Sintesis triasilgliserol (TAG) adalah jalur metabolik fundamental yang penting untuk penyimpanan energi dan

pemanfaatan, penyerapan nutrisi, menyusui, dan metabolisme fosfolipid (1-4). Pada mamalia, ada dua jalur
biokimia utama untuk biosintesis : jalur monoasilgliserol (MAG), memainkan peran penting dalam
penyerapan nutrisi di usus kecil, dan jalur gliserol-3-fosfat (G3P) , bertanggung jawab untuk Mayoritas sintesis
de novo TAG. Asil CoA: gliserol-3-fosfat acyltransferase (GPAT, EC 2.3.1.15) mengkatalisis langkah awal
sintesis de novo TAG dengan mengkonversi G3P untuk asam lysophosphatidic (LPA). LPA kemudian terasilasi
untuk membentuk asam fosfatidat, diikuti oleh defosforilasi ke diasilgliserol (DAG). Jalur MAG dan G3P
berbagi langkah umum terakhir, konversi DAG ke TAG, dikatalisis oleh asil-CoA: DAG acyltransferase
(DJPU). Pada mamalia, aktivitas GPAT ada di beberapa isoform, yang dapat dibedakan dengan lokalisasi
subselular (mitokondria vs mikrosomal), kepekaan terhadap N-ethylmaleimide (NEM), dan preferensi substrat
(1, 2, 5). Gen pengkodean GPAT1 NEM-tahan mitokondria pada mamalia (mtGPAT1, GPAM) diidentifikasi
satu dekade yang lalu dan memainkan peran kunci dalam sintesis TAG di hati (6-8). Meskipun laporan awal
menunjukkan bahwa kekurangan mtGPAT1 pada tikus telah menurunkan massa jaringan adiposa (6), penelitian
terbaru menemukan sedikit efek kekurangan mtGPAT1 pada pengembangan obesitas (7). Sangat mungkin
bahwa GPAT isoform selain mtGPAT1 berkontribusi pada lipogenesis dalam jaringan adiposa. Aktivitas
mikrosomal GPAT NEM-sensitif pada mamalia ditunjukkan untuk memperhitungkan 80-90% dari total
aktivitas GPAT di sebagian besar jaringan dan 50-80% dari aktivitas total dalam hati (1). Berbeda dengan
peningkatan relatif sederhana pada aktivitas GPAT mitokondria, aktivitas mikrosomal GPAT secara dramatis
diinduksi selama diferensiasi adiposit (8, 9). Meskipun upaya yang cukup besar telah dilakukan untuk
memurnikan microsomal GPAT dari berbagai spesies (10-13), gen (s) yang mengkode aktivitas GPAT NEMsensitif dalam jaringan mamalia belum diidentifikasi.
Di sini, kami melaporkan identifikasi gen manusia dan tikus pengkode protein mikrosomal dengan aktivitas
GPAT. Kami menunjukkan bahwa overekspression gen confers aktivitas GPAT NEM-sensitif dan meningkatkan
pembentukan TAG. Kami juga menunjukkan bahwa gen ini diekspresikan dan diatur dengan cara menunjukkan
peran penting dalam lipogenesis, dan bahwa gen tikus mengkodekan sebagian besar aktivitas GPAT di 3T3-L1
adiposit. Temuan kami membuka pintu untuk in vivo menyikapi peran mikrosomal GPAT dalam fisiologi
normal dan di negara-negara penyakit patologis.
