. Existem ens ios p r detecção deste tipo de nticorpo como o ELISA, em que nticorpos monoclon is ou policlon is de r tos são us dos p r c ptur r e detect r estes no soro suspeito. Estes nticorpos t mbém podem se r detect dos se us ndo crom togr fi líquid de lt perform nce ou outr s téc nic s de detecção de imunocomplexos como um mistur com nticorpos de r to com o soro suspeito de conter nticorpos heterófilos e/ou nticorpos p r proteín nim l.

 

 

 

Interferênci Provoc d Por Anticorpos Endógenos Técnic s p r identific ção de um soro suspeito Como os ens ios competitivos são menos sujeitos re ções cruz d s, é interess nte se proceder comp r ção de um ens io com este princípio com um ens io de dois sítios de c ptur . Se o ens io de dos sítios present r um v lor elev do em rel ção o método competitivo, é porque está ocorrendo interfer ênci . Alguns p cientes podem present r interferênci por nticorpos heterófilo s com m ior freqüênci que outros, isto contece com p cientes com doenç s gud s e crônic s como infecções por micob ctéri s, endoc rdite b cteri n , doenç u toimune, infecções por Klebsiell , etc. Estes p cientes present n níveis elev d os de FR e ANA.

 

com nticorpos p r imunoglobulin hum n p r detecção do nticorpo específic o. Anticorpos poliespecíficos podem interferir nestes ens ios por competir com nticorpos específicos p r lig ção o ntígeno fix do, ou se lig r proteín s vizinh s o ntígeno. Est lig ção proteín s vizinh s o ntígeno ocorre qu n do o “kit” us célul s ou fr ções celul res n f se sólid p r c ptur do nt ígeno, isto porque os nticorpos poliespecíficos possuem finid de p r componen tes semelh ntes estrutur de membr n e constituintes celul res. Estes nticor pos poliespecíficos podem p recer em qu ntid des v riáveis junto com os nticor pos específicos que desej mos medir. Como o nticorpo de detecção m rc do não co nsegue diferenci r entre o nticorpo específico (o que desej mos encontr r) e o poliespecífico, isto pode lev r result dos f lso positivos.

       

         

   

 

 

                                                                                                                                                                     

   

 

 

                                             

     

   

   

 

 

 

 

 

         

   

 

 

   

 

 

                           

 

   

 

 

   

 

 

           

       

 

 

 

                           

           

 

     

   

 

 

 

 

 

   

 

No ent nto isto nem sempre elimin interferênci , pois nticorpos IgM-FR, por possuírem diferentes idiotipos podem ind continu r interferindo n re ção. Neu tr liz ção de nticorpos em ens ios p r ntígenos Em ens ios onde o result do p ositivo pode ser problemático p r o p ciente, como queles p r detecção do v írus d hep tite B e C ou do HIV, f z-se necessári incluir um et p de neutr l iz ção de nticorpos ssim como um mec nismo de redução de interferênci s. Isto pode ser feito d seguinte form , depois que se re liz o ens io com o soro do p ciente, e este presentou o result do positivo, se peg um pequen liquot do soro do p ciente e procede-se o tr t mento deste com dição do nticorpo exóg eno p r o ntígeno. Por exemplo, se o teste é p r c ptur do ntígeno s do vír us d hep tite B (HBsAg), se dicion nticorpo p r este ntígeno no soro do p ciente. Deste modo os ntígenos do soro do p ciente serão neutr liz dos, posteri ormente se repete um novo teste com o soro tr t do, deste modo o ntígeno não se lig rá n f se sólid , m s se tivermos nticorpos interferentes (como o FR) ele s se lig rão n f se sólid e promoverão o result do f lso positivo. É import nt e ress lt r que os nticorpos de neutr liz ção us dos devem ser de hum nos ou ch imp nzé, pois os nticorpos heterófilos hum nos não se lig m estes nticorpos. T mbém qu ndo se tr t d pesquis de ntígenos vir is, deve-se us r um lt c oncentr ção de nticorpos de neutr liz ção p r os subtipos vir is. Reduzindo Interferênci em Ens ios de Dois Sítios Neste c so temos o tr t mento imunológic o ou não imunológico como form de reduzir interferênci . No método imunológic o, l nç mos mão de imunoglobulin s não re gentes p r c ptur r os nticorpos int erferentes, no ent nto nem sempre est técnic g r nte redução d interferênci , s vezes se f z necessário o uso de um mistur de imunoglobulin s não re gen tes de diferentes espécies como form de promover lig ção dos nticorpos inter ferentes est s. Outr s técnic s imunológic s de reduzir interferênci inclue m: i. Uso de fr gmentos F b p r promover c ptur do nticorpo interferente. i i. C ptur com nticorpos produzidos em du s espécies diferentes. iii. Uso combi n do d β- alactosidase conju ada com F(a )2 e I G policolonal ou I G monoclonal polimerizada das mesmas espécies usadas para produzir os anticorpos usados nos ensaios. iv. Uso de anticorpos de alinha, que parecem não rea ir com o FR human o. Quanto as técnicas não imunoló icas, estas requerem uma etapa de pré-tratamen to, como exemplo, temos o tratamento com PEG (130 /L de soro), o qual precipita todas as imuno lo ulinas endó enas e de todos anticorpos idiotípicos. Tam ém tem os o tratamento por aquecimento do soro a 90oC, usado como forma de eliminar a a tividade anomala dos anticorpos por desnaturação. Ou ainda há o tratamento com a entes sulfidrílicos como o Mercaptaetanol ou Ditiotreitol, que que ra as pontes dissulfeto e inativa os anticorpos interferentes. Há tam ém o pré tratamento co m deter entes como 107

 

       

 

 

 

 

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forma de inativar os anticorpos. Infelizmente, o tratamento químico não pode ser aplicado para todos os ensaios, pois dependendo do analito este tam ém pode ter sua estrutura alterada, e assim levar a resultados falso ne ativos. Forma de re duzir a interferência em ensaios para anticorpos específicos Neste caso a recome ndação é que se proceda o uso de ensaios com antí enos de captura altamente puro s como forma de evitar a li ação não específica. Atualmente isto é possível devi do as técnicas de DNA recom inante, que permitem desenvolver antí enos recom ina ntes puros e apenas com o epítopo desejado. Reduzindo a interferência em ensaios de Nefelometria e de Competição As técnicas para redução de interferência deste s ensaios são semelhantes as aplicadas para os ensaios de dois sítios de captura , ou seja qualquer uma das técnicas imunoló icas ou não imunoló icas pode ser ap licada. Ressalta-se apenas que nos ensaios de nefelometria o tratamento com PEG pode ser feito usando 40 /L deste no soro para que a concentração de I M seja re duzida. INTERFERÊNCIAS DEVIDO A ANTÍGENOS QUE MASCARAM A REAÇÃO Neste caso a interferênc ia ocorre como resultado de rupos anti ênicos que são escondidos ou alterados p or su stâncias associadas a esta. Exemplo disto encontramos na dosa em da Apolip oproteína A-I (apo A-I) em lipoproteínas. Foi demonstrado que a atividade da apo A-I pode ser aumentada em até 60% fazendo o tratamento com deter entes, pois ao que parece os lipídios que a se uravam são destruídos com este tratamento. Este tipo de interferência tam ém é o servado quando se mede antí enos em soro com i munocomplexos, como no caso do está io inicial da infecção pelo HIV onde o HIV e stá complexado com anticorpos para ele e assim tornando-se quase impossível de s e ter uma concentração real da quantidade de vírus presente. Isto acontece princ ipalmente em crianças recém nascidas, filhas de mãe soropositivas. A forma de se fazer a detecção seria promovendo a dissociação dos imunocomplexos. No entanto para se resolver o pro lema dos antí enos escondidos é extremamente difícil, em al uns caso como nas apolipoproteínas, os antí enos escondidos podem ser de vári os tipos, com isoformas múltiplas que podem estar escondidas pelos lipídios e o tratamento com solventes pode reduzir a interferência assim como pode causar a d esnaturação do analito. Por isso as vezes é importante fazer o mesmo tratamento feito com o soro no cali rador do imunoensaio, como forma de verificar se não es tá ocorrendo prejuízo ao teste. INTERFERÊNCIAS COM O MECANISMO INDICADOR Al umas amostras podem conter su stânci as que interfiram com o indicador da reação aumentando ou diminuindo a leitura. Exemplo disto está em pacientes que estão fazendo tratamento 108

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com radioterápicos e tem o soro analisado com Radio Imuno Ensaio (RIE), estes se mpre darão um resultado acima do esperado. Em ensaios imunoenzimáticos, o aument o da atividade enzimática pode levar a resultados falsamente elevados. É possíve l que na amostra haja a presença de ativadores ou ini idores da enzima e assim a lterem o resultado. Como exemplo, temos um meta ólito da aspirina que faz com qu e ocorra uma mudança no espectro de a sorção ultravioleta do NADH, levando a a s or âncias relativamente aixas na análise de dro as. Em ensaios em que a leitura final depende da fluorescência, compostos fluorescentes ou ini idores desta pod em alterar o sinal de leitura. Na quimioluminescência, al umas su stâncias prese ntes nesta podem interferir com a emissão de foton. EFEITOS MATRIZ O efeito matriz é uma interferência causada pela diferença de rea tividade do analito devido ao am iente que amostra apresenta. As reações antí en o anticorpo são eralmente sensíveis a variações na concentração de lipídios, pH e a força iônica. As diferenças na matriz eralmente alteram a eficiência da se paração de frações li adas e não li adas e tam ém a extensão da li ação não espe cífica a su stância reveladora. O efeito matriz eralmente aparece quando deseja mos dosar su stâncias diferentes do soro em um imunoensaio, como por exemplo usa mos o liquor para pesquisa de anticorpos. Como já explicado anteriormente, o efe ito matriz é difícil de ser detectado, e por isso, as vezes requer que se faça a diluição da amostra para proceder um novo ensaio, e que ainda qualquer tratamen to feito com o material a ser analisado seja repetido com o cali rador do “kit” como forma de verificar se este não interfere mais ainda com a precisão de nosso s resultados. 109

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ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO Um ensaio de a lutinação é aseado na propriedade que um antí eno e determinado anticorpo para este, quando li ado a uma partícula inerte (marcador) tem de se li ar entre si e, promover a precipitação do complexo antí eno anticorpo. Em al uns casos estas reações podem ser vistas a olho nu, quando por exemplo usam partículas como hemácias ou partículas sintéticas, outras veze s as reações podem ser vistas com auxílio de instrumentos que fazem a leitura a transmissão de luz, como no caso da quantificação de anticorpos quando o suporte é feito por micropartículas de látex. Foi através da a lutinação com hemácias q ue se desco riu o sistema san uíneo ABO. A presença de um antí eno natural nas c élulas e a alta densidade dos sítios de li ação cruzada levam a formação de uma a lutinação forte, facilmente visualizada a olho nu. Por este motivo foram desen volvidos kits onde se utilizam hemácias sensi ilizadas com antí enos ou anticorp os, estes possuem alta sensi ilidade e são fáceis de serem usados. Além das hemá cias, pode-se utilizar como fase sólida partículas como: lipossomos, microcápsul as, partículas sintéticas, e vários tipos de látex. Estas partículas devem ter u m diâmetro entre 7 e 0,05μm. Princípios a reação e a lutinação O princípio bás ico as reações e a lutinação é a formação e pontes e anticorpo entre as imun o lobulinas I G ou I M e a partícula anti ênica com múltiplos eterminantes. Os anticorpos a classe I M são aproxima amente 100 vezes mais eficientes nas reaçõ es e a lutinação o que a I G, isto evi o a sua característica pentavalente. I sto torna possível que moléculas e anticorpo reajam com mais e um sítio ou rea jam com sítios equivalentes em iferentes partículas e assim pro uzam uma estrut ura com li ações cruza as. As reações e a lutinação, normalmente são usa as na etecção e espécimes iri i os a antí enos específicos li a os a partículas (se nsibiliza os). Na a lutinação in ireta, se utiliza um anticorpo correspon ente l i a o a uma partícula, neste tipo e reação po emos etectar um antí eno solúvel em um espécime. Um hapteno (um antí eno por exemplo) com um simples eterminant e anti ênico (como no caso e al uns hormônios ou ro as), po em não levar a for mação esta ponte que forma o complexo antí eno-anticorpo e, conseqüentemente nã o levam a formação a a lutinação. Quan o uma partícula sensibiliza a com um hap teno é utiliza a como rea ente, a eterminação este hapteno requer o uso o ens aio e inibição a a lutinação. A inibição a a lutinação é um ensaio e competi ção on e a a lutinação a partícula e hapteno com uma certa quanti a e e antic orpo, o qual po e estar livre ou li a o a partículas, é inibi a pelo hapteno pre sente na amostra. Como exemplo, temos al uns testes e ravi ez que fazem a ete rminação in ireta o hCG, on e partículas e látex recobertas com o hCG são post as para rea ir com a urina que contenha o hCG, e junto se a iciona anticorpos pa ra o hCG. Deste mo o, o hCG li a o às partículas irá competir com aquele present e na urina, se não houver a lutinação, si nifica que havia mais hCG na urina e o teste é a o como positivo. 110

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Os ensaios e inibição a a lutinação po em ser mais sensíveis que os testes e a lutinação passiva, embora a preparação os rea entes exija a estreza e um es pecialista treina o no uso as técnicas mais sofistica as. Em termos e sensibil i a e o ensaio, as partículas sintéticas ou o méto o e hema lutinação oferecem ran es vanta ens em relação ao ELISA (Enzyme Lynke Immunosorbent Assay), na etecção e anticorpos, isto porque neste ensaio apenas os anticorpos alvo estão envolvi os na reação imune. Enquanto no ELISA, na concentração e 10 e I G por litro presente no soro, ou al o em torno e 6 or ens e ma nitu e maior que o a nticorpo alvo, interfere na sensibili a e o ensaio pro uzin o o que na lín ua i n lesa se chama e ruí o e fun o ou, melhor izen o, pro uzin o o resulta o uv i oso. A reação e ELISA á melhores resulta os quan o se objetiva a etecção e antí enos. Partículas usa as como fase sóli a Vários tipos e partículas vem se n o usa as como fase sóli a nas reações e a lutinação. O primeiro tipo e a lut inação foi observa o quan o se misturou o soro e um paciente infecta o por uma bactéria e a respectiva. O sistema ABO e tipa em e eritrócitos humanos, escob erto por Lan steiner, po e ser classifica o como uma reação e a lutinação iret a. As provas e a lutinação ireta ain a são utiliza as no ia nóstico microbiol ó ico (salmonelas e brucelas por exemplo), e na tipa em e hemácias. Partículas artificiais como elatina, microcápsulas e peptí eos ou silicatos, po em ser se nsibiliza os com um antí eno ou anticorpo específico para o alvo na a lutinação passiva (in ireta). Em 1983 Ike a e Tomizawa esenvolveram uma partícula e ela tina especial com uma superfície altamente hi rofilíca que, evi o a isso é capa z e evitar a li ação e materiais não específicos presentes na amostra em estu o. Para a sensibilização estas partículas com o antí eno ou anticorpo eseja o, se utiliza formal eí o para a fixação. Hema lutinação Os testes e hema lutinçã o, apesar e serem muito sensíveis não são complica os em sua realização e seque r exi em equipamentos especiais. Devi o a isso muitos países em esenvolvimento a otaram este tipo e teste e suas variações. Atualmente os testes e hema lutin ação são utiliza os na etecção e vírus a hepatite B (HBV), hepatite C (HCV), vírus a imuno eficiência humana (HIV), tireo lobulina, microssomos tiroi eanos, e outros. Também testes e hema lutinação reversa, po em etectar HbsA (antí e no e superfície o vírus a hepatite B), α-fetoproteín , e hemoglobin hum n n s fezes. P r detecção de ntígenos, estes testes present m o limite de dete cção situ ndo entre 30 e 50 ng/ml. Outro exemplo de teste de hem glutin ção surg iu nos nos 80, foi o teste p r detecção de nticorpos do Treponem p llidum, f oi reconhecido mundi lmente por f zer uso de eritrócitos de g linh ou c rneiro, sensibiliz dos com o T. p llidum cultiv do em coelhos. Se comp r do com outros testes p r di gnóstico d sífilis, este oferece m ior sensibilid de e especific id de. No ent nto este teste ind present result dos f lso positivos, em deco rrênci d presenç de uto nticorpos p r 111

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proteín nim l presente no soro ou p r outr s proteín s presentes. Est interf erênci pode ser nul d se tr t ndo o soro com dsorventes contendo o soro do nim l correspondente, restos celul res ou outros componentes. Há poucos nos um novo teste de hem glutin ção em que se f z uso de nticorpos monoclon is de r to s específicos p r o ntígeno de superfície d s hemáci s hum n s, este ens io co nsegue reconhecer estes ntígenos mesmo em hemáci s com estrutur lter d com o s que p recem n nemi f lciforme. Neste ens io f z-se o uso de nticorpos biv lentes, que se lig m o epitopo de superfície e o lvo ser detect do, des te modo não há necessid de de se proceder sep r ção do pl sm d s célul s s ng uíne s. Aglutin ção com p rtícul s de gel tin As p rtícul s de gel tin tem sid o consider d s como s substitut s p r os ens ios de hem glutin ção. As p rtícu l s de gel tin ind oferecem v nt gem de não ocorrer lig ções inespecífic s com o m teri l presente n mostr por su superfície ser lt mente hidrofílic . A p rtícul de gel tin tem proxim d mente 3 μm e iâmetro, e é pro uzi a atr avés a separação e fase e li ação cruza a em um pH ótimo a 40OC. A partícula r esultante é fixa a com formal eí o ou lutaral eí o. Como as partículas e elat ina não são anti ênicas, os testes realiza os com estas são isentos os problema s que aparecem quan o há a presença e anticorpos heterófilos nas amostras. Tamb ém, ao se trabalhar com as partículas e elatina, estas requerem o uso e uma iluição menor o soro na análise, como forma e evitar reação não específica e arantin o assim um ensaio com maior sensibili a e. Outros tipos e partículas su r iram no merca o, como méto o alternativo às partículas e elatina. Uma elas são partículas incolores, que são blocos e partículas copoliméricas compostas e áci o L- lutâmico. Estas partículas po em ser colori as com a cor que se esej a para facilitar a visualização. A a lutinação com partículas e elatina foi in icialmente usa a para a etecção e anticorpos para o HTLV. Este méto o lo o foi a ota o para a etecção o HIV, HBV e HCV já que ele é muito simples e ser rea liza o e não epen e o controle e temperatura preciso para ser executa o. A lu tinação pelo látex A a lutinação pelo látex é usa a para a etecção e vários an alitos, como exemplo, ela vem sen o usa o para a etecção o hCG em testes e r avi ez qualitativos e em méto os semi automatiza os para testes quantitativos, c omo na etecção e al umas proteínas plasmaticas. O teste qualitativo é o proce imento eralmente executa o em lâmina, on e se mistura uma certa quanti a e a a mostra o paciente com outra o látex, a ita-se por 2 a 3 minutos e se executa a leitura a olho nú, al umas vezes, no entanto, po e ser necessário levar a lâmin a ao microscópio para confirmar se houve ou não a lutinação, pois as partículas e látex po em ser muito pequenas. Quanto ao teste quantitativo este po e ser re aliza o por méto os e absorção e luz, como a turbi imetria ou méto os e ispe rsão e luz, como a nefelometria. A a lutinação pelo látex po e ter ran e sensi bili a e, al o entre 30 a 50n /ml quan o se lança mão e méto os semi automatiza os. 112

