Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
---
a.
.~
LAPORAN AKHIR
(RIPP)
JUDUL
Padi Sawah
Peneliti Utama
Eny Ida Riyanti, PhD
PERTANIAN
Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111, Telp. 0251-8337975, Faks. 0251-8338820
Email: borif@indo.net.id.biogen@litbang.deptan.go.id
a.
LAPORAN AKHIR
PROGRAM RISET INSENTIF 2010
(RIPP)
JUDUL
Padi Sawah
Peneliti Utama
Eny Ida Riyanti, PhD
PERTANIAN
JI. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111, TeJp. 0251-8337975, Faks. 0251-8338820
Email: borif@indo.net.id.biogen@litbang.deptan.go.id
LAPORAN AKHIR
PROGRAM RISET INSENTIF 2010
(RIPP)
JUDUL
Padi Sawah
Tim Peneliti
PERTANIAN
JI. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111, Telp. 0251-8337975, Faks. 0251-8338820
Email: borif@indo.net.id.biogen@litbang.deptan.go.id
ii
Judul Penelitian
2.
3.
4.
5.
6.
30
iii
I
I
i
RINGKASAN
SUMMARY
vi
DAFTARISI
Halaman
III
KATAPENGANTAR
IV
RINGKASAN
DAFTAR lSI
vii
DAFTAR TABEL
Vlll
DAFTAR GAMBAR
LX
BABI
PENDAHULUAN
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Azospirilum sebagai mikroba penambat N2 , produksi IAA
dan pelarut fosfat
2.3.
BAB III
BAB IV
METODOLOGI
BAB V
14
BAB VI
27
BAB VII
28
29
DAFTAR PUSTAKA
vii
..
DAFTAR TABEL
Tabel
Judul
Halaman
Tabel 1
Tabe12
13
16
Tabe13
20
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Judul
Halaman
Gambar 1
15
Gambar 2
15
Gambar 3
Pengaruh konsentrasi
Azospirillum.
sel
18
Gambar 4
19
Gambar 5
20
Gambar 6
Gambar 7
Gambar 8
Gambar 9
Gambar 10
Gambar 11
EMS
ix
terhadap
viabilitas
21
22
23
24
25
25
BAB I.
PENDAHULUAN
Pertanian modem sangat tergantung pada penggunaan pupuk dan pestisida sintetis
untuk dapat meningkan produktivitas hasil pertanian, akan tetapi hal ini jika dilakukan
terus menerus dalam jangka panjang akan berdampak negatif bagi lingkungan. Pertanian
yang berkelanjutan dan berwawasan lingkungan adalah kunci bagi pembangunan pertanian
di abad 21, dalam hal ini sejumlah mikroba akan berperan penting sebagai bahan aktif
sarana produksi pertanian. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) merupakan
kelompok bakteri yang hidup di daerah rizosfer yang memiliki kemampuan dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman, sehingga dapat berperan dalam peningkatan hasil
produksi pertanian. Salah satu kelompok bakteri PGPR adalah Azospirillum sp yang dapat
digunakan sebagai pupuk hayati sebagai substitusi pupuk kimia.
sehingga meningkatkan
hasil
tanaman
dan
meningkatkan
per malai, meningkatkan berat biji, tinggi batang dan ukuran daun, dan meningkatkan
perkecambahan (Warembourg et al. 1987; Yahalom et al. 1984). Selanjutnya dilaporkan
pula bahwa inokulasi dapat meningkatkan perturnbuhan perakaran, seperti panjang akar
dan volume akar (Kapulnik et al. 1983). Pengaruh inokulasi Azospirilum terhadap hasil
tanaman dilaporkan berkisar antara 10-30% (Kapulnik et al. 1981 c, 1987; Rao et al. 1983;
Watanabe
and Lin 1984). Peningkatan yang sedangpun akan menjadi masukan yang sangat berguna
untuk pertanian modern j ika pengaruhnya konsisten.