Hasil
Identifikasi Gen Calon mikrosomal GPAT. Untuk mengidentifikasi gen yang mungkin mengkodekan
aktivitas GPAT mikrosomal, kami menggunakan kriteria sebagai berikut: (i) gen harus menjadi anggota dari
keluarga acyltransferase, (ii) mRNA harus berlimpah diekspresikan dalam jaringan di mana gliserolipid secara
aktif dimetabolisme, (iii) mRNA harus diatur up-selama 3T3-L1 diferensiasi adiposit (8, 9), dan (iv) massa
molekul dihitung mungkin _45 kDa (13). Menggunakan urutan benih-alignment berasal dari penelitian
sebelumnya dijelaskan bahwa motif glycerolipid acyltransferase (PF01553) (1), kami melakukan pencarian
urutan homologi dari database publik, yang dihasilkan sebuah kumpulan data acyltransferase. Secara paralel,
kami menggunakan profil transkripsi untuk mengidentifikasi gen diatur up-selama 3T3-L1 diferensiasi adiposit
dan sangat disajikan dalam jaringan adiposa. Perbandingan dari dua set data mengidentifikasi sebuah gen tikus
sebelumnya berkarakter (Gen Bank aksesi tidak ada NM_172715.), Memenuhi semua empat kriteria yang
tercantum di atas. Sebuah gen manusia terkait erat, MGC11324 (GenBank aksesi tidak ada NM_032717.), Juga
diidentifikasi. Gen ini ditunjuk dalam penelitian ini sebagai tikus GPAT3 dan GPAT3 manusia (mGPAT3 dan
hGPAT3) . Mouse dan gen manusia mengkodekan 438- dan 434-aa protein, masing-masing, berbagi 95%
identitas [pendukung informasi (SI) Gambar. 8]. Kedua protein diperkirakan menjadi protein membran integral
dengan setidaknya dua domain transmembran (Gbr. 8) dan mengandung semua empat motif acyltransferase
dilestarikan dalam domain 133-aa seperti diungkapkan oleh perbandingan dengan mtGPAT1 dan asil-CoA-asilgliserol-3- acyltransferase fosfat 1 (AGPAT1) (Gambar. 1). Meskipun Kehadiran motif acyltransferase, hGPAT3
dan mGPAT3 memiliki _15% identitas urutan dengan mtGPAT1 dan sebelumnya diidentifikasi ragi dan
tanaman GPATs (14, 15) (data tidak ditampilkan).
Demonstrasi GPAT Kegiatan. Untuk menentukan apakah gen baru diidentifikasi menyandi protein dengan
aktivitas GPAT, kita diekspresikan asli dan N-terminal Flag-tag mGPAT3 dan hGPAT3 di Sf-9 sel. Analisis
Western blot menggunakan anti-FLAG antibodi dikonfirmasi ekspresi dan menunjukkan massa molekul jelas
_50 kDa untuk kedua protein, konsisten dengan massa molekul prediksi 49,9 dan 49,5 kDa (Gambar. 2A).
Kegiatan GPAT awalnya dinilai dalam lisat sel dengan menggunakan metode ekstraksi konvensional yang
mengukur penggabungan [3H] G3P menjadi produk butanol-diekstrak (8, 16).

digunakan lauroil-CoA sebagai donor asil, karena rekombinan mtGPAT1 menunjukkan preferensi untuk
lauroil-CoA lebih spesies asil-CoA lagi (data tidak ditampilkan) . Lysates dari Sf-9 sel overexpressing mGPAT3
atau hGPAT3 menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam pembentukan lipid radiolabeled butanoldiekstrak, dibandingkan dengan sel tipe liar atau sel yang mengekspresikan DGAT1 manusia (Gambar. 2B).
Untuk langsung menunjukkan pembentukan LPA, produk dari reaksi GPAT, kami dipisahkan lipid dengan
kromatografi lapis tipis (TLC). Menggunakan [14C] G3P sebagai substrat radiolabeled, pembentukan LPA
ditingkatkan 2.5- dan 4.2 kali lipat di lysates dari sel yang mengekspresikan mGPAT3 dan hGPAT3 (Gbr. 2C
Kiri). Demikian pula, dengan menggunakan [14C] lauroil-CoA sebagai substrat radiolabeled, pembentukan
LPA meningkat 1.8- dan 3.0 kali lipat, masing-masing (Gambar. 2C kanan). Tidak ada pembentukan LPA
diamati pada sampel kurang salah satu dari substrat ('' -Acyl- CoA '' dan '' -G3P '' jalur, Gambar. 2C). Pemisahan
TLC juga menunjukkan adanya beberapa lipid non-LPA berasal dari baik [14C] G3P atau [14C] lauroil-CoA
(misalnya, band atas pada Gambar. 2C), yang dapat mewakili produk enzim endogen dalam sel serangga.