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Ensaios e Turbi imetria com Látex Os ensaios e turbi imetria me em a quanti a e e luz per i a quan o esta se espalha ao encontrar com a superfície e uma par tícula. O limite e etecção este méto o varia e acor o com o comprimento e l uz utiliza o. A maioria os espectrofotometros utilizam vários comprimentos e o n a como forma e aumentar a sensibili a e, o mesmo mo o também se procurou es envolver partículas que se encaixem na capaci a e e leitura o aparelho, em er al estas partículas tem o tamanho e 0,1μm, e epen en o a aparelha em a sensib ili a e po e che ar até 10n /ml. Deve-se ressaltar que as partículas e látex po em sofrer interferência e fatores esconheci os presentes na amostra o pacien te, e este mo o, vários absorventes evem ser usa os no rea ente e na fase e i ncubação. Imunoensaios e conta em e partículas Este tipo e ensaio tem a vanta em e não requerer que seja feita a separação as partículas li a as as não li a as com o rea ente, no entanto, o Fator Reumatói e presente na amostra, po e v ir a interferir com os resulta os, pois este se li a especificamente a I G e não especificamente a outras proteínas, tu o isso, levan o em eral a resulta os fa lso positivos. O principio estes ensaios é basea o na conta em óptica e partíc ulas, o que permite avaliar a iminuição em número e partículas não a lutina as urante o ensaio. Tanto o ensaio e ín ice (o ín ice que um sinal ecai em núme ro e partículas não a lutina as), ou os ensaios e ponto final, são aplicáveis neste formato. Enquanto o ensaio e ponto final arante a sensibili a e em nano ramas por mililitro, no caso e reações imunoló icas, é necessário um lon o perí o o e incubação. Nos últimos anos, su iram vários tipos e instrumentação e fl uxo contínuo basea os na meto olo ia e conta em e partículas, servin o inclusi ve para a i entificação e al uns marca ores tumorais. Outros tipos e ensaios D os méto os esenvolvi os recentemente, temos a meto olo ia e ispersão e luz “ quasielástica”, que se baseia na me ição as mu anças em resposta a istribuição o tamanho as partículas. Esta técnica faz uso e um feixe e laser para me ir a re ução o coeficiente mé io e ifusão as partículas como o resulta o e um a reação imune. Ensaios basea os na me ição e mu anças a anisotropia an ular a luz ispersa a e acor o com o tamanho mé io a partícula também fazem parte os últimos lançamentos. Neste caso as partículas com iâmetros pareci os com o o comprimento e on a po em promover uma variação an ular a luz ispersa a epe n ente o tamanho a partícula.

ENSAIOS DE DISPERSÃO DE LUZ Uma característica as suspensões coloi ais é que el as tem a proprie a e e ispersar a luz em várias ireções, este fenômeno é cham a o e Efeito Tyn all, nele não há alteração o comprimento e on a a luz inci ente, e ele epen e o tipo e partícula. O efeito re e esta ispersão é que a luz 113

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po e ser observa a em to os os ân ulos relativos a ireção a luz inci ente. O rau esta ispersão é epen ente o tamanho a partícula e o comprimento e on a a luz inci ente. Como exemplo, em soluções or inárias, as partículas o solut o (parte issolvi a) são tão pequenas que a ispersão e luz que ocorre é muito pequena. No entanto, quan o as partículas crescem em tamanho, forman o complexos macromoleulares, a ispersão é mais si nificativa, fazen o com que a solução te nha um aspecto turvo. Também quanto menor o tamanho as partículas em suspensão, mais a luz se ispersa em várias ireções, quanto maiores forem as partículas, a luz começa a se iri ir em uma única ireção e se ispersar menos, este efeito é conheci o como efeito e Dispersão e Raylei h-Debye. A maioria as técnicas e ispersão e luz, fazem uso este efeito, me in o a luz ispersa emiti a em u ma única ireção. O complexo antí eno-anticorpo A li ação e um antí eno com o a nticorpo é um equilíbrio inâmico em que um anticorpo bivalente se li a a um ant í eno monovalente ou multivalente. Quan o o número e sítios e li ação o antic orpo é si nificantemente maior que o número e sítios o antí eno, os sítios o antí eno são rapi amente satura os pelos anticorpos e assim se formam pequenos c omplexos antí eno-anticorpo. No entanto, se tivermos um pequeno excesso e antic orpos, teremos a li ação e mais e um anticorpo ao antí eno multivalente, o que leva a formação e um a re a o os complexos antí eno-anticorpo. Já no momento em que há mais antí eno o que anticorpo, to os os sítios o anticorpo se tornam satura os, com uas moléculas anti ênicas forman o um pequeno complexo não a re a o. A zona e equivalência, é aquela em que há o máximo e li ações entre o an tí eno e o anticorpo, forman o o maior complexo a re a o possível (em mé ia 2 a 3 moléculas e anticorpo se li an o a uma e antí eno). As características a li ação antí eno anticorpo é que servem como base para os ensaios e ispersão e luz. Isto que izer que, se iniciarmos com uma quanti a e e anticorpos em exces so constante, e formos aumentan o aos poucos a concentração e antí enos vai oco rrer o aumento a concentração o complexo antí eno-anticorpo em quanti a e sufi ciente para ar ori em ao efeito e ispersão e Raylei h-Debye. Como estes comp lexos antí eno anticorpo são relativamente constantes em tamanho, a relação entr e a concentração e antí eno e o complexo antí eno-anticorpo e a ispersão e luz, se aproximam a lineari a e. As concentrações anti ênicas próximas ao coefi ciente e equivalência, apresentam pouca ispersão e luz. Esta é uma con ição b em conheci a o excesso e antí eno resultan o na possibili a e e haver uas co ncentrações anti enicas iferentes e antí eno correspon en o ao mesmo valor a ispersão e luz. Este efeito se eve a iminuição o tamanho o complexo imune pois a razão e anti eno para o anticorpo continua a aumentar, iminuin o assim a ispersão total e luz (ver ráfico).

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A cinética as reações e imunoprecipitação também eve ser leva a em conta, apó s a mistura o antí eno com o anticorpo, começa a formação e complexos isperso res e luz sen o que, o pico e formação estes ocorre em 20 se un os aproxima a mente. É claro que após este tempo continua a ocorrer a formação e imunocomplex os, e que o tamanho estes começa a crescer, aparecen o complexos maiores que ac abam influin o na ispersão a luz. Finalmente temos um está io estável, em que não há mais a variação na ispersão e luz, é a fase e equilíbrio a reação. Os ensaios e ispersão e luz fazem uso esta fase e equilíbrio para fazer a me ição. Méto os que fazem uso a taxa e aumento a luz ispersa, são conheci os c omo méto os cinéticos ou proporcionais. As partículas continuam a se a re ar e a umentar e tamanho até o ponto em que elas precipitam e a solução é clarifica a. NEFELOMETRIA O principio esta reação é simples, nele o soro iluí o (antí eno) é mistura o com uma certa concentração conheci a o antisoro, em eral tampona o . Assim a ispersão e luz vai aumentan o aos poucos até atin ir o seu pico máxi mo. O an ulo a ispersão e luz é compara o com os resulta os obti os com pa rõ es e calibra ores o aparelho e forma a po er eterminar a concentração e anal ito presente no soro o paciente. Depen en o o tipo e instrumento usa o, ele p o e fazer a me ição cinética ou o ponto e equilíbrio a reação. Os aparelhos q ue fazem a me ição o equilíbrio a reação, eterminam quan o se atin iu o ponto máximo a ispersão e luz após um etermina o tempo e reação, e a ispersão e luz a amostra é subtraí o o sinal e fun o para se alcançar o sinal final o complexo. É claro que o 115

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soro por si só po e contribuir pela ispersão e luz evi o a seus constituintes como os quilomicrons, lipoproteínas e baixa ensi a e e a presença e imunocom plexos circulantes. A prática comum e se con elar e escon elar o soro no labor atório, a fim e se executar o exame no outro ia, contribui no aumento a ispe rsão e luz. Quan o não há ispersão e luz, isto acaba por limitar a sensibili a e o ponto e equilíbrio a reação, isto po e ocorrer evi o a uma limitação p resente na amostra analisa a. Na maioria os ensaios, uma as forma e evitar es ta interferência é fazen o a iluição o soro a 1:50. Este problema é menor quan o se analisa o liqui o céfalo raqui iano ou urina pois estes contém menos mater ial capaz e ispersar a luz. Nem sempre o pré tratamento o soro como forma e evitar a interferência é útil, uma vez que este aumenta a complexi a e a anális e e a torna mais suscetível a erros. Existem outra fontes e interferência o si nal como a presença e i itais nos tubos e análise, presença e fibras e poeir a na amostra. A nefelometria cinética empre a a me ição o aumento e ispersão e luz após ter se inicia o a reação entre antí eno e anticorpo. Isto elimina a necessi a e e correção o sinal e fun o que ocorre na amostra. A nefelometria cinética monitora a taxa e mu ança a ispersão e luz, a qual aumenta ra ativ amente, até che ar um momento em que aumenta rapi amente até um pico máximo, e epois ecai rapi amente. O pico máximo é o parametro e me ição o aparelho, est e é compara o com uma curva pa rão, já realiza a anteriormente e armazena a no b anco e a os o aparelho. Esta curva pa rão eve ter si o elabora a como o maio r número e amostras possíveis, como forma e aumentar a exati ão o aparelho. C urvas pa rão elabora as com poucos pontos são sempre a fonte e resulta os com p ouca exati ão. Também, eve-se estar atento a presença e bolhas na amostra a se r coloca a para leitura no aparelho, pois estas contribuem para a ispersão a l uz em outras ireções. Um os principais requerimentos e to as as técnicas e i munoprecipitação é querer etectar o excesso e antí eno. Para uma certa quanti a e e anticorpos presentes na mistura a ser osa a, a que a absoluta a ispers ão e luz ou, a taxa e aumento a ispersão e luz, que aumenta conforme a quan ti a e e antí eno presente, até se che ar um pico máximo. A partir este ponto, quanto maior for a quanti a e e antí eno, menor será a quanti a e e luz ispe rsa a. Também é possível que ocorram uas concentrações e antí eno, uma associa a com o excesso e anticorpo e uma associa a com excesso e antí eno, este mo o, ca a uma estas promove a ispersão a luz e uma forma iferente. É possível se esenvolver con ições no ensaio e forma a po er se etectar o excesso e an tí eno para uma proteína ou analito que esteja além os valores encontra os em s oros normais ou patoló icos. No entanto nem sempre é possível se fazer isso, emb ora seja importante se etectar o excesso e antí eno quan o se eseja osar imu no lobulinas. Estas proteínas po em estar presentes em altas concentrações em pa cientes com hiperplasia ou oenças mali nas. O antisoro usa o nas reações e imu noprecipitação evem ser capazes e reconhecer uma varie a e e epítopos present es na amostra, po e-se também usar soros monoclonais, só que eve-se 116

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tomar cui a o quan o se usa ran es quanti a es e anticorpo monoclonal já que e stes po em levar a erros e quantificação. Existem várias técnicas para a etecç ão o excesso e analito em uma amostra, uma elas consiste em se a icionar mais antí eno ou anticorpo na mistura em estu o como forma e promover o aumento a ispersão e luz, quan o há o excesso e anticorpos ou anti enos respectivamente . Outra forma consiste em se preparar uas iluições iferentes a amostra e se proce er a osa em, como forma e comparar os resulta os e se observar se há cor respon ência entre eles. Este tipo e proce imento tem maior aplicabili a e em e nsaios que me em o ponto final (ponto e equilíbrio) e uma reação. Quan o se e seja osar anticorpos presentes numa amostra, a fim e se saber se há excesso e stes, po e-se proce er antes a nefelometria, a eletroforese quantitativa a amo stra como forma e verificar a concentração a imuno lobulina presente no entant o, isto é pouco prático e mais trabalhoso. Quan o comparamos os méto os e me iç ão o ponto e equilíbrio e uma reação com o que me e a cinética a reação, vem os que os méto os que me em o ponto e equilíbrio são mais simples e menos sofis tica os em termos e aparelhos. Os méto os cinéticos são menos sensíveis a inter ferência e fun o que ocorre nos méto os e ponto final, e são mais sensíveis, m as po em ser afeta os por falsas reações antí eno anticorpo por causa e anticor pos monoclonais. Anticorpos policlonais e alta afini a e po em apresentar reaçõ es mais rápi as nos ensaios cinéticos. TURBIDIMETRIA Os ensaios e turbi imetria se uem as mesmas consi erações feitas para a nefelometria, a iferença é que neste tipo e ensaio se me e a absorbânci a a luz e não a luz ispersa a. Para a turbi imetria também temos ensaios e me ição o ponto e equilíbrio e a cinética a reação. Nos ensaios e me ição o ponto e equilíbrio, eve-se me ir primeiro o sinal e fun o a amostra, para en tão subtrai-lo o resulta o final a reação antí eno anticorpo. Já nos ensaios c inético isto não é necessário já que este se baseia na me ição e vários pontos. No entanto a me ição a luz absorvi a oferece limitações, o aparelho eve ser c apaz e me ir mu anças a absorção e luz a or em e 5 uni a es e miliabsorção com precisão, sem que haja a presença e ruí o no sinal (interferência eletrôni ca oriun a a re e elétrica ou e outro aparelho).

APLICAÇÕES DA NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA Qualquer flui o corporal po e ser usa o em ambas as técnicas es e que haja quanti a e suficiente antí eno para ser etecta o. A quanti a e e amostra necessária em ambas as técnicas é pequena, a or em e microlitros. Quan o temos amostras opalescentes, estas po em ser filtra as em um filtro com a porosi a e e 0,22μm ou centrifu a as a alta rotação. Amo stras hemolisa as ou ictéricas po em tornar ifícil o ensaio, mesmo quan o estas são iluí as. 117

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A cinética as reações e precipitação po e ser afeta a pela força e composição iônica, pH e a presença e promotores poliméricos. A presenca e ions e só io, ma nésio e fosfato po em promover a reação e precipitação. Por este motivo o us o e soluções tampão fosfato salina (PBS) na concentração e 0,01 a 0,1 mol/ml c om pH entre 7,4 e 7,9 é recomen a a na iluição a amostra a ser analisa a. Po e -se também fazer a a ição a Azi a só ica na concentração e 0,1% como forma e evitar o crescimento e bactérias e fun os na amostra. Al uns polímeros po em se r usa os na amostra como forma e promover a reação, aceleran o a interação entr e antí eno e anticorpo. Além isso os polímeros po em iminuir a turbi ez as so luções com muito anticorpo e minimizar o sinal e fun o. O Polietileno licol (PE G) é um estes polímeros, po e-se usar o PEG 4000 ou 8000 na concentração e 40 a 60 /L. Al uns tipos e problemas mais comuns nos ensaios e turbi imetria e n efelometria são comuns, assim como a forma e resolve-los, entre estes estacam os: Problema Excesso e ispersão e luz Dispersão e luz insuficiente Solução D iluir mais o anticorpo, iluir mais a amostra. Aumentar a fração e anticorpo, a umentar a quanti a e e amostra. A mu ança a ispersão e luz é pequena Ajustar a taxa a reação antí eno anticorpo, usar polímeros para promover a reação. Rea ção e fun o em excesso Filtrar rea entes e/ou a amostra. Aplicações específicas Este tipo e reação se aplica a osa em e proteínas que tenham importância clinica presente no soro, urina ou liqui o cefaloraqui iano. Estas proteínas eralmente possuem tamanho suficiente para promover a formação e imunocomplexos e também conse uir esviar a luz quan o rea e com anticorpos es pecíficos. Dentre as proteínas que po em ser osa as tanto pela turbi imetria qu anto pela nefelometria temos as se uintes lista as abaixo: α1-Ácido glicoproteíc o α1-Antiquimotripsin α2-Antipl smin α1-Antitripsin α2-M croglobulin α1-Micr oglobulin Albumin Antitrombin III Apolipoproteín A-I Apolipoproteín B 118