Kehadiran lipid non-LPA di butanol ekstrak kemungkinan account untuk latar belakang yang lebih tinggi dan
penurunan sensitivitas dari metode ini. Dengan demikian, aktivitas GPAT dinilai dengan TLC pemisahan dalam
semua percobaan berikutnya. Pembentukan LPA meningkat secara substrat konsentrasi-dependent untuk kedua
[14C] G3P dan lauroil-CoA dan secara signifikan lebih tinggi pada sel-hGPAT3 mengekspresikan dibandingkan
dengan kontrol pada semua konsentrasi yang diuji (Gambar. 2D). pembentukan LPA hGPAT3-dependent
menurun pada konsentrasi yang sangat tinggi dari (2D Gambar.) asil-CoA, mirip dengan apa yang telah
dilaporkan untuk mtGPAT1 (8). Peningkatan hGPAT3-dependent maksimal dalam pembentukan LPA
berhubungan dengan _100 pmol / menit per mg protein dengan aktivitas setengah-maksimal mencapai
at_25_MLauroyl-CoA and_80_MG3P (Gambar. 2D). Hal ini penting untuk dicatat bahwa uji kami dilakukan
dengan menggunakan sistem nonpurified; variasi dalam aktivitas dan lipatan meningkatkan (2.5 hingga 10 kali
lipat; rata 6 kali lipat) antara percobaan mungkin mencerminkan perbedaan tingkat ekspresi antara persiapan
yang berbeda. Kami juga diekspresikan hGPAT3 dalam sel HEK293 dan melihat yang sama, meskipun rata-rata
kurang-jelas, peningkatan pembentukan LPA dibandingkan dengan sel kontrol (peningkatan _3 kali lipat; _100
pmol / menit per mg) (2E Kanan Gambar.). Yang penting, kali lipat diamati pada GPAT3 berlebih adalah
sebanding dengan yang diamati dengan mtGPAT1 (2.7- vs 3,8 kali lipat; 2E Kanan Gambar.). Kegiatan
mikrosomal GPAT telah terbukti peka terhadap NEM (1). Pretreatment baik Sf-9 atau HEK293 lysates dengan
NEM-benar dihapuskan peningkatan pembentukan LPA diberikan oleh hGPAT3 berlebih (Gbr. 2E), sedangkan
pembentukan LPA mtGPAT1-dependent tidak terpengaruh oleh NEM (Gbr. 2E kanan). Urutan penyelarasan
GPAT3 orthologs dari spesies yang berbeda mengungkapkan beberapa residu dilestarikan sistein yang tidak
dimiliki oleh mtGPAT1 yang dapat menjelaskan sensitivitas NEM dari GPAT3 (data tidak ditampilkan). Selain
lauroil-CoA, GPAT3 juga mengakui berbagai rantai panjang lemak asil-CoA, termasuk spesies baik jenuh dan
tak jenuh, seperti donor acyltransferase, yang dibuktikan dengan peningkatan hGPAT3-dependent dalam
pembentukan LPA (Gbr. 2F). Yang penting, aktivitas acyltransferase diberikan oleh GPAT3 berlebih adalah
spesifik terhadap G3P, karena tidak ada peningkatan yang signifikan dalam pembentukan produk diamati ketika
LPA, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylserine, lysophosphatidylglycerol, MAG, DAG atau disajikan
sebagai substrat (Gambar. 2G).
Ekspresi ektopik dari GPAT3 Meningkatkan TAG, tapi tidak Fosfolipid, Formasi di Sel mamalia. Untuk
menyelidiki lebih lanjut peran GPAT3 di TAG dan / atau sintesis fosfolipid, kami mengukur penggabungan
[14C] asam oleat menjadi lipid di HEK utuh 293 sel yang mengekspresikan mGPAT3 atau hGPAT3 (Gbr. 3).
Pembentukan berlabel TAG secara signifikan (_3- untuk 4 kali lipat) meningkat pada GPAT3 mengekspresikan
sel dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar. 3A), sedangkan tidak ada peningkatan pembentukan fosfolipid
diamati (Gambar. 3B). Berlebih dari GFP atau protein lain seperti adiponutrin tidak meningkatkan sintesis TAG
di bawah kondisi percobaan yang sama (data tidak ditampilkan). Peningkatan pembentukan TAG pada GPAT3
berlebih adalah sama besarnya dengan peningkatan diamati pada berlebih dari DGAT1 atau mtGPAT1 (Gambar.
3A). Data ini menunjukkan bahwa fungsi GPAT3 di jalur biosintesis TAG.
GPAT3 Apakah Localized ke Retikulum Endoplasma (ER). Untuk menguji lokalisasi subselular dari GPAT3,
kita diekspresikan Flagtagged mGPAT3 di COS-7 sel. Oleh imunofluoresensi, mGPAT3 ditampilkan pola
pewarnaan perinuklear (Gambar. 4A dan d) yang berbeda dari pewarnaan penanda mitokondria (MitoTracker
Red CMXRos) tapi colocalized juga dengan penanda ER (calnexin) (Gambar. 4A). Meskipun calnexin / GPAT3
pewarnaan itu reticular dalam beberapa sel, sel-sel memamerkan GPAT3 pewarnaan terang menunjukkan
adanya calnexin / GPAT3-berlabel cisternae, mungkin ref lecting efek GPAT3 berlebih pada ER morfologi.
Hasil yang sama diraih dengan hGPAT3 (data tidak ditampilkan). Untuk menyelidiki lebih lanjut lokalisasi

subselular dari GPAT3, kami menghasilkan fraksi subselular diperkaya untuk mitokondria dan mikrosom
menggunakan diferensial sedimentasi dari membran sel HEK293 overexpressing FLAG-tag hGPAT3 atau
untagged mtGPAT1. Western blotting menunjukkan pengayaan penanda prohibitin mitokondria dalam fraksi
mitokondria, sedangkan calnexin penanda ER diperkaya dalam fraksi mikrosomal (Gambar. 4B). FLAG-tag
hGPAT3 menunjukkan pola fraksinasi mirip dengan calnexin (Gambar. 4B), konsisten dengan ER lokalisasi.
Peningkatan aktivitas GPAT di lysates dari hGPAT3 dan mtGPAT1 mengekspresikan sel mirip (_2 kali lipat
dibandingkan dengan kontrol, Gambar. 4 C dan D). sel mtGPAT1-overexpressing menunjukkan kenaikan
terbesar dalam kegiatan di fraksi mitokondria, sedangkan aktivitas GPAT meningkat terutama dalam fraksi
mikrosomal di hGPAT3 mengekspresikan sel (Gambar. 2 C dan D). Temuan ini konsisten dengan GPAT3
menjadi enzim ER-lokal.
Jaringan Distribusi GPAT3 mRNA di Mouse dan Manusia. Seperti terdeteksi oleh TaqMan real-time RT-PCR,
mGPAT3 mRNA adalah yang paling banyak lemak epididimis, diikuti oleh usus halus, jaringan adiposa coklat,
ginjal, jantung, dan usus besar dalam jaringan termasuk dalam penelitian ini (Gambar. 5A). Pada manusia,
GPAT3 mRNA yang paling sangat disajikan dalam ginjal, jantung, otot rangka, kelenjar tiroid, dan testis.