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β2-Macro lo ulina Ini idor de C1 C3 C4 Ceruloplasmina Proteína C Reativa Fi rino ênio Fi ronectina Gc- lo ulina Hapto lo ulina Hemopexina I A I E I G I M Cadeia Leve κ Cadeia Leve λ Préa bumina Proteína de igação ao retino Fator reumatóid e Transferrina Anti Estrepto isina O O imite da sensibi idade ana ítica destes métodos para a detecção de proteínas é de aproximadamente 5mg/L. E a precisão ob tida com estes métodos pode chegar a a go entre 1 e 10% do tota do coeficiente de variação, dependendo da proteína que está sendo dosada. É c aro que para se o bter a precisão é necessário que se façam curvas de ca ibração do ensaio para as sim garantir sua precisão e exatidão. FATORES QUE AFETAM A PERFORMANCE DOS ENSAIOS As interferências que mais dão prob emas são aque as que dão o sina de fundo na reação, contribuindo para aumentar a dispersão de uz. Em gera este tipo de interferência se deve a amostra que e stá sendo ana isada ou aos reagentes usados. A fi tragem dos reagentes, associad os a centrifugação a a ta ve ocidade ou a u tracentrifugação da amostra, ajudam a reduzir este sina de fundo. Soros muito ictéricos ou hemo isados podem afetar a absorbância dos método turbidimétricos, esta interferência pode ser minimizad a com a di uição da amostra antes de se processar o ensaio. 119

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TESTE DE PAUL BUNNEL & DAVIDSOHN E MONOTESTE A mononuc eose infecciosa descrita em 1889 por Pfeiffer, também chamada Doença G andu ar, Angina Monocítica, manife sta-se por febre contínua, angina, adenopatia cervica , astenia, suores profusos , esp enomega ia. Hoje, sabe-se, que seu agente etio ógico é um vírus da famí ia Herpesviridae denominado Epstein & Barr. Foi demonstrado por Epstein, Archong & Barr, em 1967, a partir de materia de um paciente com infoma de Bur itt. DIAGNÓSTICO: A presença de anticorpos para o capsídio do vírus pode ser demonstr ada por imunof uorescência indireta em presença de cé u as infob astóides, prod utoras de vírus, na fase aguda da infecção. É, porém um teste comp icado e inace ssíve aos aboratórios de aná ises c ínicas. Devido a este fato, o diagnóstico da mononuc eose infecciosa baseia-se na pesquisa de anticorpos heterófi os. Dois testes são, comumente, usados para este diagnóstico: O MONOTESTE e a reação de PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN. MONOTESTE: No monoteste usam-se hemácias formo adas de cava o. Em uma âmina com um de microscopia, co oca-se uma gota de soro do paciente (não necessita ser ina tivado). Adicionam-se a este soro duas gotas de uma suspensão a 20% de hemácias formo adas de cava o. Agita-se imprimindo um movimento de rotação à âmina. Dent ro de dois a três minutos ocorre hemag utinação. O teste pode, também ser feito em âmina escavada. Ausência de hemag utinação não exc ui o diagnóstico para mon onuc eose. 120

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A qua idade do anticorpo usado no ensaio é crucia para o desempenho destas técn icas, pois como as proteínas presentes no soro podem apresentar várias formas, o reagente usado deve ser capaz de reagir com estas várias formas. Isto é especia mente úti em proteínas como a haptog obina, cujas isoformas variam muito em te rmos de peso mo ecu ar. Os métodos nefe ométricos e turbidimétricos, no entanto, são menos afetados pe as variações do tamanho mo ecu ar do que são os método de imunodifusão radia . Preparações de anticorpo que apresentam variações na igaç ão devido a presença de componentes monoc onais, devem ser evitadas sempre que p ossíve . A concentração de proteína monoc ona pode ser estimada independentemen te por métodos e etroforéticos. Qua quer variação no reconhecimento do anticorpo de uma preparação pode ser ava iado procedendo-se um teste de para e ismo atrav és do imite do excesso de anticorpo em concentrações antigênicas. Isto é, a di uição de uma série de amostras de um soro deve mostrar uma série inear de resu tados. Na verdade, este tipo de verificação pode ser estendido a todos os tipos de ensaios.

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REAÇÃO DE PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN: Esta prova é baseada na capacidade que tem o soro do doente de ag utinar hemácias de carneiro a uma di uição de 1:56 ou supe rior. Entretanto, mesmo se ocorrer a ag utinação das hemácias de carneiro, o tes te deve ser confirmado pe a adsorção do soro do paciente com os antígenos de rim de cobaia e g óbu os, de boi separadamente. Técnica da reação: Materia necessário: - Soro do paciente inativado - Micropipe ta de 20 µ - P aca de vidro escavada (a mesma que se usa para o VDRL) - Hemácia s de carneiro a 2% em sa ina - G óbu os cozidos de boi (antígeno) - Extrato de r im de cobaia (antígeno de Forssman) - So ução de NaC a 0,85%. Rea ização do teste: 1 - A uma âmina com pe o menos oito escavações, adicionar 20 µ de so ução sa ina; 2 - Na primeira escavação adicionar 20 µ do soro do pa ciente. Homogeneizar com a mesma ponteira, passando 20 µ para a 2a cavidade, da í para a terceira e assim, sucessivamente, até a ú tima, quando desprezamos 20 µ . Temos assim, o soro di uído a 1/2, 1/4 até 1/256; 3 - Adicionar a cada di uiç ão do soro 20 µ de uma suspensão de hemácias de carneiro a 2%, em sa ina. Homog eneizar, imprimindo à âmina um movimento de rotação. A ag utinação das hemácias ocorrerá dentro de 1 a 2 minutos até certa di uição ou pode não haver ag utinaç ão se o soro não possuir hemag utininas. Uma hemag utinação produzida pe o soro até à di uição de 1:32, é um teste que não indica a mononuc eose. Pode-se dar co mo negativo. Se porém, houver hemag utinação até a uma di uição do soro de 1/64 ou maior, há uma forte suspeita de ser mononuc eose. Neste caso o soro dever ser absorvido com g óbu os de boi (0,1 m de Gb + 0,4 m do soro) e com rim de coba io (0,1 m de Rc + 0,4 m do soro). Misturam-se soro e antígeno em um tubo de he mó ise, deixar no banho maria a 37°C por 30 minutos, centrifugar e repetir a rea ção com o sobrenadante do mesmo modo que se procedeu para a prova direta com as hemácias de carneiro. Para isto destacar duas fi eiras na p aca, uma para Gb e o utra para Rc. Em cada fi eira, adicionar 20 µ de sa ina em cada cavidade e di u ir, como anteriormente, o soro tratado (uma fi eira para Gb e outra para Rc). Ad icionar em cada cavidade 20 µ de hemácias de carneiro e homogeneizar, com movim entação de rotação. 121

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Deve-se esc arecer que a reação c ássica de Pau -Bunne & Davidsohn era feita e m tubos e com di uições de 1/7, 1/14 ... 112 ou mais. Considerava-se, neste caso , como suspeito de mononuc eose infecciosa, um paciente cujo soro apresentasse, na prova direta um títu o igua ou superior a 1:56. Nestas condições absorvia-se o soro com Rc e Gb para diferenciação das hemag utininas. Observação: O sangue de carneiro usado deve ser conservado em so ução de A sever, outros anticoagu an tes diminuem a sensibi idade das hemácias e prejudicam o teste. TESTE DO LÁTEX O átex tem sido empregado como suporte para variados tipos de an tígenos e de imunog obu inas, graças às suas propriedades de adsorção de proteín as. Contamos com um grande número de testes tendo como suporte o átex. Nos dife rentes diagnósticos rea izados podem ser pesquisados anticorpos (se o átex esti ver revestido com antígeno) ou pesquisa de antígeno (se o átex estiver revestid o com anticorpo). Atua mente existem conjuntos de átex para pesquisar os agente s microbianos (bactérias, vírus), muito específicos, isto é, sensibi izados com anticorpos monoc onais. 122

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4 - Após 2 a 3 minutos proceder a eitura, observando o títu o do soro, em cada fi eira. O títu o será a maior di uição do soro onde houver hemag utinação comp eta. Observações: O antígeno de g óbu os de boi absorve o anticorpo do soro no c aso de mononuc eose infecciosa e da doença sérica. O antígeno de rim de cobaio a bsorve os anticorpos de Forssman. Em determinado soro, se o títu o da prova dire ta for de 1:128 e após à absorção com Gb e Rc não ocorrer hemag utinação, não se trata de mononuc eose e sim de doença do soro. Se por acaso ocorrer hemag utina ção pe o soro tratado com Rc a uma di uição de 1:64, por exemp o, e com Gb não o correr hemag utinação, trata-se de mononuc eose. Se se tratarem de anticorpos de Forssman, não haverá hemag utinação no soro tratado com Rc, mas haverá hemag ut inação no soro tratado com Gb. Resumindo teremos: DIFERENCIAÇÃO DAS AGLUTININAS ANTI-HEMÁCIAS DE CARNEIRO DIAGNÓSTICO PROVA DIRETA HEMÁCIAS DE CARNEIRO Rc Doenç a do soro Mononuc eose Soro norma 128 128 128 64 Gb 64 SORO ABSORVIDO COM

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TESTE DO LÁTEX PARA ARTRITE REUMATÓIDE Os reagentes tendo como suporte o átex, são fornecidos por diferentes fabricantes. No conjunto, são fornecidos o átex s ensibi izado com gamag obu ina humana (anticorpo), soros padrões positivo e nega tivo di uídos a 1:20, p aca de vidro quadricu ada e so ução tampão de g icina-Na C , pH 8,2. REALIZAÇÃO DO TESTE 1. Usar a âmina quadricu ada e separar três quadrados, o nú mero 1 para o soro do paciente, o número 2 para o soro negativo e o número 3 par a o soro positivo; 2. Di uir o soro do paciente a 1:20 no tampão de g icina (0,0 5 µ de soro em 1 m de tampão). 3. Co ocar nos quadrados números 1, 2 e 3 uma g ota do soro do paciente (1:20), uma gota do soro negativo e uma do soro positivo , respectivamente. 4. Sobre cada gota adiciona-se uma gota do átex sensibi izad o misturando bem. Imprime à âmina um movimento de rotação durante 1 a 2 minutos . Reação positiva: presença de ag utinação Reação negativa: ausência de ag utina ção Se quiser fazer uma titu ação basta fazer di uições sucessivas do soro no ta mpão de g icina. O títu o será a maior di uição do soro onde ocorre ag utinação. Em cerca de 80% dos casos de artrite reumatóide essa prova é positiva, enquanto que na febre reumática e na po iartrite reumática secundária crônica é quase se mpre negativa. Nas infecções ou afecções como hepatite, cirrose hepática, sarcoi dose, sífi is e upus eritematoso, esta prova é sempre positiva. TESTE DO LÁTEX PARA ANTICORPOS ANTIROIDEANOS O conjunto é fornecido contendo os reagentes como no caso anterior. O átex é revestido com tireog obu ina acompanh ando soros negativo e positivo (di uídos 1:20), em tampão de g icina. A rea izaç ão do teste obedece às mesmas normas do teste para artrite reumatóide. Neste tes te não se faz titu ação. TESTE DO LÁTEX PARA LUPUS ERITEMATOSO O conjunto de reagentes é fornecido pe a irma Hy and e se constitui de um frasco com partícu as de átex revestidos com NA, p aca de vidro, soros positivo e negativo (não di uídos). Nos quadrados 1, e 3 co ocar uma gota do soro do paciente, do soro negativo e uma gota do soro ositivo, respectivamente. 123

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F D 2 p

Adicionar uma gota de átex a cada um dos três quadrados, imprimir à âmina um m ovimento de rotação durante 1 a 2 minutos e procede-se a eitura. Reação positiv a: presença de ag utinação Reação negativa: ausência de ag utinação. Atua mente, encontram-se os conjuntos de reagentes com suporte de átex para diagnóstico de uma série de afecções e infecções microbianas. Todos são fáceis de se uti izar, bastando er, com atenção, os fo hetos que acompanham os conjuntos para diagnós tico. TESTE DE WAALER-ROSE Fundamenta-se este teste na ag utinação de hemácias de carn eiro sensibi izadas com hemo isina, pe o soro do indivíduo com artrite reumatóid e. O soro do paciente com artrite reumatóide é capaz de ag utinar hemácias de ca rneiro sensibi izadas em 75% dos casos. Esta ag utinação ocorre por causa de um fator chamado “Fator Reumatóide”. Este teste pode ser usado em tubos 13 x 100 mm ou em microp acas de p ástico, as mesmas que se usam para os testes de hemag ut inação, inibição da hemag utinação e fixação do comp emento. MATERIAL NECESSÁRIO PARA A REAÇÃO - Microp aca de p ástico (96 orifícios) - Micr opipeta de 20 µ e respectivas ponteiras - So ução sa ina 0,85% - Hemo isina (so ro de coe ho anti-hemácias de carneiro) - Hemácias de carneiro - Banho Maria a 3 7°C e a 56°C - Soro do paciente - Centrífuga c ínica comum para 3.000 rpm. TÉCNI CA DO TESTE 1. Usar as hemácias de carneiro conservadas em so ução de A sever, avadas três vezes em so ução sa ina. Após à ú tima centrifugação fazer uma suspe nsão a 2% na mesma sa ina usada para a avagem. Usar um vo ume destas hemácias e adicionar a igua vo ume de hemo isina contendo 2 unidades hemo íticas (3 m de hemácias a 2% + 3 m de hemo isina com 2UH). Deixar no banho maria a 37°C, por 15 minutos para sensibi izar. Em outro tubo co ocar 3 m de sa ina e 3 m de sus pensão de hemácias a 2%. Estas hemácias servem de contra-prova. 2. Usar uma micr op aca e marcar duas fi eiras (cada uma com 12 escavações), uma com a etra A e a outra com a etra B. 3. Co ocar em todas as escavações das fi eiras A e B, 20 µ de sa ina. 124

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4. Nos orifícios A1 e B1, adicionar 20 µ de soro inativado do paciente. Com out ra ponteira de 20 µ homogeneizar o íquido do 1o orifício passando 20 µ para o 2o, daí para o 3o até o 11o, desprezando 20 µ . Deixar o orifício A12 sem soro (contro e). Do mesmo modo, proceder as di uições da fi eira B. As di uições do s oro em ambas as fi eiras são: 1:2, 1:4 ... 1:2048. 5. Adicionar 20 µ de hemácia s sensibi izadas em todos os orifícios da fi eira A, isto é de A1 a A12 e a cada um dos doze orifícios de fi eira B adicionar 20 µ de hemácias não sensibi izad as. Agitar suavemente e incubar a p aca a 37°C por uma hora transferindo-a, em s eguida, para a ge adeira. 6. Leitura: Após 30 a 60 min na ge adeira proceder a eitura. Observar a presença ou não da hemag utinação em todos os tubos das fi ei ras A e B, inc usive os contro es (A12 e B12). 8. Resu tado: É ca cu ado pe o qu ociente da recíproca da maior di uição do soro que produz ag utinação com as hem ácias sensibi izadas, pe a maior di uição do soro que ag utina as hemácias não s ensibi izadas. Exemp o: se o títu o da fi eira A for de 1:256 (8o orifício) e se o títu o do mesmo soro na fi eira A for de 1:32, teremos: 256: 32 = 8. É uma pr ova negativa pois só a consideramos positiva com o resu tado fina igua ou maio r que 1/32.

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TESTE DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO Considerções Gerais O teste de fixação do comp e mento foi até a década de 1970, amp amente uti izado para diagnóstico de muitas doenças virais, bacterianas, mico ógicas e parasito ógicas. Naque a época esta r eação iderava entre as demais executadas nos aboratórios. Em a guns casos, com o nos vírus Inf uenza e a é tipo específica, e no caso dos Arbovírus e a é sub-g rupo específica e no caso dos Adenovírus e a é grupo específica. Apresentando ou não especificidade ainda hoje é empregada para o diagnóstico aboreatoria . Com o aparecimento dos testes de Imunof uorescência, de ELISA, da Quimio uminescênc ia da Imunoperoxidase e Western B ot e a tem seu uso, atua mente, bastante restr ito. A fixação do comp emento em re ação a estes ú timos testes, perde por sensi bi idade e especificidade. Mesmo assim, este teste está onge de cair em desuso e deve continuar sendo úti por a gum tempo. Fundamento O fundamento do teste ba seia-se na propriedade que tem o anticorpo de se combinar com o antígeno e consu mir o comp emento, evitando a hemó ise do sistema reve ador. Materia : a) Microp acas de fundo côncavo. As microp acas norma mente usadas possuem 96 orifícios. Dependendo da preferência de cada um pode-se usar tubos ou macrop acas. Estes tê m, porém, o incoveniente de ser anti-econômicos. b) Centrífuga c ínica com capac idade de atingir 3000 rpm, rotor horizonta . c) Banho maria a 37oC e a 56oC. d) Micropipetas de 10, 20 e 25μl e as respectivas ponteiras. e) Tubos e centrífu a cônico ra ua os e vi ro. f) Tampão Fosfato e pH 7,2 ou solução a 0,85% e Cl oreto e só io conten o ions cálcio e ma nésio (Ca++ e M + , sensibilizam a reaç ão). ) Hemácias e carneiro a 2% em tampão fosfato ou salina a 0,85% h) Hemolis ina i) j) Complemento em solução e Richar son (solução conserva ora). Antí eno para o qual se queira pesquisar o anticorpo. k) Soro o paciente inativa o (56oC por 30 minutos). Nesta operação ocorre a naturação o complemento, principalmente a fração C3. 126 es

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l) Solução salina tampona a com cálcio e ma nésio, 10 vezes concentra a conforme fó rmula escrita a se uir:

NaHPO412H2O................................................3,01 K2H2PO4........ ..................................................0,24 M Cl2H2O................ .......................................10,0 CaCl2.............................. .................................0,45 M Cl2.................................... ..........................0,34 Á ua estila a q.s.p. .......................... .............1000,0ml Diluir os sais separa amente e conservar em ela eira. Na hora e usar iluir a 1/10 em á ua estila a e, se necessário, ajustar o pH para 7,2 com os mesmos sais usa os no preparo a solução. Técnica a Reação – Pa ron ização os Rea entes Sistema Hemolítico: Hemácias sensibiliza as e carneiro a 2 % (antí eno) e hemolisina – soro e coelho anti hemácias e carneiro (anticorpo) . Nota: a Hemolisina é também chama a e soro hemolítico, soro e coelho anti l óbulos e carneiro. a) Hemolisina: A hemolisina usa a é o soro e coelho anti- l óbulos e carneiro. Para se obte-lo inoculam-se lóbulos e carneiro em coelho e , após haver a formação e anticorpos para lóbulos e carneiro, retira-se o san ue, eixan o-se coa ular para separar o soro. Centrifu a-se o soro, para se ret irar al uma impureza que tenha fica o e inativa-se a 56oC por 30 minutos. Isto v isa estruir o complemento o soro. A iciona-se, então, parte i ual e licerina como preservativo e conserva-se, para uso na ela eira a 4oC. b) Glóbulos e ca rneiro: Colheita e san ue: colhe-se a quanti a e e san ue e carneiro que se eseja, empre an o i ual volume e Alsever, que é uma solução anticoa ulante cons erva ora. Solução e Alsever: Glicose........................................... ...................2,05 Citrato e só io....................................... ..........0,8 Cloreto e só io................................................0 ,42 Á ua estila a q.s.p. .......................................100ml Ajustar o pH a 6,1 com a solução à 5% e áci o cítrico. Esterelizar urante 3 ias a 100 oC por 30 minutos. O san ue é uar a o em ela eira a 4oC e manti o estéril. O s an ue e carneiro coleta o em Alsever conserva-se bem por 3 a 4 meses es e que não seja a ita o a ca a vez que for usa-lo, sem variação e resistência lobular urante, pelo menos, uma semana. A conservação é tanto 127

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NaCl.......................................................70,0 ............................................3,7

KCl............