Tingkat signifikan juga ditemukan di paru-paru dan jaringan adiposa (Gambar. 5B). Tidak ada varian sambatan
alternatif utama mGPAT3 dan hGPAT3 gen yang ditemukan oleh database pencarian atau analisis Northern blot
(data tidak ditampilkan). Menariknya, tingkat GPAT3 mRNA di kedua mouse dan hati manusia rendah,
mungkin menunjukkan adanya gen tambahan yang mengkode hati aktivitas microsomal GPAT. Dengan
pengecualian usus kecil, hati, paru-paru dan, mGPAT3 menunjukkan distribusi jaringan mirip dengan tikus
mtGPAT1, sedangkan mtGPAT1 manusia mencolok melimpah di jaringan adiposa (SI Gambar. 9).
GPAT3 Account untuk porsi yang signifikan dari GPAT Kegiatan di 3T3-L1 Adipocytes. Kegiatan mikrosomal
GPAT diketahui secara signifikan (_70 kali lipat) meningkat selama diferensiasi 3T3-L1 preadipocytes ke
adiposit (8, 9). Kami menemukan bahwa GPAT3 mRNA meningkat _60 kali lipat 3T3-L1 adiposit
dibandingkan dengan preadipocytes (Gambar. 6A), bersamaan dengan peningkatan yang sama dalam kegiatan
GPAT (data tidak ditampilkan). Menipisnya mGPAT3 di dibedakan 3T3-L1 adiposit menggunakan RNAi
oligonukleotida mengakibatkan penurunan mGPAT3 mRNA oleh _60% (Gambar. 6B) dan penurunan
bersamaan dalam kegiatan GPAT oleh _55% (Gambar. 6C), dibandingkan dengan sel transfected dengan
nontargeting kontrol RNAi oligonukleotida. Sebuah penurunan yang signifikan dalam GPAT3 mRNA serta
kegiatan GPAT3 juga diamati dengan dua oligonukleotida siRNA tambahan menargetkan GPAT3 (data tidak
ditampilkan). Data ini menunjukkan bahwa bagian penting dari aktivitas GPAT di dibedakan adiposit 3T3-L1
adalah karena ekspresi GPAT3.
Peraturan GPAT3 di Mice obesitas dan setelah Peroxisome diaktifkan proliferator Receptor _ (PPAR_) Aktivasi.
Untuk lebih memahami peran GPAT3 di lipogenesis, kami menguji ekspresi GPAT3 di ob / ob tikus, model
genetik obesitas, serta respon terhadap aktivasi PPAR_. mGPAT3 mRNA secara signifikan (70%) mengalami
penurunan dalam jaringan adiposa (Gambar. 7A) dan meningkat secara signifikan (2 kali lipat) dalam hati
(Gambar. 7B) dari ob / ob tikus. PPAR_ agonis seperti rosiglitazone menginduksi ekspresi program lipogenik
dalam jaringan adiposa (17). Pengobatan ob / ob tikus dengan rosiglitazone selama 21 hari induksi ekspresi
mRNA mGPAT3 putih jaringan adiposa 4,5 kali lipat (Gambar. 7C). mtGPAT1 dan DGAT1 mRNA juga
menunjukkan peningkatan besar selama diferensiasi 3T3-L1 (8, 18) (SI Gambar. 10 A dan E) dan down-regulasi
yang signifikan dalam jaringan adiposa dari ob / ob tikus (SI Gambar. 10 B dan F ). Downregulation mRNA
untuk DGAT1 dan gen lain yang terlibat dalam lipogenesis di ob / ob jaringan adiposa putih telah dilaporkan
dan telah dikaitkan dengan dedifferentiation dari jaringan adiposa di ob / ob tikus (19, 20). Berbeda dengan
GPAT3, tingkat ekspresi mtGPAT1 dan DGAT1 tidak berubah dalam hati ob / ob tikus atau di jaringan adiposa
pada pengobatan rosiglitazone (SI Gambar. 10 C, D, G, dan H). Secara bersama-sama, regulasi GPAT3 mRNA
mendukung peran enzim ini di lipogenesis.