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maior quanto menos a itação sofrer o frasco conten o as hemácias. Po e-se conser var até 60 ias em perfeitas con ições a 4oC. c) Complemento: O complemento é ob ti o me iante punção car iaca e cobaios a ultos e sãos, evitan o-se as fêmeas p renhas. Os animais everão ser manti os em jejum urante 12 horas, sen o conveni ente usar a mistura e soros e, pelo menos, 4 cobaios, evi o ao fato o comple mento ser constituí o e, pelo menos 9 frações (C1 a C9) e, usan o-se apenas um cobaio po erá estar ausente uma ou mais estas frações. Desloca-se o coá ulo ime iatamente após se ter forma o, eixa-se urante 2 horas a temperatura ambiente e separa-se o soro me iante centifu ação lenta (1500 rpm) urante 10 minutos, e maneira a evitar a hemólise. Será então mistura o com a solução e Richar son, na proporção e 8 partes o soro (complemento) mais uma parte e solução B, mais uma parte e solução A. A solução e Richar son é constituí a e uma solução A e uma solução B. NOTA: é importante juntar-se ao complemento em primeiro lu ar, a solução B e, em se ui a a solução A. Solução e Richar son: Solução A Áci o bó rico (H3BO3)......................................................0,93 Bórax (N a2B4O710H2O)...................................................2,29 Sorbitol (C 6H14O61/2H2O)...............................................11,47 Solução satur a a e cloreto e só io q.s.p. ......................100ml Solução B Borax...... ........................................................................0,57 Az i a só ica....................................................................0, 81 Solução satura a e NaCl q.s.p. .....................................100ml O bservação: issolver ca a substância separa amente em solução satura a e cloret o e só io juntan o-as epois. ) Titulação o complemento e a hemolisina O complemento po e ser titula o ao m esmo tempo com a hemolisina. No primeiro ia, preparam-se as várias iluições o complemento. Para isso junta-se uma parte e complemento e 7 partes e á ua es tila a, fican o o complemento ilui o a 1/10, em vista e possuir uas partes e solução e Richar son (1 parte e solução A mais uma parte e solução B). Exemp lo: 0,4 ml e complemento mais 2,8ml e á ua estila a = 3,2ml = 1/10. De 1/10 p roce er as iluições 1/20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100. Para fazer as iluiç ões em tubos e hemólise, proce er assim: 128

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Complemento 1/10 0,5ml (1 mais 1) 0,5ml (1 mais 2) 0,5ml (1 mais 3) 0,5ml (1 mai s 4) 0,2ml (1 mais 5) 0,2ml (1 mais 6) 0,2ml (1 mais 7) 0,2ml (1 mais 8) 0,2ml ( 1 mais 9) Salina 0,5ml 1,0ml 1,5ml 2,0ml 1,0ml 1,2ml 1,4ml 1,6ml 1,8ml Diluição 1/20 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 Ain a no primeiro ia, istribui-se na placa: a) 20μl e salina em to os os orif ícios, inclusive nos controles e complemento (CC’), e nos controles e hemolisi na (ver esquema na pá ina 123). b) Colocar 10μl e ca a iluição o complemento, inclusive nos controles complemento, não fazen o nos controles e hemolisina. A placa é coloca a na ela eira até o ia se uinte ou na estufa a 37oC por uma ho ra. Após uma hora e incubação ou uma noite na ela eira, preparar misturas e v árias iluições e hemolisina e suspensões e lóbulos e carneiro a 2%. Mistura r as iluições e hemolisina e as suspensões e lóbulos em partes i uais, eixa r no banho maria a 37oC, para sensibilizar, e istribuir nas placas, numa quanti a e e 20μl para ca a orifício. e) Preparo as iluições e Hemolisina Num tubo e Kahn, coloca-se 0,1ml e hemolisina e título esconheci o mais 0,9ml e sal ina, fican o a iluição a 1/10. Num se un o tubo, colocam-se 0,7ml e iluição 1 /10 mais 2,8ml e salina, temos assim a iluição 1/50. Usam-se as iluições 1/10 0, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, etc. Para a obtenção estas iluições, p roce er assim: Hemolisina 1/50 1. 1,5ml 2. 1,5ml (1/100) 3. 1,5ml (1/200) 4. 1,5 ml (1/400) 5. 1,5ml (1/800) 6. 1,5ml (1/1600) Salina Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Diluição 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1 /3200 Num 7o tubo colocamos apenas 1,5ml 129 e salina (controle).

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a) Lava em os lóbulos: Retirar 10ml e san ue, conserva o em Alsever, e centri fu ar a 1800 rpm por 5 minutos, a fim e retirar a solução e Alsever. Iniciar a lava em propriamente ita, retiran o-se o sobrena ante (Alsever). A icionar 10m l e salina 0,85%, a itar e centrifu ar a 1800rpm por 5 minutos. Repetir a lava em por mais uas vezes, até obter sobrena ante claro. Na última lava em (a terce ira), antes e se aspirar o sobrena ante, verificar a quanti a e e se imento ou papa e hemácias. b) Preparo os lóbulos a 2%: Completar a quanti a e obti a e papa, com salina, para obter uma suspensão e lóbulos a 10%. Exemplo: Obten o -se 0,6 ml e papa, completa-se com salina até 6 ml o que correspon e a 10%. Uma parte os lóbulos a 10% mais 4 partes e salina, o que á 2%. Ex: 2 ml e lób ulos 10% mais 8 ml e salina = 2%. Nota: antes e se iniciar a última lava em o s lóbulos, colocar a placa na estufa, on e everá ficar 30 minutos antes e se juntar as hemácias sensibiliza as. c) Mistura as iluições e hemolisina aos l óbulos a 2% Ajuntar os lóbulos e carneiro a 2% a ca a iluição e hemolisina, em i ual quanti a e e a itar rapi amente. 1) 1,5 ml e hemolisina 1/100 mais 1,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. 2) 1,5 ml e hemolisina 1/200 mais 1,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. 3) 1,5 ml e hemolisina 1/400 mais 1,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. 4) 1,5 ml e hemolisina 1/800 mais 1,5 ml e lóbulos e carne iro a 2%. 5) 1,5 ml e hemolisina 1/1600 mais 1,5 ml e lóbulos e carneiro a 2 %. 6) 1,5 ml e hemolisina 1/3200 mais 1,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. Cons tituem-se estas misturas as hemácias sensibiliza as. 7) 1,5 ml e salina mais 1 ,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. Colocar estes sete tubos no banho maria a 37 oC por 15 minutos. ) Distribuição na placa: Após a placa ter fica o na estufa p or 30 minutos e a hemolisina ter si o sensibiliza a pelos lóbulos e carneiro n o banho maria por 15 minutos, faz-se a istribuição na placa, on e foram coloca as as iluições o complemento. Colocam-se 20 μl e ca a iluição o sistema hem olítico, inclusive nos orifícios e controle a hemolisina, excetuan o-se os ori fícios e controle o complemento, on e só se a iciona a suspensão e hemácias e salina (1,5 ml e salina mais 1,5 ml e lóbulos a 2%), 7o tubo. Após a istrib uição o sistema hemolítico na 130

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placa a itar a mesma e a ca a 10 minutos, no ecorrer e 30 minutos. A se uir, r etirar a estufa e colocar na ela eira, e 2 horas após fazer a leitura. Hemolis ina Complemento Control e o Comple mento 1/20 0 0 0 0 0 0 1 2 5 1/70 1 0 0 2 2 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Contro- 5 le o comple mento Leitura: 0 = não há células, hemólise completa 1 = 10% e células 2 = 25% e cél ulas 3 = 50% e células 4 = 75% e células 5 = 100% e células e) Título a hemo lisina: A ose ótima e sensibili a e a hemolisina é a iluição que á hemólise completa com a mais alta iluição o complemento. No qua ro acima o ótimo e se nsibili a e é a iluição e 1/400, que correspon e a 1 UH, uni a e hemolítica. f ) Título o complemento: O título o complemento será a o pela maior iluição o complemento on e houver 50% e hemólise e representará 1 Uni a e e Complement o. Exemplo: Se a maior iluição o complemento on e houver hemólise e 50% for a 1/80, esta iluição correspon erá a 1 uni a e o complemento, se uin o o mesmo raciocínio, 1/40 correspon e a 2 Uni a es e Complemento. ) Titulação o antí e no: 131 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 0 0 0 0 0 1 2 1/3 1/40 0 0 0 0 0 1 2 5 1/50 0 0 0 0 0 1 3 5 1/60 0 0 0 0 1 2 3 5 4 5 1/80 2 1 1 3 3 3 5 5 1/90 4 3 3 3 4 4 4 5 1/100 5 5 5 5 5 5 5

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1. Preparo as iluições o antí eno: Preparar em tubos e hemólise as várias i luições o antí eno: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64. a) 0,8 ml e antí eno mais 0,8 ml e salina = 1/2 b) 0,8 ml e 1/2 mais 0,8 ml e salina = 1/4 c) 0,8 ml e 1/4 mais 0,8 ml e salina = 1/8 ) 0,8 ml e 1/8 mais 0,8 ml e salina = 1/16 e) 0,8 ml e 1/16 mais 0,8 ml e salina = 1/32 f) 0,8 ml e 1/32 mais 0,8 ml e salina = 1/64 2) Preparo as iluições e sor pa rão: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160. a) 0,2 ml e soro pa rão mais 1,8 ml e salina = 1/10 b) 1,0 ml a iluição 1/10 mais 1,0 ml e salina = 1/20 c) 1,0 ml a iluição 1/20 mais 1,0 ml e salina = 1/40 ) 1,0 ml a iluição 1/40 mais 1,0 ml e salina = 1/80 e) 1,0 ml a iluição 1/80 mais 1,0 ml e salina = 1/160 3) Preparo o complemento: Se o título o complemento, previamente titula o, for , por exemplo, 1/80 = 1 Uni a e o complemento. Usar 2 uni a es o complemento = 1/40 Ex: 0,1 ml o Complemento mais 0,7 ml e á ua estila a = 1/10 0,8 ml e C omplemento mais 2,4 ml e salina = 3,2 ml = 1/40 4) Preparo a hemolisina: Se o título a hemolisina, previamente titula o, for, por exemplo, 1/800 = 1 Uni a e e hemolisina. Usar 2 uni a es e hemolisina = 1/400 1 ml e hemolisina 1/40 mai s 9 ml e salina = 1/400. 132

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5) Preparo as hemácias sensibiliza as: Juntan o-se partes i uais e hemolisina 1/400 e lóbulos e carneiro a 2%, após 15 minutos no banho maria, para que a he molisina sensibilize os lóbulos e caneiro, fica pronta a mistura e hemácias e hemolisina. Distribuição na placa: No primeiro ia, frontalmene na placa, colocar-se-ão 10 μ l e ca a iluição o antí eno, sen o que, no orifício e controle o antí eno, serão coloca os 20 μl e salina e 10 μl e ca a iluição o antí eno. Horizontal mente na placa, colocar-se-ão 10μl e ca a iluição o soro que se quer pa roniz ar, sen o que, no orifício e controle o soro, serão coloca os, 10μl e ca a i luição o soro e 20μl e salina. Em to os orifícios a placa serão coloca os 10μ l o complemento (1/40) inclusive nos orifícios e controles, tanto nos o soro quanto nos e antí eno. Será feito isola amente na placa um controle e compleme nto, ocupan o 4 orifícios. 1o orifício: 20 μl e salina mais 10 μl o complement o = 2 uni a es e complemento. 2o orifício: 20 μl e salina mais 10 μl e comple mento iluí o (a iluição se faz num buraco acima, juntan o-se 20 μl e salina m ais 20 μl e complemento). O 2o orifício correspon erá a 1 uni a e e complement o. 3o orifício: 20 μl e salina mais 10 μl e complemento (a iluição se faz em outro buraco acima, juntan o-se 30 μl e salina mais 10 μl e complemento). 4o o rifício: 30 μl e salina somente, o que correspon erá a nenhuma uni a e e compl emento que é i ual a 0. A placa é coloca a na ela eira até o ia se uinte ou po r 3 horas à temperatura ambiente a fim e se imentar as hemácias. No 2o ia, ser á coloca o o sistema hemolítico. No preparo os lóbulos para o sistema hemolíti co, antes a 3a e última lava em coloca-se a placa na estufa, pois everá ficar por 30 minutos antes e se juntar o sistema hemolítico. Distribuição na placa: A istribuição everá ser feita apoós a placa ter fica o na estufa por 30 minutos e os lóbulos e carneiro terem si o sensibiliza os pela hemolisina, no banho m aria a 37oC por 15 minutos. Colocam-se 20 μl e hemácias snesibiliza as em to os os orifícios a placa, inclusive nos controles. Deixa-se a placa na estufa por 30 minutos, ten o-se o cui a o e a itar a ca a 10 minutos, fin o os quais será leva a a ela eira por uas horas lo o após será feita a leitura. Leitura: 133

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1. A iluição ótima o antí eno é a que fixa maior iluição o complemento. No e xame a ota o, é e 1/80 e será esta a iluição o antí eno a ser usa a na eterm inação o teste com o soro esconheci o. 2. O título o soro pa rão é toma o pel a iluição que á na leitura e 50% e hemólise, a qual, com a ótima iluição o antí eno foi 1/80. O título o soro será 1/80. 3. Leitura o complemento: No pr imeiro orifício o complemento foram coloca os 10 μl, o que correspon e a 2 uni a es. Deverá haver hemólise total. No se un o orifício foram coloca os 10 μl o complemento que, iluí o, passou a possuir uma uni a e. Deverá haver hemólise to tal. No terceiro orifício foram coloca os 10 μl o complemento que, ilui o, pas sou a possuir 1/2 uni a e. Deverar haver hemólise parcial e 50%. No quarto orif ício não foi coloca o complemento lo o não haverá hemólise. Reação propriamente ita: Uma vez osa os (pa roniza os) o complemento, o antí e no, o soro e a hemolisina, po emos proce er o teste e Fixação o complemento pa ra pa ronizar o antí eno ou para pa ronizar o antisoro ou ain a para eterminar o título e um etermina o soro. A reação se passa em uas fases. Na primeira fa se ajuntamos o soro, o antí eno e o complemento nas iluições etermina as pela pa ronização. Na Se un a fase a iciona-se o sistema revela or. Exemplo e um teste completo: Tomaremos como exemplo a eterminação o título e anticorpos para A enovírus e um certo paciente. Material: Microplaca e 96 ori fícios e fun o concavo Micropipeta e 20 e 25 μl Salina tampona a Antí eno e A enovírus Complemento Hemolisina Hemácias e carneiro Banho maria a 37oC Gela ei ra Para executarmos o teste e Fixação o complemento com a finali a e e eterm inarmos o título e anticorpos para A enovírus, everemos usar to os os rea ente s previamente pa roniza os e ca a um numa iluição fixa, correspon en o a: uas uni a es anti ênicas, uas uni a es 134

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complementares e uas uni a es e hemolisina. Assim teremos: se o título o antí eno for e 1/80, uas uni a es anti ênicas correspon em ao antí eno a iluição e 1/40. O mesmo proce imento eve ser feito para a eterminação as uas uni a es complementares e hemolíticas, por exemplo, tomar uas vezes a concentração o título final e ca a rea ente. Execução o teste: 1. Tomamos uma microplaca e 96 orifícios e fun o concavo. Separamos uma fileira e oze orifícios e colocam os 20 μl e salina tampona a nos oze orifícios. Separamos uma outra fileira e ois orifícios para controle o soro, ois para controle o antí eno, ois para controle o sistema revela or e ois para controle o complemento. Nestes coloca mos, também, 20 μl e salina tampona a 2. Feito isto, colocamos 20 μl e soro o paciente no primeiro orifício a primeira fileira e iluímos sucessivamente com a micropipeta e 20 μl, passan o 20 μl para o se un o orifício, aí para o terc eiro e assim por iante até o último orifício. Desta maneira teremos o soro ilu í o e 1/2 até 1/4096 ( e um mo o eral nos testes e fixação o complemento, nã o há necessi a e e ultrapassar a iluição e 1/512). Nos ois orifícios o cont role o soro, colocamos também 20 μl o soro bruto em ca a um. 3. Uma vez iluí o o soro, a icionamos em ca a orifício on e foram realiza as as iluições o mes mo, 20 μl o antí eno conten o uas uni a es anti ênicas, incluin o nos ois ori fícios os controles o mesmo antí eno. 4. A ita-se a placa suavemente, e a icio nam-se 20 μl o complemento conten o uas uni a es, em to os os orifícios a rea ção propriamente ita e nos controles e soro, e antí eno e e complemento. Não se a iciona complemento nos controles o sistema revela or. 5. Após esta operaç ão a placa com a reação po erá ser incuba a a 37oC por 1 hora ou na ela eira po r uma noite. 6. A revelação é feita com o sistema hemolítico, isto é, uma mistur a em partes i uais e hemolisina conten o uas uni a es hemolíticas e uma suspen são e hemácias e carneiro a 2% em salina tampona a. Para isso a icionamos 20 μ l o sistema revela or em to os os orifícios a reação propriamente ita e nos c ontroles (soro, antí eno, complemento e sistema revela or) 7. Leitura a reação: a) Soro ne ativo: Não haven o anticorpos, não há consumo o complemento e este livre vai entrar na combinação hemolisina e hemácias, pro uzin o a hemólise. Se to os os c ontroles estiverem bem, só não haverá hemólise nos controles o sistema revela o r. b) Soro positivo: Haven o anticorpos há a reação e anticorpos-antí eno e con sumo o

complemento até etermina a iluição. Vamos supor até 1/128 (com o tempo ocorre se imentação as hemácias e formam botões). O título e anticorpos o soro é e 1/128. O funcionamento os controles eve estar correto, isto é, só não ocorre h emólise nos controles o sistema revela or. 135