Diskusi
Meskipun adanya kegiatan mikrosomal GPAT NEM-sensitif telah dikenal selama beberapa dekade, laporan ini
mengidentifikasi gen yang mengkode kegiatan ini pada mamalia. Beberapa bukti menunjukkan bahwa gen
manusia dan tikus kami bernama GPAT3 memang menyandikan GPAT mikrosomal. Pertama, GPAT3 berisi
semua empat motif dilestarikan yang ditemukan di sebagian besar acyltransferases terlibat dalam metabolisme
glycerolipid. Kedua, rekombinan GPAT3 dinyatakan dalam sel serangga atau mamalia menunjukkan aktivitas
GPAT NEM-sensitif. Yang penting, ekspresi GPAT3 rekombinan khusus meningkat asilasi G3P, tetapi tidak
LPA, lysophospholipids lainnya, MAG, atau DAG. Pengakuan dari berbagai spesies asil-CoA, termasuk baik

jenuh dan tak jenuh, juga sejalan dengan karakteristik dilaporkan mikrosomal GPAT. Ketiga, GPAT3
terlokalisasi ke UGD tapi tidak mitokondria. Keempat, GPAT3 mRNA up-diatur selama 3T3-L1 adiposit
diferensiasi, konsisten dengan yang dilaporkan up-regulasi aktivitas mikrosomal GPAT di lini sel ini. Akhirnya,
GPAT3 mRNA dan aktivitas GPAT di adiposit dibedakan secara signifikan menurun siRNA ditujukan terhadap
GPAT3, menunjukkan bahwa GPAT menyumbang porsi yang signifikan dari aktivitas GPAT meningkat.
Temuan ini membangun GPAT3 sebagai GPAT mikrosomal. Produk dari reaksi GPAT, LPA, adalah perantara
baik sintesis fosfolipid dan TAG. Di sini kita menunjukkan bahwa GPAT3, ketika diekspresikan, selektif
meningkatkan sintesis TAG dan tidak mempengaruhi sintesis fosfolipid. Fungsi untuk GPAT3 dalam sintesis
TAG ini lebih didukung oleh pola ekspresi GPAT3 mRNA dan regulasi. Mirip dengan DGAT1 dan mtGPAT1,
GPAT3 mRNA sangat disajikan dalam jaringan adiposa putih, adalah diatur up-selama diferensiasi adiposit, dan
down-diatur dalam jaringan adiposa dari ob / ob tikus. Selain itu, GPAT3 mRNA meningkat pada jaringan
adiposa putih tikus diobati dengan PPAR_ agonis rosiglitazone, yang dikenal untuk menginduksi ekspresi gen
lipogenik (17) dan secara signifikan diatur up-di hati dari ob / ob tikus, model hati steatosis. Masih harus
ditentukan apakah mikrosomal tambahan GPAT isoform ada yang terutama bertanggung jawab untuk sintesis
fosfolipid. Obesitas, diabetes tipe 2, dislipidemia, dan aterosklerosis yang terkait erat dengan perubahan dalam
TAG dan asam lemak sintesis, dan enzim seperti DGAT1, asetil-CoA karboksilase 2, dan stearoil-CoA
desaturase 1 telah muncul sebagai target terapi yang penting untuk mengobati kondisi ini (21-24). Mikrosomal
GPAT telah juga telah diusulkan sebagai target terapi yang mungkin untuk obesitas, diabetes tipe 2, dan
dislipidemia (25); Namun, kurangnya pengetahuan molekuler sejauh ini telah menghambat upaya untuk
mengejar kegiatan ini sebagai target. Temuan kami membuka pintu untuk mengevaluasi peran mikrosomal
GPAT dalam patofisiologi obesitas, diabetes tipe 2, dan gangguan terkait, dan untuk menentukan apakah GPAT3
mungkin menjadi sasaran untuk mengobati penyakit ini.
Bahan dan Metode Analisis Bioinformatic. Profil Model Markov tersembunyi dihasilkan dengan
menggunakan Pfam Model glycerophosphate acyltransferase (PF01553) (26) dan baru-baru melaporkan ragi
ER-terikat GPATs (15). Profil ini kemudian bertanya terhadap Swissport / Trembl (27), RefSeq (28), Ensembl
(29), dan database genom manusia dan mouse untuk mengambil daftar urutan yang berisi domain
glycerophosphate acyltransferase. Satu set nonredundan dihasilkan dengan menyaring duplikat dan alternatif
varian sambatan.
Kloning dan Ekspresi GPAT3. Full-length mGPAT3 dan hGPAT3 coding urutan dengan atau tanpa di-frame
BENDERA Nterminal epitop (MDYKDDDDL) diklon ke pPCRscript Amp SK (_) vektor (Stratagen, La Jolla,
CA) dengan PCR amplifikasi dari tikus 17 hari embrio dan manusia perpustakaan leukosit cDNA (BD
Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Sisipan cDNA selanjutnya kloning ke dalam vektor ekspresi mamalia
pcDNA3.1 (_) / Hygro atau ke vektor pFastBac1 untuk menghasilkan baculovirus rekombinan untuk ekspresi
sel serangga menggunakan sistem ekspresi baculovirus Bac-to-Bac (BD Biosciences). The DGAT1 dan
mtGPAT1 klon manusia yang dihasilkan seperti yang dijelaskan (18, 30). Sel mamalia yang secara sementara
transfected dengan menggunakan Fugene 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Untuk ekspresi dalam sel
serangga, Sf-9 sel yang terinfeksi dengan baculovirus rekombinan pada banyaknya optimal infeksi untuk 64
jam. Sel pelet dipanen dalam es-dingin PBS dan segaris dengan sonikasi, dan jumlah lisat digunakan segera
untuk pengujian aktivitas. Untuk fraksinasi subselular, sel-sel segaris dengan menggunakan dekompresi
nitrogen (Parr Instrumen Perusahaan, Moline, IL), diikuti oleh sentrifugasi diferensial pada 8.000 _ g (fraksi
mikrosomal) g (fraksi mitokondria) dan 100.000 _. Konsentrasi protein ditentukan oleh Bio-Rad (Hercules,
CA) assay protein dengan BSA sebagai standar.
Acyltransferase Activity Assays. GPAT kegiatan uji dengan ekstraksi 1-butanol dilakukan seperti yang
dijelaskan (8, 16), dengan menggunakan [3H] G3P [30 Ci / mmol, Amerika radiolabeled Chemicals, Inc (St
Louis, MO) (1 Ci _ 37 GBq)] dan lauroil-CoA sebagai substrat. Untuk pemisahan TLC, uji ini dilakukan di
75mMTris_HCl, pH 7,5 / 4 mM MgCl2 / 1 mg / ml asam lemak BSA gratis dengan 150 _M [14C] G3P (55 mCi
/ mmol) dan 50 _M asil-CoA atau 25 _M [14C ] Lauroyl- CoA (55 mCi / mmol) dan 0,5 mM G3P sebagai
substrat, kecuali dinyatakan disebutkan. Lipid diekstraksi dengan menggunakan kloroform: metanol (2: 1, vol /
vol), kering, dan dipisahkan oleh TLC dengan kloroform: metanol: air (65: 25: 4, vol / vol) diikuti oleh paparan
layar PhosphorImager. Dimana ditunjukkan, lisat sel diinkubasi dengan atau tanpa 0,4 _M NEM selama 15
menit di atas es sebelum memulai reaksi. Kegiatan acyltransferase menuju LPA, lysophosphatidylcholine,
lysophosphatidylserine, lysophosphatidylglycerol, MAG, DAG dan diuji seperti yang dijelaskan (30-32)
dengan menggunakan 25 _M [14C] lauroil-CoA dan 200 _M akseptor asil.