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Observações: 1 – Al uns soros po em apresentar inibi ores o complemento (antico mplementar) ou hema lutininas inespecíficas. As vezes, este fenômeno po e ser no ta o claramente, isto é, o soro contém hema lutininas inespecíficas ou anti-comp lementar. No primeiro caso as hemácias o Sistema Revela or não escem para o fu n o o orifício e no se un o caso há a se imentação as hemácias e notamos a for mação e botão. No caso e haver hema lutininas inespecíficas, tomam-se 0,5 ml e soro e trata-se com 0,1 ml e papa e hemácias e carneiro. Incuba-se a 37oC p or 30 minutos, centrifu a-se para separar o soro e proce e-se a reação. Se houve r inibi ores inespecíficos o complemento, tomam-se 0,5 ml o soro e a icion-se 0,1 ml o complemento bruto, incuba-se a 37oC por 30 minutos. Após isto, inativa -se o soro e proce e-se novamente a reação. 2 – To os os testes e Fixação o Co mplemento são realiza os o mesmo mo o. No caso e pesquisarmos anticorpos no so ro o paciente, só mu a o antí eno. Este eve variar e acor o com o a ente etio ló ico que estamos pesquisan o. Esta mesma reação po e ser empre a a para ia no sticar o antí eno. Nesta mo ali a e proce eremos e mo o inverso ao que fizemos anteriormente. O esconheci o é o a ente etioló ico (antí eno), como acontece po r exemplo, na i entificação os micror anismos isola os. Para isso everemos Ter complemento, hemolisina e anticorpo pa roniza os. O antí eno entra nas reações em iluições sucessivas e os emais componentes em iluição fixa, conforme nos r eferimos, anteriormente. 136

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ANTIESTREPTOLISINA O (ASLO) Os estreptococos beta hemolíticos o rupo A elabora m uas espécies e estreptolisinas: 1. Estreptolisina O, assim chama a por ser s ensível ao O2 e só se manifesta a sua ativi a e quan o o cal o tóxico é trata o com um a ente re utor no vácuo. Uma as substâncias químicas usa as é o sulfato e só io (NaHSO3). A estreptolisina S é oxi ênio estável, não é anti ênica e par ece ser i êntica à hemotoxina estreptococica, que se injeta a no camun on o ou c oelho pro uz hemo lobinúria, anemia e icterícia. A estreptolisina O é fortemente anti ênica e in uz a formação e anticorpos correspon ente, isto é, antiestrept olisina O (ASLO). A eterminação o título e ASLO é e ran e valia ia nóstica na febre reumática e nas infecções pelo estreptococo o rupo A, beta hemolític o. O título e antiestreptolisina é a o em uni a es To ou Uni a es Internacio nais. Na febre reumática um nível e 333 UT já é in ica or e oença e nas infec ções estreptoccocicas recentes, um título e 125 UT si nifica infecção por esta bactéria. Títulos altos ou subi a e título em sorolo ia parea a são si nificati vos.

TESTE DE ANTIESTREPTOLISINA O O fun amento o teste baseia-se na inibição a hem ólise pro uzi a pela estreptolisina O quan o esta entra em contato com seu antic orpo correspon ente. Como to o antí eno, a estreptolisina O eve ser pa roniza a . Os laboratórios e Análises Clínicas já a quirem este antí eno pa roniza o, pr onto para uso. Os fabricantes fornecem a estreptolisina O com as in icações e iluições a serem feitas para a realização o teste. MATERIAL NECESSÁRIO - Tampão e fosfato pH 6,5 a 6,7 - Hemácias e carneiro ou h umanas o Grupo O - Pipetas e 1 ml ra ua a em écimos - Tubos 13 x 100 mm - Es tante para tubos 13 x 100 mm - Banho Maria a 37°C - Soro inativa o a 56°C o pac iente Existem muitos soros que possuem inibi ores inespecíficos a hemólise, po en o levar a resulta os errôneos. Estes inibi ores são beta-lipoproteínas e esta s po em ser removi as por um os se uintes processos: a) Méto o o extran - Apó s à inativação o soro o paciente, tomam-se 0,2 ml este soro, em um tubo 13 x 100 mm e a icionam-se 1,56 ml e tampão e ASLO mais 0,4 ml e extran (p.m. 500 .000) a 10% em á ua estila a e 0,2 ml e cloreto e cálcio 1 M. Deixar uma hora em temperatura 137

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ambiente, centrifu ar por 10 min. a 1.500 rpm. Colher o sobrena ante. Este sobre na ante correspon e ao soro iluí o a 1:10, pronto para se proce er a reação. b) Méto o a heparina - A 0,2 ml e soro inativa o, acrescentam-se 0,05 ml e hepa rina a 1%, 1,8 ml e cloreto e cálcio a 0,025 M. Deixar uas horas em temperatu ra ambiente e centrifu ar a 4.000 rpm urante 10 minutos. O soro assim absorvi o está iluí o a 1:10, pronto para ser usa o no teste. TÉCNICA DA REAÇÃO (Rantz & Ran all, mo ifica a) 1 - Após a inativação e o tratam ento o soro para a remoção os inibi ores inespecíficos, este fica iluí o a 1: 10. Necessita-se, para o teste, iluí-lo a 1:100 e a 1:500. Para estas iluições basta tomar 0,5 ml o soro e a icionar 4,5 ml e tampão ASLO, fican o assim a 1 :100. Do soro a 1:100, tomamos 1 ml e acrescentamos 4 ml e tampão, temos a ilu ição e 1:500. 2 - Em uma estante para tubos 13 x 100 mm, separamos uma fileira para 13 tubos e os enumeramos e 1 a 13, colocamos nestes o tampão ilui or, as iferentes iluições o soro e a estreptolisina O convenientemente iluí a. Incu ba-se a 37°C por 15 minutos e a iciona-se 0,1 ml e uma suspensão e hemácias e carneiro ou humana o rupo O a 2%. Incuba-se a 37°C por ez minutos e proce e a leitura a reação. Verifica-se se os controles funcionaram bem. No controle se m estreptolisina não po e ocorrer hemólise e nos controles com hemolisina eve o correr hemólise total. Para melhor enten er a isposição os tubos e a a ição o s rea entes basta observar o esquema abaixo: DOSAGEM DE ANTIESTREPTOLISINA O DILUIÇÕES DO SORO TUBOS SORO DILUÍDO TAMPÃO ASLO SLO ATIVADA INCUBAR A 37°C DURANTE 15 MINUTOS ADICIONAR 0,1 ml DE HEMÁCIAS A 2% EM TODOS OS TUBOS INCUBAR A 37°C POR 10 MIN. DILUIÇÕES DO SORO 138 1:10 1:100 1:500 controles 1 0,1 2 0,5 3 0,4 4 0,3 5 0,25 6 0,2 7 0,15 8 0,5 9 0,4 10 0,3 11 0,2 12 13 -

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0,4 0,1 0,2 0,25 0,3 0,35 0,1 0,2 0,3 0,75 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 1:10 1:100 1:500 controles

TUBOS UNIDADES TODD 1 50 2 100 3 4 5 6 7 8 500 9 625 10 833 11 1250 12 13 + 125 166 200 250 333 - = sem hemólise + = com hemólise LEITURA Examinar ca a tubo, a fim e se verificar qualquer sinal e hemólise. O tubo 12 que é o controle e hemácia, não eve mostrar hemólise e o número 13, co ntrole e estreptolisina eve evi enciar hemólise total. O título o soro corres pon erá à maior iluição o mesmo em que não ocorrer hemólise. Recomen a-se semp re usar um soro pa rão para termo e comparação quan o se realiza o teste e ASL O. O título final po e ser corri i o pela se uinte fórmula: Título o soro o paciente: Tít. teórico Título obti o com o soro pa rão o soro pa rão X tít. o soro paciente

TAMPÃO PARA ANTIESTREPTOLISINA O KH2PO4 ........................................ ....................3,17 NA2HPO4 ............................................. ............1,81 NaCl ........................................................ .........7,40 Á ua estila a q.s.p. ...................................1000,0 ml Dissolver os sais separa amente em um pouco e á ua. Ajuntá-la e completar o volume para 1000 ml. Conservar em ela eira a 4°C. 139

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TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO INTRODUÇÃO O Teste e Neutralização é lar amente utiliza o no ia nóstico viroló ico. Serve para a i entificação e vírus quan o se tem o soro imune específico ou é utiliza o para o soro ia nóstico, isto é, pesquisa o anticorpo para eterm ina o a ente etioló ico, es e que se tenha o antí eno pa roniza o. Este varia c onforme o a ente etioló ico e que se suspeita. As infecções causa as por vírus in uzem típicas respostas imunoló icas contra um ou mais antí enos virais. Em e ral, esenvolvem-se respostas e natureza celular e humoral, e mo o que a me i a e qualquer uma po e permitir o ia nóstico e virose. O ia nóstico laborator ial e uma infecção viral é realiza o a custa e recursos soroló icos, pela emo nstração o aumento o título e anticorpos. Os méto os para quantificar os anti corpos nas viroses, são basea os nas clássicas reações antí eno-anticorpo. Os mé to os mais comumente empre a os incluem as reações: fixação o complemento, neut ralização, inibição e hema lutinação e imunofluorescência. Aqui, será a o enfo que ao teste e neutralização, on e serão abor a os iferentes aspectos, como fu n amento, técnicas e utili a es.

FUNDAMENTO Os anticorpos neutralizantes e vírus são etermina os pela a ição e soro, que os contém, a uma suspensão e vírus, inoculan o-se epois a mistura e m hospe eiros suscetíveis, como culturas e células, ovos embriona os e animais e laboratório. A presença e anticorpos neutralizantes é emonstra a se os hosp e eiros utiliza os não esenvolverem efeitos citopáticos, “pocks”, paralisia e o u morte, no caso o uso e culturas e células, ovos embriona os e camun on os r espectivamente. Enquanto isso os hospe eiros-controle, que receberam vírus com s oro sem anticorpos, esenvolvem o efeito o vírus. A proteção o hospe eiro cont ra os efeitos o vírus emonstra a presença e anticorpos neutralizantes. Em out ras palavras, o teste e neutralização baseia-se na capaci a e que tem os antico rpos específicos o soro em estu o e neutralizarem etermina o vírus, impe in o , assim, a infecção num a o sistema hospe eiro conheci o, caso contrário evi en ciaremos a ausência e anticorpos para o vírus em questão. 140

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TESTE DE PROTEÇÃO Uma outra mo ali a e e neutralização é o teste e proteção. E ste consiste em primeiro lu ar, inocular o antissoro para etermina o a ente vir al ou bacteriano, no hospe eiro, como: cultura e células, ovos embriona os e an imais, espera-se um tempo e 30 a 60 minutos e após isto inocula-se o a ente que se quer testar. Se o soro for eficiente não haverá efeito sobre o hospe eiro. EMPREGO DO TESTE - Usa o em ia nóstico laboratorial quan o se têm soros parea o s e se eseja evi enciar a conversão soroló ica, ou seja, o aumento e pelo meno s quatro vezes o título e anticorpos neutralizantes, o se un o soro para o pr imeiro. - Do mesmo mo o, usamos o mesmo teste para a avaliação o título e anti corpos. Neste caso, usan o-se apenas uma amostra e soro, quan o é e interesse conhecer o rau e imuni a e o in iví uo para etermina o vírus, já que os anti corpos etecta os pela neutralização sur em urante a infecção e persistem uran te muitos anos. A imuni a e anti-viral é sempre estu a a nos exames, principalme nte, quan o se trata e saber se os pacientes já foram infecta os por iferentes vírus ou esenvolveram anticorpos para as vacinas comumente empre a as na profi laxia e viroses, como poliomielite, sarampo, caxumba, raiva, etc. DIFERENTES TIPOS DE REAÇÃO DE NEUTRALIZAÇÃO 1 - Neutralização em Camun on os Cam un on os e suscetibili a e uniforme e i a e-pa rão conheci as são inocula os po r uma via pa roniza a com a mistura vírus e soro. São observa as iariamente a p rocura e sinais e oença, tais como fraqueza e paralisia, para estabelecer a e specifici a e as mortes. Os sintomas e as mortes são re istra as iariamente u rante 21 ias. As mortes que ocorrem nas 24 horas posteriores à inoculação são a tribuí as às causas traumáticas ou não virais. A suspensão viral usa a é titula a pela via e inoculação a ota a. A ose letal e 50% DL50 estatisticamente, é c alcula a e um número etermina o e DL é empre a o para ca a mistura e vírus co m soro. Por outro la o, o soro é manti o constante, e as iluições virais, variá veis. 2 - Neutralização em Culturas e Células Baseia-se no mesmo princípio: o anticor po viral neutraliza, especificamente, os efeitos citopáticos o vírus. Em ca a s érie e reações e neutralização são realiza as titulações e controle e vírus, e o vírus é utiliza o na reação, na iluição referente a 100 TCD (Tissue Cultur e Dose). 141

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A concentração mais alta e ca a soro é testa a quanto a possível toxici a e cel ular específica. Para remover possíveis substâncias interferentes ou inibi oras inespecíficas, é necessário aquecer o soro a 56°C urante 30 minutos. Na reação, são feitos controles e células, para a avaliação o teste. As culturas são inc uba as a 37°C urante 3 ias e, epois, examina as ao microscópio. Os etalhes a execução esta reação variam, po en o ser feita em tubos - macrotécnica ou em placas - microtécnica. A técnica escrita a se uir, etalha a execução a reação e neutralização em microtécnica, já que esta não só, é mais econômica que o te ste realiza o por macrotécnica, em termos e rea entes, como também e fácil man useio e leitura. 3 - Neutralização em Ovos Embriona os É bastante usa o para vírus respiratórios e o proce imento é, praticamente, i ual aos testes realiza os em animais ou em c élulas. TITULAÇÃO DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES EM MICROTÉCNICA 1. Preparo as microplaca s a) Colocar as placas no álcool a 70% por 1 hora; b) Tirar o álcool, eixar esc orrer e secar na estufa por al umas horas; c) Colocar as placas para esterilizar em ultravioleta por 1 hora. 2. Material - Micropipetas e 0,025 ml; - Microplacas e fun o re on o com tampa s; - Meio Gey ABC com antibióticos; - Salina estéril; - Micro ilui ores e 0,025 ml; - Diluições o vírus - volume maior para a iluição correspon ente a 100 TC D; - Soros iluí os 1:4; - Desseca or; - Áci o sulfúrico 1M; - Bicarbonato e só io 1M. 3. Técnica 142

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- A partir o se un o orifício e uma fileira a placa, colocar 25 µl e Gey ABC , usan o micropipeta estéril; - Colocar 25 µl e soro, previamente iluí o em Ge y ABC, no primeiro e se un o orifício e uma fileira e placa. Lavar a micropipe ta com salina estéril entre um soro e outro; - Fazer iluições os soros a parti r o se un o orifício a fileira com aju a os micro ilui ores; - Colocar 25 µl e vírus suspensão conten o 100 TCD com micropipeta, em to os os orifícios; - Fa zer controle o vírus utiliza o no teste, colocan o em ois ou mais orifícios a placa 25 µl e Gey ABC e 25 µl e suspensão viral; - A itar levemente, fechar c om tampa e colocar em ambiente e CO2 ( esseca or: áci o sulfúrico e bicarbonato e só io na proporção 2:4 respectivamente); - Incubar a 35°C por 2 horas ou man ter em ela eira (4°C) por uma noite; - No ia se uinte, fazer suspensão e célu las em meio MEM Ea le com 5% e soro fetal bovino, e colocar 1 ota, com micropi peta, em ca a orifício a placa; - To o o experimento eve ser feito e maneira asséptica; - Incubar a 37°C por 3 a 5 ias, epen en o o vírus. Obsevar os resu lta os e interpretar. Observações: A suspensão eve ter 150.000 - 200.000 céls/m l. Não há necessi a e e contar em câmara e Neubauer, basta observar através a luz a concentração a suspensão celular. TESTE DE DIFUSÃO EM GEL O teste e ifusão em el vem sen o usa o há muito tempo . Serve para pesquisar anticorpos no soro ou para i entificar micror anismos, co mo vírus, bactérias, etc. É um méto o que apresenta pouca sensibili a e, por iss o tem si o usa o, em menor escala no laboratório e Análises Clínicas. FUNDAMENTO: Baseia-se na ifusão e antí eno e e anticorpo coloca os la o a la o em um suporte e el (normalmente, a ar ou a arose). No ponto e encontro os ois teremos uma reação A -Ac e precipitação. Neste caso temos a upla ifusão ( DD). Outra técnica consiste em a icionar ao a ar, ain a fun i o (+/- 45°C) o ant í eno ou o anticorpo, epen en o o que se vai pesquisar. Colocan o, por exemplo , o antí eno num orifício feito no a ar, este se espalha e se combina com o anti corpo forman o um halo e precipitação. Neste caso temos a ifusão ra ial simple s (DRS). O teste e DRS presta-se muito para se fazer levantamento soroló ico e vários tipos e infecções presentes ou passa as. Um exemplo que a Or anização M un ial e Saú e usou muito foi a pesquisa e anticorpos para o vírus Influenza A 2, a fim e se fazer um levantamento epi emioló ico a ripe no mun o. 143