Metabolisme Studi Labeling. Empat puluh jam setelah transfeksi, sel HEK293 diinkubasi dengan 2 _M [14C]
asam oleat (50 Ci / mmol) dalam medium ditambah dengan asam lemak 0,1% BSA gratis selama 6 jam. Sel-sel
kemudian dicuci dua kali dengan PBS dingin, dan Total lipid diekstraksi dengan kloroform / metanol (2: 1, vol /
vol). Lipid diselesaikan dengan KLT dengan menggunakan kloroform: metanol: air (65: 25: 4, vol / vol, lipid
polar) atau heksana: etil ether-: asam asetat (80: 20: 1, vol / vol / v, lipid netral ) dan divisualisasikan oleh
paparan layar PhosphorImager.
Imunofluoresensi. Imunofluoresensi tidak langsung dilakukan di COS-7 sel transfected dengan Flag-tagged
mGPAT3, seperti yang dijelaskan (30). Mitokondria dan ER ternoda dengan mitokondria Tracker Red CMXRos
(Invitrogen, Carlsbad, CA) dan antibodi anti-calnexin (StressGen Biotechnologies, Victoria, Kanada), masingmasing, seperti yang dijelaskan (30). Gambar dikumpulkan pada Bio-Rad MRC-600 Laser confocal
Mikroskop System.
Transkripsi Profiling dan Analisis Kuantitatif RT-PCR. Dibedakan dan dibedakan adiposit 3T3-L1, jaringan dari
normal, laki-laki 8 sampai 12 minggu berusia C57BL / 6J tikus, serta jaringan dari laki-laki ob / ob dan usiacocok tikus liar control 10-minggu-tua, diperoleh seperti yang dijelaskan (33). Untuk PPAR_ pengobatan
agonis, 10-minggu-tua pria ob / ob tikus gavaged sekali per hari dengan 15 mg / kg rosiglitazone atau kontrol
kendaraan selama 21 hari. RNA dari jaringan manusia diperoleh dari CLONTECH (Mountain View, CA).
TaqMan real-time PCR kuantitatif (Q-PCR) dilakukan dengan menggunakan ABI Prism 7900 detektor urut (PE
Terapan Biosystems, Foster City, CA) dengan 18S sebagai pengendalian internal, seperti yang dijelaskan (33).
Primer-gen spesifik dan probe diperoleh dari Terapan Biosystems. Ekspresi relatif ditentukan dengan metode Ct
(Applied Biosystems). siRNA Elektroporasi dari 3T3-L1 Adipocytes. Sel 3T3-L1 diinduksi untuk membedakan
seperti yang dijelaskan (33). Pada hari ke 10 setelah diferensiasi, 2,5 _ 106 3T3-L1 adiposit ditangguhkan
dalam 0,5 ml PBS transfected dengan 15 nmol kontrol siRNA (Ambion, Austin, TX, katalog ada 4613.) atau
duplex siRNA mGPAT3-spesifik [Katalog Ambion ada. 16708A, siRNA ID 16316, 16317 (ditunjukkan pada
Gambar. 6), dan 16.318] oleh elektroporasi seperti yang dijelaskan (34). Setelah elektroporasi, sel segera
dicampur dengan media segar dan diinkubasi selama 10 menit pada es sebelum penyemaian ke piring enam
dengan baik. Tujuh puluh dua jam setelah elektroporasi, GPAT3 mRNA diukur dengan Q-PCR, dan aktivitas
GPAT ditentukan seperti yang dijelaskan di atas.