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TÉCNICA DA DRS: 1. Tomar um a ar a 0,5% em tampão e fosfato pH 7,2, fun í-lo em banho maria a 100°C eixar esfriar a 45°C, acrescentan o o antí eno em concentr ação pa roniza a. Para um antí eno conten o 2,7 m % e proteína, basta colocar e m 3 ml e a ar, 30 µl e antí eno, homo eneizar e verter sobre uma lâmina escava a e plástico, ten o o cui a o e nivelar a lâmina para que a cama a e a ar fi que com espessura homo ênea. Após à soli ificação perfurar a cama a e a ar com uma a ulha e calibre 16 corta a em ân ulo reto. Não se ispon o e uma a ulha p o e-se fazer os orifícios com uma pipeta Pasteur corta a em ân ulo reto. Desobst ruir os orifícios com pipeta Pasteur e vácuo. A lâmina está pronta para o uso. E m ca a lâmina po em-se fazer 48 orifícios. Se não for usar e ime iato as lâmina s evem ser embala as em saquinhos plásticos bem ve a os e conserva as a 4°C. Nu nca con elá-las. 2. Em ca a orifício a lâmina colocar 3 µl o soro e um pacien te, não iluí o. Após a icionar os soros (não se esquecen o e um controle posit ivo e um ne ativo), eixar a lâmina a uma temperatura e 4°C a 8°C, por uma noit e. 3. Haven o anticorpos no soro, po erá ser visualiza o um halo em re or o ori fício, on e o soro for positivo, po en o ser muito níti o ou pouco níti o. 4. Me r ulhar a lâmina em salina ou PBS pH 7,2, eixar por 6 horas ou mais. Este mer u lho remove o excesso e proteínas e os halos tornam-se bem níti os. 5. A leitura é feita pela área e precipitação e ca a soro que é a a pelo tamanho o halo, em mm2. A área será tanto maior quanto mais positivo for o soro. 6. Se preferir uar ar a lâmina eve-se corá-la, com tiazina vermelha a 1% ou com Ponceau S a 1% iluí o em solução e áci o tricloroacético a 5%. Para a coloração mer ulhar no corante urante 30 min. Retirá-la a solução corante, lavá-la li eiramente em á ua estila a e mer ulhá-la numa solução para a escoloração (solução salina + 5% e áci o acético + 3% e licerol). Deixar a lâmina mer ulha a na solução, a itan o e vez em quan o, até a escoloração. Após a escoloração, retirá-la o líqui o e eixar secar em estufa a 37°C. Vamos ter uma película e a arose que s e conserva in efini amente. A função a licerina é evitar a quebra a película e a ar. TÉCNICA DA DUPLA DIFUSÃO 144

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1. Preparar a lâmina com a ar sem antí eno e sem anticorpo. Fazer uma série e o rifícios sen o um central e outros em torno o central. A istância entre os ori fícios externos e o central vai epen er o tamanho e ca a orifício e a quanti a e e rea ente que ca a um levará. Também, po em ser feitos ois orifícios, um ao la o o outro, obe ecen o à mesma re ra usa a para o anterior (ver fi . abai xo). 2. Colocar os antí enos nos orifícios laterais e o anticorpo no orifício central no caso e i entificar os antí enos ou o antí eno no orifício central e soros n as laterais no caso e i entificação os soros. Quan o se fazem orifícios um ao la o o outro, coloca-se soro em um e antí eno no outro, po en o, ao mesmo tempo i entificar o soro ou o antí eno. Em ambos os casos, no ponto e encontro a i fusão o soro e o antí eno teremos linhas e precipitação (ver fi ura acima e n a pá ina se uinte).

LEITURA No caso os orifícios ispostos em círculo em relação a um orifício cent ral, teremos, e acor o com a representação a se uir: 1. Os antí enos A e B são i uais e apresentam linhas i ênticas e precipitação com o antissoro o orifício central. Há fusão as linhas. Os antí enos têm o mesmo eterminante. 2. Entre o s antí enos B e C não há i enti a e ou epen ência imunoló ica ou reação e inte rsecção. Os eterminantes anti ênicos são iferentes. 3. Entre os antí enos C e D há uma i enti a e parcial com formação e um esporão. Os eterminantes C e D q ue rea em com o soro anti C e D têm parte comum. Porções anti ênicas menores ent re C e D formam o esporão. 4. Entre os antí enos D e E existe uma i enti a e par cial além isso iferenças menores entre os ois antí enos mostram uplo esporão . 5. Há uma i enti a e entre os antí enos E e F, aparecen o a fusão e linhas e precipitação. Entretanto o antí eno F apresenta uma linha e precipitação que n ão se observa com o antí eno E. O antí eno F apresenta ran e cruzamento com E, mas é constituí o e porções anti ênicas que não encontramos no antí eno E. A fo rmação e esporão aparece quan o ois antí enos são compara os frente a um siste ma e anticorpos. Em um sistema possui eterminantes ausentes e em outro há, tam bém, eterminantes comuns an o uma i enti a e parcial. 145

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IMUNOELETROFORESE A imunoeletroforese é a combinação a eletroforese e upla i fusão em el e a ar, que se realiza em uas etapas. Neste particular aplica-se uma corrente elétrica no sistema. Na primeira etapa separam-se os componentes e etermina o antí eno, raças às iferenças e suas car as elétricas. Numa 2a et apa faz rea ir estas frações já separa as com um antissoro específico. Este méto o permite caracterização e uma substância, simultaneamente, para três parâmetr os: a) Saber suas características eletroforética b) Difusibili a e c) Especifici a e imunoquímica Este é um méto o que foi utiliza o em lar a escala em to os os ramos a biolo ia, por seu alto po er e resolução, bastan o mencionar que a el etroforese o soro o in iví uo nos permite evi enciar 30 componentes. Há uma co mbinação e sensibili a e e e po er e i entificação os iferentes componentes . Por outro la o, a quanti a e e soro é mínima, com apenas 5 µl, po e-se fazer uma análise ampla o material a ser i entifica o. No soro humano encontramos, pe la eletroforese, 5 componentes: albumina, alfa 1, alfa 2, beta e ama lobulina. Estas frações se separam e acor o com as car as elétricas. Numa 2a fase, aplica n o um soro imune específico paralelo a ca a uma as frações e fazen o atuar a c orrente elétrica, vamos ter uma combinação e ca a fração anti ênica com o soro. Ocorre uma combinação e ca a fração anti ênica com o anticorpo correspon ente e, por sua vez, á-se a separação e outros componentes anti ênicos e a respecti va combinação com os anticorpos específicos e ca a sub-fração. Nesta nova fase po emos proce er a análise e ran e quanti a e e sub-frações combina as com os seus anticorpos específicos. Em Análises Clínicas este sistema foi substituí o por uma série e testes mo ernos, mais eficientes e e fácil realização, como os testes e imunoenzimático, fluorimétricos e outros que permitem separação os c omponentes como a cromato rafia em el e acrilami a. 147

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ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOASSAY) O ensaio e ELISA é um os tipos e teste mais empre a o nos laboratórios hoje e m ia, isto porque ele oferece simplici a e, sensibili a e e epen en o o kit a especifici a e superior a e vários testes. A meto olo ia este ensaio se mostr ou tão eficaz, que ele acabou substituin o os testes e Ra io Imuno Ensaio (RIE) , justamente por ser um teste mais estável e permitir o armazenamento o kit por um perío o bem maior sem que seus rea entes sofram e ra ação. Os testes e ELI SA po em ser classifica os em testes Homo eneos e Hetero eneos. Nos testes homo eneos, a ativi a e enzimática é altera a como parte e uma reação imunoló ica. N este tipo e ensaio não há necessi a e e separar o imunocomplexo forma o os im unorea entes livres. As técnicas homo eneas são especialmente elabora as para a osa em e ro as e haptenos, mas não tiveram seu uso ifun i o nos laboratórios e análises clíncas, já que este apresenta problemas na osa em e proteínas. P or outro la o, os ensaios hetero êneos são amplamente empre a os na imunolo ia. Neste tipo e ensaio, a ativi a e enzimática o imunorea ente marca o não está iretamente envolvi a na reação propriamente ita; no entanto, os rea entes li a os e os rea entes livres evem ser separa os uns os outros. ENSAIOS DE ELISA HETEROGENEOS O princípio básico o ELISA hetero êneo se baseia no uso e um antí eno ou anticorpo conju a o com uma enzima que, ao rea ir com s eu substrato, á ori em a um pro uto colori o, quimioluminescente ou fluorescent e. Se for usa o o méto o colorimétrico, a mu ança e cor é monitora a a olho nú ou com o uso e um espectrofotometro para eterminar a proporção entre a quanti a e e cor pro uzi a e a quanti a e e analito presente. Existe uma quanti a e e norme e materiais que po em ser usa os como suporte para a colocação o antí en o ou o anticorpo. O mais comum é se fazer uso e microplacas e poliestireno, p ois estas além e serem pequenas, evitan o esper ício e material, permitem que se faça a análise e uma ran e quanti a e e amostras. A técnica e ELISA hete ro enea, é feita com al umas etapas e lava em, como forma e separar os imunore a entes li a os os que não estão li a os. Está técnica permite ain a se fazer u so e ensaios competitivos e não competitivos, po en o ain a osar antí enos ou anticorpos, neste último caso, to os os isotipos e anticorpos po em ser osa os , tu o epen e a especifici a e o anticorpo usa o. 148

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Ensaios competitivos Normalmente este tipo e ensaio é usa o para se osar antí enos, neste caso eles possuem fixa os ao suporte sóli o anticorpos ou antí enos específicos. Estes méto os são também chama os e méto os e rea ente limita os, pois o antí eno e o anticorpo são usa os em quanti a es limita as. Quan o o ens aio usa um anticorpo específico fixa o na fase sóli a, se a iciona a amostra o paciente conten o o antí eno mais o antí eno marca o, com isso eles irão competi r pelo anticorpo fixa o na fase sóli a. Junto com a osa em a amostra o pacien te se proce e um controle o rea ente, on e se a iciona apenas o antí eno marca o junto com um tampão a fase sóli a, com isso se tem o parâmetro ne ativo para, assim, po e comparar com o resulta o obti o com a amostra o paciente. Isto é ne cessário, pois o sinal etecta o na amostra o paciente é iversamente proporcion al a quanti a e e analito presente na amostra, ou seja, quanto mais analito na amostra, menor o sinal. Existem variações o ensaio competitivo na qual o antí e no é fixa o na fase sóli a e o ensaio po e ser realiza o em uas etapas. Nesse c aso, numa primeira fase se a iciona o soro o paciente no suporte, incuba-se, po steriormente se proce e a lava em para a remoção e tu o que não ficou li a o ao suporte sóli o, e então se a iciona o conju a o, e proce e-se nova incubação. N esta etapa, o conju a o irá se li ar ao antí eno livre o suporte sóli o, poster iormente, se proce e uma nova lava em e executa-se a fase e revelação e leitura . Se compararmos os testes competitivos com os não competitivos, veremos que est es oferecem maior especifici a e e menor sensibili a e; no entanto isto é epen ente a afini a e e pureza os rea entes imunoló icos. Os ensaios competitivos s ão i eais para osa em e moléculas relativamente pequenas que po em ser obti as com relativa pureza em ran es quanti a es, a fim e serem marca as com uma enz ima. Como os ensaios competitivos requerem pequenas quanti a es e anticorpo, el es são i eais para o uso em sistemas que há pequenas quanti a es e anticorpo. Ensaios não competitivos in iretos Este tipo e ensaio é um os mais empre a os nos laboratórios e análises clínicas. Assim como os ensaios competitivos, eles po em usar antí enos ou anticorpos fixa os a fase sóli a. Quan o se faz uso e u m antí eno fixa o a fase sóli a, o anticorpo específico presente na amostra, se li ará a este. Posteriormente o anticorpo será etecta o com a a ição e uma imu no lobulina marca a específica para o anticorpo em questão. Para se etectar if erentes isotipos e imuno lobulina, lançase mão e imuno lobulinas marca as espe cíficas para um etermina o isotipo. Este tipo e ensaio é muito empre a o quan o se eseja etectar anticorpos para um etermina o a ente infeccioso ou auto an ticorpos. Para este tipo e teste, po e-se usar como suporte microplacas e poli estireno, nitrocelulose, esferas e microesferas. 149

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Quan o um anticorpo é li a o a fase sóli a, estes ensaios são classifica os e e nsaios e captura ou san uíche, pois o antí eno presente na amostra, que po e se r um anticorpo também, será captura o pelo anticorpo fixa o ao suporte sóli o. P osteriormente se a iciona um anticorpo marca o para um epítopo iferente o antí eno em questão, que completará o san uíche. Existem inúmeras variações este ti po e ensaio. O antí eno captura o po e ser uma imuno lobulina qualquer, uma pro teína viral ou um antí eno qualquer que tenha no mínimo ois epítopos iferentes . Este tipo e ensaio requer que uma ran e quanti a e e anticorpo esteja fixa a na fase sóli a, no entanto, oferece uma ran e sensibili a e. Os ELISAs não co mpetitivos po em ser mo ifica os para incorporar cama as a icionais e rea entes imunes, com isso se obtém o aumento na sensibili a e o ensaio, no entanto, ist o acaba influencian o no custo e no tempo e execução o teste. A aplicação mais comum é o complexo avi ina-biotina, que proporciona um aumento si nificativo na sensibili a e o teste. O anticorpo biotinila o é normalmente usa o como o se u n o anticorpo o san uíche. Ele então é posto para rea ir com uma mistura previa mente prepara a e avi ina e peroxi ase biotinila a. Esta peroxi ase po e ser e senvolvi a com a entes quimioluminescentes como forma e aumentar a sensibili a e. Outras variações o ELISA Uma as variantes o ELISA, é a que usa a membrana e nitrocelulose como suporte sóli o, ela é chama a e ensaio Dot Blot. Neste tipo e ensaio, o antí eno ou anticorpo é fixa o a membrana, e normalmente esta reaçã o é observa a pela pro ução e um pro uto colori o na membrana, este é apenas um ensaio qualitativo. Os ensaios e Dot Blot po em ser mo ifica os e forma a apr esentar uma maior sensibili a e e po em se tornar semi-quantitativos es e que s e use um ensitometro para ler a cor a reação.

Problemas na reação e ELISA São vários os problemas que po em aparecer num test e e ELISA, aqui estacaremos os mais comuns, sen o que na tabela a pá ina se u inte, estão representa os os que mais aparecem e a forma e tentar resolver. Um os problemas o ELISA é a li ação não específica a fase sóli a. Quan o ocorre a li ação não específica nestes ensaios, nós a etectamos justamente no controle o tampão, pois este acaba apresentan o um sinal eleva o (chama o e sinal e fu n o, ou ruí o pela literatura e lín ua in lesa), no controle o tampão e no con trole ne ativo a amostra. Só como esclarecimento, o controle o tampão, é aquel e que é feito se a icionan o apenas o tampão no lu ar a amostra o paciente, e to os os rea entes coloca os permanecem os mesmos. A absorbância estes controle s eve ser menor que 0,1 Uni a es e Desnsi a e Ótica (UDO), e preferência eve ser inferior a 0,05 UDO. Se a absorbância for maior que isto, eve-se verificar a etapa e lava em, se esta foi executa a no número 150

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correto e vezes ou ain a, se verificar o conju a o utiliza o. Como forma e cor ri ir o problema, a primeira tentativa e corri ir o problema é aumentan o o núm ero e lava ens. Caso isto não resolva o problema, a iluição e a pureza o conj u a o enzimático evem ser testa os. Se o conju a o não pu er ser iluí o, sem q ue isso afete a sensibili a e o ensaio, eve-se pensar em substituí-lo. Outra m aneira e resolver este problema é se a icionan o soro normal (1 a 5%), a mesma espécie usa a no conju a o, no tampão e iluição. Também po e-se usar BSA (Alb umina Bovina), na concentração e 1 a 5%, ou qualquer outra proteína inespecífic a para bloquear os sítios o suporte sóli o que não rea iram como forma e minim izar o problema. Problema Densi a e ótica o controle o PBS eleva o. Densi a e ótica o controle ne ativo eleva o. Solução possível Aumentar o número e lava e ns Bloquear os sítios a fase sóli a que não rea iram; aumentar a iluição o co nju a o; substituir o conju a o por um e maior pureza; a icionar e 1 a 5% e s oro normal a mesma espécie usa a no conju a o ao tampão e iluição; trocar o t ipo e suporte usa o. Controle positivo com valores baixos. Tenha certeza e que o suporte usa o é o correto; aumente a pureza o anticorpo ou o antí eno e ca ptura; aumente o tempo e ou a temperatura e incubação, verifican o antes se am bas estão corretas. Quan o a amostra está pouco iluí a, apresenta Dilua mais a amostra. um resulta o mo era o, no entanto quan o está muito iluí a apresenta u m valor fora a escala e leitura o aparelho. O ensaio apresenta valores baixos para tu o Verifique a inte ri a e o substrato e o tampão, (amostra e controle s). certifique-se que o pH o tampão também esteja correto; verifique o prazo e vali a e os rea entes e a forma como foram estoca os. Resulta o a amostra o paciente não está Procure pela presença e anticorpos heterófilos. con izente co m o histórico o mesmo. Outro problema que costuma ocorrer, é a alta absorbância o controle ne ativo ( eralmente acima e 0,2 UDO), al umas as causas po em ser as mesmas que ori inam a leitura acima e 0,1 UDO o controle o tampão e por isto as soluções a serem aplica as são as mesmas. No entanto isto po e não funcionar, neste caso o probl ema po e estar presente no antí eno e captura presente no 151

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suporte sóli o. Outras vezes o problema po e ser oriun o a presença e anticorp os heterófilos no soro controle, com a presença e anticorpos para rato, anticor pos para coelho, anticorpos para bovinos, etc. Neste caso se recomen a o tratame nto este soro com anticorpos ou proteínas a mesma espécie e animal e que são compostos os anticorpos e captura ou ain a, trocar o soro controle ne ativo. O utro problema que costuma aparecer nos testes e ELISA, principalmente nos teste s o tipo san uíche, é a obtenção e resulta os abaixo o espera o para uma amos tra e soro e um paciente com sintomatolo ia clínica efini a, neste caso, o qu e eve estar ocorren o é que o paciente apresenta altas taxas o analito no soro . O soro o paciente apresentará resulta os mo era os com a amostra não iluí a, mas assim que ela for iluí a, ela mostrará resulta os eleva os, che an o ao po nto e até superar a capaci a e e leitura o aparelho. A explicação este fenôm eno não pô e ser bem explica a até hoje. Parece que ela é causa a por que há um excesso e antí eno, no qual a maioria os sítios e li ação o antí eno estão p reenchi os, evitan o assim a formação o san uíche. Há também a teoria e que a presença e anticorpos e baixa afini a e, a lava em ina equa a e as concentraçõ es abaixo o ótimo o conju a o resultariam neste efeito. Al uns testes on e se observa este fenomeno são os testes e osa em a ona otrofina coriônica (hCG), marca ores tumorais, ferritina e anticorpos e antí enos presentes em oenças in fecciosas. O proce imento recomen ável para se evitar o efeito exposto acima, se ria o e se processar uas amostras o mesmo soro, uma sem iluir e outra iluí a, só que isto implica no fator custo e por isso, não é aplica o. Po e-se então tomar cui a o nas etapas e lava em, principalmente após a a ição e ca a antico rpo. Também o conhecimento o princípio o kit, e o material empre a o neste aj u a a resolver al uns os problemas que po em sur ir com ele. Quanto a presença e anticorpos heterófilos, estes po em ser encontra os com especifici a e para u ma série e proteínas animais (carneiro, cabra, coelho, rato, etc). No entanto o anticorpo heterófilo que parece promover maiores problemas nos ensaios são os a nticorpos para proteínas e ratos. Isto eralmente ocorre quan o o ensaio o tip o san uíche usa como anticorpo e captura e anticorpo e etecção, anticorpos mo noclonais pro uzi os em ratos. Com isto o resulta o po e se apresentar acima ou abaixo o espera o, an o resulta os falso positivos ou falso ne ativos respecti vamente. A estimativa e anticorpos para proteínas e ratos presente no soro nor mal varia e 0,5% até acima a casa os 40%, tu o epen e a sensibili a e o te ste. Um exemplo isto ocorre com pacientes com câncer que são trata os com antic orpos monoclonais pro uzi os em ratos, estes apresentam anticorpos para imuno lo bulinas e ratos e quanti a es ca a vez maiores se continuam com o tratamento. E nsaios tipo san uíche em que se a iciona o anticorpo e captura e etecção em um a única etapa são os que apresentam maior possibili a e e ar resulta os falso positivo. Por isso nem sempre evemos ter confiança em testes cujo o resulta o s ai rápi o. Existem várias técnicas para se re uzir a interferência provoca a por estes anticorpos heterófilos, entre estas temos o aquecimento a amostra a 70oC , precipitação com Poli Etileno Glicol 152

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(PEG) e o bolqueio com I G e rato. Deve-se tomar cui a o com o aquecimento a a mostra, pois isto, po e ar ori em a resulta os falso positivos. A forma mais co mum e tratamento tem si o a a ição e imuno lobulina não imune, no entanto a qu anti a e a iciona a e a fonte este soro evem ser observa as. Vários estu os e monstraram que o soro eve ser a mesma cepa e ratos assim como o anticorpo mon oclonal utiliza o. No entanto é recomen a o que se use um pool e soros monoclon ais e várias cepas e ratos. Na maioria os estu os se usou aproxima amente 10% e soro e rato junto com o tampão e reação, no entanto o soro e al uns pacie ntes requer que seja usa a uma quanti a e em torno e 25% e soro e um lon o per ío o e incubação afim e corri ir a interferência. Outro problema os laboratór ios quan o se proce e o ensaio e ELISA está na quantificação a I M com um anti corpo especifico para tal. Esta po e apresentar al uns problemas, como a presenç a e resulta os falso positivos evi o a presença o Fator Reumatói e (FR) na am ostra, que como já ito anteriormente é também uma I M. Resulta os falso ne ativ os também po em ocorrer evi o a competição a I G pelo mesmo sítio e li ação a I M. Uma as formas que simplificou a osa em a I M, foi o uso e ensaios e captura para a I M, neste caso se usa um anticorpo para I M fixa o no suporte só li o, então ao se a icionar o soro o paciente e se proce er a incubação, to a I M o soro o paciente é captura a. Posteriormente se a iciona um antí eno que s e li ará especificamente a I M. Finalmente se a iciona um anticorpo marca o iri i o ao antí eno previamente a iciona o. Este ensaio torna óbvio os problemas co m resulta os falso ne ativos evi o a inibição competitiva a li ação a I M ass im como to a a I G presente na amostra o paciente é lava a no primeiro passo. É claro que ain a po em ocorrer resulta os falso positivos evi o a li ação o FR que po e rea ir com a I G o conju a o ou se li ar a I G específica para o antí eno presente na amostra. Uma as formas e evitar este problema a li ação com o conju a o é se fazen o o uso e F(ab)2 como anticorpo e captura. Alternativam ente o ensaio po e ser mo ifica o para uma técnica ireta, se empre an o um antí eno marca o com uma enzima na se un a fase, esta forma eliminan o qualquer imu no lobulina que po eria se li ar ao FR. Se fazen o uso estas mo ificações prova velmente não teremos mais resulta os falso positivos, muito embora eles ain a po ssam ocorrer. Para sistemas em que não há isponibili a e os ensaios e captura para a I M, po e-se lançar mão e um ELISA in ireto com o antí eno imobiliza o na fase sóli a e o uso e um anticorpo específico para a I M na fase secun ária o teste. No entanto isto só po e ser feito se tivermos etapas para a ição a am ostra e os imunorea entes. Deste mo o evitaremos os resulta os falso positivos e falso ne ativos. Existem várias formas e se fazer isto. Também existem no mer ca o colunas capazes e separar a I G a amostra o paciente, e forma que obten hamos a I M pura e com a vanta em e não termos também o FR pois a I G presa na coluna a e como substrato para o mesmo. Também po e-se remover to a a I G a amo stra com a a ição e um prepara o anti-I G que a iria como a ente precipitante. O problema esta técnica é que não po emos arantir que to a a I G seja completa mente removi a a amostra se esta contiver ran es quanti a es e anticorpos pol iclonais. 153

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Além isso isto não elimina a presença o FR na amostra, que eve ser trata a pa ra a sua retira a. Esta po e ser removi a se a icionan o I G para que ela se a r e ue e assim precipite. Só que isto não irá eliminar o resulta o falso ne ativo evi o ao alto nível e I G específica presente na amostra. Para que o teste e ELISA forneça os resulta os entro os parâmetros eseja os, eve-se sempre ter os se uintes controles corren o junto com o ensaio: controle o PBS ou o tampão , controle ne ativo, controle positivo alto e baixo. No entanto, urante o teste po e-se a icionar outros controles como a a ição e amostras normais e pacient es e forma aleatória. Nos kits em que não se tem o número e controles esejáve is, po e-se a icionar controles internos compra os e laboratórios e confiança, incluin o-se aí controles ne ativo, e e novo positivo fraco e forte. Também po e-se fazer uso e um mesmo soro controle, o osan o pelo menos umas 20 vezes se ui as em ias iferentes, como forma e verificar se o ensaio se mantém preciso . 154

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IMUNOFLUORESCÊNCIA INTRODUÇÃO A fotoluminescência é o princípio a técnica e imunofluorescência no entanto, existem três tipos e fotoluminescência, os quais são: a fluorescência , a fosforecência e a fluorescência tar ia. Destes apenas a fotoluminescência e fluorescência interessam a nós. A fotoluminescência ocorre quan o moléculas são excita as pela interação os fotons com a ra iação eletroma nética. A fluorescên cia é a ra iação e ener ia que ocorre quan o uma luz e comprimento e on a cur to excita os eletrons e uma molécula e forma que elas tem o seu comportamento altera o. Conforme as moléculas fluorescêntes se tornam excita as, os eletrons p assam para um esta o e alta ener ia por um curto perío o e tempo, normalmente em nanose un os. A ener ia libera a é expressa na forma e luz e um comprimento e on a maior o que o a luz responsável pelo esenca ear o processo. Temos a in a a luminescência é a emissão e luz e uma substância excita a quimicamente que retorna a forma eletrônicamente excita a para o seu esta o normal. Descrito então o princípio básico as técnicas e fluorescência, passemos então as aplic ações a mesma. O teste e imunofluorescência é, atualmente, usa o em lar a esca la em uma série e enti a es patoló icas, tais como: oenças bacterianas, virais , protozooses, parasitoses e oenças imunoló icas iversas. Existem uas mo ali a es e testes e imunofluorescência, o méto o ireto e o in ireto. O méto o ir eto é aplica o nos casos em que temos e i entificar o micror anismo nas secreçõ es, em biópsias ou necrópsias. Para isso, eve-se ter o soro imune conju a o com fluoresceína ou ro amina para o a ente que se quer pesquisar. Este soro imune p o e ser policlonal ou monoclonal. Este último confere alta especifici a e ao tes te. O méto o in ireto presta-se muito bem ou para pesquisar o a ente etioló ico nas secreções, nos teci os (biópsias ou necrópsias) ou para se etectar anticorp os no soro o paciente. No caso e se pesquisar o micror anismo evemos ter o ma terial fixa o a uma lâmina. Este é trata o por um antissoro homólo o e, em se ui a, com uma lobulina conju a a com fluoresceína ou ro amina específica para aqu ele antissoro e ler ao microscópio fluorescente. Exemplifican o, se tomarmos um material e vesículas a pele para pesquisarmos Herpes simples, os tipos 1 e 2, everemos ter os antisoros para os ois tipos o vírus Herpes. O material fixa o em uma lâmina a equa a é ivi i o em ois campos e ca a campo trata o por um a ntissoro específico. Após isto, epositar sobre o esfre aço uma lobulina especí fica para o anticorpo usa o, conju a a com fluoresceína. Após a reação ler ao mi croscópio fluorescente. Haverá fluorescência no esfre aço quan o houver reação a ntí eno-anticorpo específico. 155

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Para pesquisarmos o anticorpo, evemos ter a lâmina com o micror anismo para o q ual se quer pesquisar o anticorpo. Depositar sobre o esfre aço o soro o pacient e, eixar rea ir e, posteriormente, colocar a lobulina anti-humana, eixar rea ir e examinar ao microscópio fluorescente. TIPOS DE MARCADORES O tipo e marca or usa o vai epen er as características qu e se eseja ter tais como: 1. Estabili a e por lon o perío o 2. Alta absortivi a e e bom ren imento 3. Absorção a luz num espectro visível 4. Não interferir co m a reação antí eno-anticorpo A se uir apresentamos uma lista os principais mar ca ores usa os nos ensaios e fluorescência, sen o que, o isotiocianato e fluor esceína e a ro amina são os mais usa os. Isotiocianato e Fluoresceína: É lar am ente usa o para a marcação e anticorpos e analitos. É um os que apresentam mel hor relação e absorção e emissão e luz, ocorren o em nanose un os. É uma moléc ula hi rofóbica e é exita a comprimento e on a próximo ao comprimento a luz em iti a. Fluorocromos e Ro amina: Os eriva os e Ro amina como a tetrametilro am ina possuem a emissão num comprimento e on a maior que o o isiotiocianato e f luoresceína. Os eriva os e ro amina po em ser usa os junto com o isotiocianato e fluoresceína fornecen o assim ima ens multicolori as, em eral isto é feito nos citometros e fluxo, e no sequenciamento e DNA. Ficobiliproteínas: Estas pr oteínas são encontra as em al as e tomam parte no processo e fotossintese. As p rincipais classes e ficobiliproteínas são as Ficoeritrinas, Ficocianinas e as A loficocianinas. A emissão e luz por estes compostos é cerca e 30 vezes maior q ue o a fluoresceína e por isto vem se tornan o ca a vez mais usa a nos imunoens aios. Marca ores fosforecentes: Estes apresentam a vanta em e ser muito sensíve is sem, contu o, promover o sinal e fun o in eseja o, ou seja, emitir luz sem q ue haja a presença o que se eseja observar. Al uns os marca ores fosforecente s são a Eritrosina (tetrahi rofluoresceína), eosina 5’ isotiocianato e metalopro teínas. Quelatos e terras raras e criptatos: Os quelatos e terras raras como o s quelatos e lantaní eos apresentam a emissão e fluorescência por um perío o b astante lon o e por isto são os preferi os nas reações que se asta muito tempo para fazer a leitura. Os criptatos e terras raras também são usa os nas reações que se eseja uma fluorescência ura oura. Umbeliferona: é um rea ente que não apresenta a mesma resolução que o isotiocianato e fluoresceína, e por isto não é tão usa o. 156

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PROBLEMAS NOS IMUNOENSAIOS Os problemas mais comuns nos imunoensaios se referem a sensibili a e o ensaio que po e ser afeta a pela concentração o analito pres ente na amostra em estu o. Al uns os problemas se referem a ispersão e luz na s soluções conten o altas concentrações e proteínas e partículas coloi ais, flu orescência e fun o evi o a presença e múltiplos compostos or ânicos na amostr a ou impurezas nos rea entes, ou a não fluorescência evi o a li ação e proteín as não específicas, mu anças o pH, ou interferência e compostos químicos. O pr é tratamento o soro com substâncias proteolíticas, oxi antes ou rea entes esna tura ores como peráci os, po em aju ar a eliminar a fluorescência e fun o. TÉCNICAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 1 - Imunofluorescência Direta a) Material necessá rio: - Lâmina limpa com elimitações circulares para se colocar o antí eno; - Ta mpão e fosfato pH 7,2; - Antí eno particula o. No caso os vírus usaremos célul as infecta as; - Soro imune específico conju a o com fluoresceína; - Micropipeta s e 10, 20 e 25 µl; - Pipetas e 5 ml; - Glicerina alcalina; - Microscópio epif luorescente. b) Técnica: Vamos supor que se queira pesquisar Herpes vírus num raspa o e vesí cula e pele. Em uma lâmina limpa elimita a com círculos, colocar o material em 3 ou 4 círculos, eixar secar ao ar e fixá-lo com acetona ela a. Após isto, co locar sobre o esfre aço antissoros específicos para vírus Herpes tipos 1 e 2, e preferência monoclonais, conju a os com fluoresceína. Incubar as lâminas em amb iente úmi o a 37°C por 30 a 40 minutos. Lavar com tampão e fosfato pH 7,2. Seca r, cobrir com licerina alcalina e ler no microscópio epifluorescente. Se por ex emplo, houver fluorescência no esfre aço em que foi coloca o o antissoro, o víru s implica o será o Herpes o tipo 1 ou 2. Observação: Ain a não temos testes sor oló icos específicos para iferenciar o Herpes 1 o 2, mas temos estu os em an a mento. 2. Imunofluorescência In ireta 157

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a) Pesquisa o micror anismo ou o elemento que se eseja no material o pacient e, tais como: secreções, teci os, etc. - Fazer o esfre aço como no processo ire to; - A icionar o soro imune específico para o micror anismo que se suspeita e eseja i entificar. Esperar 30 a 40 minutos, incuban o a 37°C em câmara úmi a. Ap ós este tempo lavar a preparação a fim e remover o que não rea e; - Secar a lâm ina, com auxílio e um seca or e cabelo e cobrir o esfre aço com lobulina anti -humana, conju a a com fluoresceína. Incubar a 37°C por 30 a 40 minutos em câmar a úmi a. Após este tempo, lavar com á ua estila a ou com tampão pH 7,2, bastan o otejar sobre a lâmina o líqui o por ½ minuto; - Secar, usan o o ar aqueci o e um seca or e cabelo, cobrir o esfre aço com licerina alcalina e examinar ao microscópio epifluorescente. Não há necessi a e e cobrir com lamínula. b) Pesquisa e anticorpo no soro - O esfre aço o micror anismo eve ser feito e m lâmina elimita a com círculos. O antí eno é fixa o como foi explica o anterio rmente; - No caso e se esejar eterminar o título e anticorpos no soro, ilui r este sucessivamente e colocar 5 µl e ca a iluição nos círculos conten o o an tí eno. Incubar a 37°C por 30 minutos em câmara úmi a; - Lavar com tampão pH 7,2 otejan o o líqui o sobre a lâmina por 1 minuto, secá-la com ar aqueci o, usan o seca or e cabelo; - Cobrir os esfre aços com lobulina anti-humana conju a a com fluoresceína na iluição fixa etermina a na pa ronização. Neste caso po emo s empre ar ama lobulina total (I G, I M, I A), só I M ou só I G, epen en o a finali a e o ia nóstico. Incubar por 30 a 40 minutos. Após este tempo, lavar como anteriormente; - Secar e cobrir a preparação com licerina alcalina; - Ler no microscópio epifluorescente. Não haven o fluorescência si nifica reação ne at iva. Se o soro examina o contiver anticorpos vai haver fluorescência até etermi na a iluição. Vamos supor que houve fluorescência até 1/640, esta iluição corr espon e ao título o soro. 158

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Observações importantes: a) Em to os os testes temos que usar sempre um soro pos itivo para termo e comparação, e preferência com título conheci o; b) Em caso e úvi a a imuno lobulina eve ser sempre retitula a. Para isto basta proce er a se uinte maneira: - Tomamos como exemplo o teste para o Toxoplasma. - Em uma lâmina conten o o esfre aço com o antí eno e Toxoplasma on ii, a icionar, em c erca e 12 círculos conten o o esfre aço, uma iluição fixa e soro humano conte n o anticorpos para T. on ii. Por exemplo, se tivermos um certo soro com o títu lo para T. on ii e 1/4096, fazer uma iluição este a 1/512 e a icionar o soro assim iluí o em to os os orifícios a lâmina. Incubar por 30 a 40 minutos a 37 °C, em câmara úmi a. Após isto, lavar e secar como escrito anteriormente. - Pre parar iluições sucessivas a imuno lobulina conju a a que se eseja eterminar o título. A icionar 10 µl a ca a iluição o soro nos círculos separa os a lâmi na, incubar 30 a 40 minutos a 37°C em ambiente úmi o. Lavar, secar e a icionar licerina alcalina. Ler ao microscópio epifluorescente. - Leitura: Se a fluorescê ncia ocorreu até a iluição e 1/320, esta iluição correspon e ao título a imu no lobulina. Para uso po e-se iluir a 1/160 a fim e obter uma boa mar em e se urança nos testes. PREPARO DOS REAGENTES 1 - Tampão e fosfato - PBS (Phosphate Buffer Saline), 0,0 1 M e pH 7,2 Na2HPO4 ........................................................... ..........12,0 NaH2PO4.H2O ................................................... ............2,2 NaCl ......................................................... ....................85,0 Á ua bi estila a q.s.p. ............................. ................1000,0 ml Esta solução é 10 vezes concentra a e eve ser uar a a em lea eira a 4°C, a icionan o à mesma azi a só ica na preparação e 1/1000. Para uso, iluir 1/10 em á ua estila a pH 7,0. 2 - Solução Tampão e Carbonato - Bicarbonato e Só io a 0,5 M e pH 9,5 (Esta solução é para alcalinizar a lice rina) Solução A Na2CO3 ......................................................... ............5,3 Á ua bi estila a q.s.p. ...................................... .....100.0 ml Solução B NaHCO3 ................................................. ..................4,2 Á ua bi estila a q.s.p. ................................ .........100,0 ml Para o uso, misturar 1 volume e A e ois e B. Esta mistura é a solução 2, usa a na alcalinização a licerina. 159

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3 - Glicerina alcalina Glicerina p.a. .......................................... ...........9 volumes Solução 2 ................................................. .........1 volume Conservar em ela eira. Esta licerina alcalina é usa a nas pr eparações a imunofluorescência e a sua função é excitar a fluorescência quan o os raios ultravioletas inci em na preparação. 4 - Solução e azul e Evans Azul e Evans ........................................................10,0 m PBS pH 7,2 q.s.p. .................................................100,0 ml Esta soluçã o é mistura a ao conju a o na concentração e 0,1 ml para 1 ml e conju a o ilu í o. A função o azul e Evans é a e suprimir a fluorescência inespecífica eix an o apenas a reação específica. Quan o se trata o teste com este corante to o o campo fica e cor vermelha, sobressain o a fluorescência. Observação importante : Ao preparar o PBS eve-se usar á ua estila a ou bi estila a com pH neutro. No rmalmente o pH a á ua estila a é e 5,0 a 5,5. Deve ser neutraliza o com soluç ão e hi róxi o e só io normal. O PBS iluí o para os testes e imunofluorescên cia eve ser sempre recente. Mesmo conserva o em ela eira não po e ser usa o ap ós uma semana e prepara o. O tampão velho sempre interfere nos testes e fluore scência, ne ativan o a reação ou baixan o o título e anticorpos.

MICROSCÓPIO Existem ois tipos e microscópio fluorescentes, o hipofluorescente, ultrapassa o e o epifluorescente. No Microscópio hipofluorescente, como o própr io nome iz, si nifica que a luz ultravioleta entra por baixo atravessan o o con ensa or, atravessa a lâmina para epois sensibilizar o objeto a ser examina o. Para se usar este tipo e microscópio a lâmina a preparação tem que ser e vi r o muito bom e fina, a fim e não haver muita per a os raios UV. Por outro la o, na hora a leitura eve-se colocar entre a lâmina e o con ensa or uma ota e ó leo e ce ro especial para fluorescência. Este óleo tem a finali a e e preenche r o espaço que existe entre o con ensa or e a lâmina a preparação a fim e não haver per a e ispersão os raios UV. Este óleo funciona mal, porque além e suj ar o microscópio não permite movimentar muito a lâmina. Por esta ificul a e o n úmero e testes realiza os em microscópio este tipo é muito baixo. Resumin o, é um equipamento ultrapassa o. Por outro la o, eve-se sempre mu ar os filtros e UV com iferentes cores e espessuras. De um mo o eral, neste caso preferem-se o BG12. O Microscópio epifluorescente a luz sai a objetiva e inci e iretamente sobre o objeto. Neste caso não há necessi a e e óleo nem e lâminas especiais. Não há per a os raios UV e a lâmina po e 160

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ser movimenta a livremente. A capaci a e e trabalho é muito alta e proveitosa. Os microscópios este tipo já têm filtros embuti os, não haven o necessi a e e troca. Lâmpa as usa as As melhores são as e mercúrio existin o e capaci a es iferentes, epen en o o aparelho. As mais usa as são: HBO200, HBO100 e HBO50. T ambém são usa as lâmpa as e halo ênio, estas uram mais, mas a sensibili a e é baixa, principalmente, quan o se usa conju a o com ro amina. QUIMIOLUMINESCÊNCIA As moléculas quimioluminescentes são usa as em ensaios iret os ou in iretos como substratos para enzimas em ensaios imunoenzimáticos, aliás, o principio os ensaios e quimioluminescência é o mesmo os ensaios e ELISA. A emissão e luz nos ensaios quimioluminescentes se á quan o uma molécula sai o seu esta o excita o para o seu esta o normal, mas a quimioluminescência ifere a imunofluorescência pois a reação ocorre evi o a uma reação química e não e vi o a excitação luminosa. A maioria as reações e quimioluminescência ocorrem evi o a uma reação e oxi ação, que faz com que ocorra a exitação e uma molécu la e assim que ela retorna ao seu esta o normal emite uma certa quanti a e e lu z visível. O ren imento os ensaios e quimioluminescência é inferior a 10% no e ntanto isto não torna a reação inviável. A emissão e luz é etecta a por aparel hos chama os e Luminometros, estes aparelhos po em utilizar como etectores um tubo fotomultiplica or, sensor fotoelétrico, io o e silicone ou filme foto ráf ico. Al umas as reações e quimioluminescência envolvem a reação o Luminol com peróxi o e hi ro enio e peroxi ase an o como pro uto o isoluminol, a oxi ação o Ester e acri ina pelo peróxi o e hi ro enio ou a ecomposição o A amantil 1,2 ióxi o etano aril fosfato pela Fosfatase alcalina. Estas reações são altam ente sensíveis e a emissão e luz estas po e ocorrer como um rápi o flash ou te r uma emissão prolon a a que po e permanecer por horas. A reação com o ester e acri ina, por exemplo, é uma reação muito rápi a, que emite um flash e luz muit o curto, varian o e 300 nanose un os até 2 se un os, já a reação com o luminol po e urar até 2 minutos, assim como a reação com o A amantil 1,2 ióxi o etano aril fosfato. Os ensaios e quimioluminescência são classifica os em ensaios Het ero êneos e Homo êneos. Ensaios Hetero êneos O marca or mais comum neste tipo e ensaio é o ester e acri ina, ele po e ser usa o como marca or e antí enos ou anticorpos, es e que se use conju a ores químicos como a carbo iimi a ou a mist ura e ani ri os. 161

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Costuma-se usar micropartículas ma néticas como fase sóli a nos ensaios em que s e usa o ester e acri ina. Neste caso se costuma proce er a incubação o soro em um suporte sóli o, conten o ao antí eno, posteriormente se a iciona o conju a o com o ester e acri ina, proce e-se nova incubação e finalmente se revela a rea ção com a a ição e peróxi o e hi ro enio para pro uzir a luz numa fração e na nose un os. Esta reação po e sofrer interferência no pH alcalino pois os anions OH po em rea ir com ester e acri ina bloquean o o ataque o HO2 e assim evitan o a ecomposição o ester. Esta reação in esejável po e ser evita a se pré incub an o o soro com o conju a o no pH enter 5 e 7. Como a reação com ester e acri i na é muito rápi a, ela só é realiza a quan o o tubo com o material em estu o est á frente ao etector o aparelho. O limite e etecção com o ester e acri ina é e 0,5 amol. O Luminol também po e ser usa o neste tipo e etecção, no entanto ele é menos eficiente, para iminuir esta eficiência passou-se a usar eriva o s este como o Isoluminol (aminobutil N-etil isoluminol), que oferce o limite e etecção na casa os 50 amol. Ensaios homo eneos Neste tipo e ensaio, a li açã o o anticorpo a um antí eno marca o com um composto quimioluminescente acaba mo ulan o a emissão e luz, uma vez que é possível istin uir entre o anticorpo li a o ao conju a o e o não li a o, sem que seja necessário separa-los, isto acont ece porque a emissão e luz o conju a o li a o ao anticorpo po e ser maior ou m enor que a o conju a o livre, epen e o marca or usa o no conju a o. Como exem plo temos um teste em que se osa a pro esterona com o uso e conju a os com o i soluminol, quan o este conju a o se li a especificamente a anticorpos para a pro esterona, ocorre o aumento e intensi a e e luz em até 4 vezes. Outro exemplo, está em al uns kits que osam anticorpos para o cortisol, fazen o uso e conju a os e cortizol com isoluminol, quan o este conju a o se li a ao anticorpo espe cífico, ocorre uma que a na emissão e luz pelo isoluminol. Também existem ensai os em que se faz a transferência e ener ia entre uma molécula marca ora oa ora e aceptora. Um exemplo isto está em ensaios que se uso o Isoluminol como a fon te e exitação e ener ia para um marca or e fluoresceína. Neste caso, supon o que o ensaio seja feito para a etecção e um antí eno, usa-se um anticorpo marc a o com fluoresceína para se li ar ao antí eno específico e outro conju a o, só que este será o antí eno marca o com o luminol. O que vai ocorrer então é a comp etição o antí eno não marca o com o marca o pelo anticorpo marca o com a fluore sceína. O isoluminol sozinho emite a luz num comprimento e on a e 460 nm, quan o ele está li a o com a fluoreceína ele emite luz no comprimento e on a e 525 nm. A mé ia a taxa e emissão e luz obti a, quan o compara a com um pa rão é que irá fornecer qual a quanti a e e antí eno presente na amostra. Este princip io vem sen o aplica o em kits para a etecção e pro esterona, AMP ciclico e imu no lobulinas as classes G e M. TESTE DE WESTERN BLOT 162

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INTRODUÇÃO Atualmente, a técnica e Western Blot (WB) tem si o utiliza a para estu os etal ha os e uma série e micror anismos incluin o bactérias, vírus e protozoários. Para ca a micror anismo há pequenas variações no tocante ao preparo os rea ente s, mas o fun amento a reação é o mesmo. Este teste tem muita semelhança com o E LISA, mu an o apenas o suporte anti ênico que é feito em papel e nitrocelulose. Como pa rão aremos o exemplo a obtenção os rea entes, monta em e utilização o teste para Vírus a Imuno eficiência A quiri a (HIV). Com este exemplo, a com preensão o teste ficará bem clara. A técnica e Western Blot teve sua ori em na meto olo ia esenvolvi a em 1975 por E.M. Southern, que utilizan o eletroforese em el e poliacrilami a realizou a separação e proteínas por peso molecular e m um estu o e hibri ização DNA-RNA. Este trabalho foi acompanha o, em 1977, pel a emonstração por Van Raams ork e uma técnica para a etecção e eterminantes anti ênicos, em moléculas separa as por peso molecular, em el e poliacrilami a, através e um teste imunoenzimático utilizan o a enzima peroxi ase. Finalment e Harry Towbin, em 1979, emonstrou a possibili a e e transferir as moléculas s epara as em el e poliacrilami a para folhas e nitrocelulose, facilitan o a ma nipulação as proteínas em uma matriz mais resistente. A união estas três meto olo ias formam a técnica e enzyme-linke immunoelectrotransfer blot assay ou té cnica e Western Blot. A técnica e Western Blot é composta e quatro está ios: 1o está io - Eletroforese em el e poliacrilami a No primeiro está io a prepara ção purifica a e HIV-1 é submeti a a eletroforese em el e poliacrilami a, hav en o a separação por peso molecular os componentes anti ênicos virais que forma m ban as e proteínas na matriz o el. 2o está io - Transferência as ban as O material anti ênico viral separa o é transferi o o el e poliacrilami a para f olha e nitrocelulose que é então corta a em tiras, conten o os componentes o v írus separa os em ban as. 3o está io - Reação antí eno-anticorpo As tiras e nit rocelulose, conten o os antí enos virais, são coloca as em contato com os soros os pacientes e soros controles. Os anticorpos séricos específicos para os compo nentes virais, irão rea ir com as respectivas ban as, forman o complexos antí en o-anticorpo macromoleculares, que ficam reti os nas tiras e nitrocelulose. 163

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4o está io - Revelação os complexos antí eno-anticorpo A revelação os complexo s antí eno-anticorpo é realiza a através a utilização e um conju a o constituí o e anti-imuno lobulina humana marca a com uma enzima e o substrato enzimático .

METODOLOGIA 1 - Preparação o antí eno Normalmente o antí eno utiliza o na técni ca e Western Blot é prepara o a partir e cultura e linfoblastos humanos infec ta os com HIV-1 e estimula os com fitohema lutinina. Após aproxima amente seis ias e cultura, quan o o sobrena ante a cultura apresenta pico e pro ução e v írus, etermina o pela ativi a e e transcriptase reversa, a cultura é submeti a a centrifu ação para a remoção as células linfoblásticas. O líqui o sobrena an te, rico em partículas virais, é então submeti o a ultracentrifu ação em ra ien te e sacarose, para a obtenção e massa viral purifica a. A massa obti a é entã o ressuspensa em tampão tris-HCl 0,1 M pH 8,0 conten o uo ecil sulfato e só io e 2-mercaptoetanol, e após aquecimento é titula a para a pa ronização a técnic a. 2 - Eletroforese em el e poliacrilami a A separação eletroforética e proteína s epen e a car a eletrostática, o peso molecular e a confi uração tri imensi onal as moléculas protéicas. O tratamento as proteínas virais, com uo ecil su lfato e só io, elimina a interferência a car a eletrostática, por tornar as pr oteínas ne ativamente carre a as. A utilização e a entes re utores, como o 2-me rcaptoetanol, promove a quebra as pontes issulfeto as proteínas lobulares, a lteran o a estrutura tri imensional, e forma que to as as proteínas virais pass am a ter a mesma confi uração espacial. O tratamento a amostra viral com o ete r ente uo ecil sulfato e só io e o a ente re utor 2-mercaptoetanol, elimina a interferência a car a eletrostática e a confi uração tri imensional as proteí nas, permitin o a separação eletroforética apenas pelos iferentes pesos molecul ares as proteínas que constituem o HIV-1. O el e poliacrilami a forma o pela polimerização, evi o a reação entre a acrilami a e a bis-acrilami a, forman o u ma re e tri imensional, sen o a ensi a e esta re e etermina a pelas concentra ções e acrilami a e bis-acrilami a. A concentração a acrilami a etermina a po rosi a e o el e, por conse uinte, a veloci a e com que as proteínas e iferen tes pesos moleculares mi ram no el quan o submeti as à corrente elétrica. A con centração e bis-acrilami a é responsável pela elastici a e e resistência o el . Ao mesmo tempo em que as proteínas virais são aplica as no el e poliacrilami a, uma solução e proteínas e pesos moleculares conheci os é também aplica a, sen o separa as em ban as que servem como pontos e calibração, para estimular o peso molecular as ban as e proteínas virais. 164

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3 - Transferência para nitrocelulose Após a separação eletroforética os antí en os virais, as ban as protéicas são transferi as o el e poliacrilami a para a matriz e nitrocelulose. A folha e nitrocelulose é coloca a sobre a superfície o el, e o sistema é submeti o a eletroforese, sen o a corrente elétrica iri i a o el para a folha e nitrocelulose. As ban as protéicas são então transferi as para a folha e nitrocelulose, manten o o pa rão e ban eamento obti o pela eletroforese no el e poliacrilami a. A folha e nitrocelulose é corta a em fit as, que conterão as ban as protéicas virais.

4 - Reação para evi enciação e anticorpos para HIV-1 As fitas e nitrocelulose conten o os antí enos virais, separa os por peso molecular, são expostas aos sor os os pacientes e soros controles positivo e ne ativo. Os anticorpos séricos pa ra as iferentes proteínas virais irão rea ir com as respectivas ban as, forman o complexos macromoleculares que permanecem fixa os à fita. Posteriormente, as f itas são lava as para retirar os anticorpos inespecíficos, que não rea em com os componentes virais. 5 - Revelação a reação As fitas são expostas a um conju a o, sen o normalmente utiliza a a anti-imuno lobulina G humana marca a com enzima que po e ser a perox i ase. O conju a o rea e com o complexo antí eno-anticorpo fixa o na fita e nit rocelulose. Após a lava em a fita, para retirar o conju a o não complexa o, é a crescenta o o substrato enzimático, que no caso a peroxi ase é representa o pel o peróxi o e hi ro ênio e uma substância cromó ena como a iaminobenzi ina. Há o aparecimento e ban as cora as na re ião on e ocorreu a reação o anticorpo co m o componente protéico viral. BIBLIOGRAFIA McDonnell, W.M., Askari, F.K., 1997. Immunization. JAMA 278(22):200 0-2007. Fiel s, B.N., 1996. Virolo y Lippincott- Raven Publishers Rueckert, R.R. Picornaviri ae: The viruses an their replication. em Fiel s, B.N., 1996 Virolo y. Lippincott- Raven Publishers Vol.1: 609-654

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