Penelitian Azospirillum lokal Indonesia untuk mengetahui kemampuan menambat N2,
melarutkan fosfat tak tersedia, dan produksi AlA dalam mempengaruhi pertwnbuhan
tanaman dan perkembangan akar pada tanaman pangan sangat diperlukan. Pemilihan dan
perbaikan genetik strain-strain lokal Indonesia untuk mendapatkan strain unggul sangat
diperlukan untuk menekan kebutuhan pupuk kimia N dan P bagi pertanian tanaman pangan.
Kemungkinan overekspresi gen-gen yang bertindak untuk melarutkan fosfat dan kemampuan
menambat N2 akan sangat bermanfaat dalam penyediaan nutrien untuk tanah pertanian,
karena akan menghindari penggunaan campuran mikroba inokulan penyubur tanah lain
seperti penambat nitrogen dan lain-lain (Bashan et ai., 2004).
Sebanyak 89 isolat Azospirillum spp multi fungsi hasil penelitian tahun 2009 Balai
Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian hasil isolasi tahun 2009 telah
diseleksi kemampuannya dalam melarutkan fosfat dan menambat N2. Seleksi kemampuan
melarutkan fosfat dilakukan dengan metode Seshadri et ai. , 2000 dan seleksi kemampuan
menambat N2 dilakukan dengan metoda Asai Reduksi Asetilen (ARA) (FAO, 1983). Tiga
isolat terpilih dengan kemampuan penambatan N2 dan pelarutan fosfat tertinggi kemudian
dikarakterisasi secara molekular, meliputi identifikasi spesies dengan 16S rDNA. Satu dari
tiga isolat tersebut yaitu Aj Bandung 6.4.2.1.mempunyai kemampuan melarutkan P paling
tinggi dibandingkan dengan dua isolat terpilih lainnya dan isolat komersial TGH dengan cara
monitoring P terlarut selama 18 hari.
genetik strain dengan metode mutasi secara kimiawi untuk memperoleh strain yang lebih
baik dalam kemampuan menambat N2 dan kemampuan melarutkan fosfat. Pada tahap akhir,
yaitu tahun ke 3 (2011), akan dilakukan pengujian secara molekular strain hasil perbaikan
genetik dan percobaan pot untuk mengetahui kemampuan menurunkan penggunaan pupuk N
dan P dengan melakukan aplikasi strain hasil perbaikan genetik ke tanaman padi sawah.
Tujuan dari penelitian tahun ini adalah perbaikan genetik Azospirilum terpilih hasil
tahun 2009 dengan mutasi kimiawi EMS, mendapatkan informasi pengaruh mutasi dengan
kemampuan melarutkan P, produksi nitrogenase dan lAA serta tingkat kestabilan mutan.
Akhir dari penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan Azospirilum unggul hasil rekayasa
genetik untuk menurunkan penggunaan pupuk nitrogen sebesar 30% dan penggunaan pupuk
fosfat sebesar 15% dari standar pemupukan untuk padi sawah.
BAB II.
Manipulasi
TINJAUAN PUSTAKA
non-simbiotik untuk
meningkatkan pertumbuhan tanaman merupakan hal yang penting pada praktek pertanian
modern di beberapa negara (Bashan dan Holquin 1998). Untuk keperluan ini hubungan
tanaman-bakteria yang paling ban yak diketahui adalah simbiotik tanaman leguminosa
dengan Rhizobium dan bakteri non simbiotik nonlegum Azospirillum, Pseudomonas,
2.1. Azospirilum sebagai mikroba penambat N 2 , produksi lAA dan pelarut fosfat
Azospirillum
brasilense
merupakan
kelompok
diazothroph
yang
telah
dilaporkan dapat memperbaiki produktivitas tanaman serealia, termasuk padi, jagung dan
gandum di wilayah tropis melalui penyediaan N2 atau melalui stimulasi hormon (Tien et
af. 1979, Lestari et at., 2007). Hasil penelitian Fallik dan Okon (1996) mendapatkan
bahwa Azospirillum mampu meningkatkan hasil panen tanaman pada berbagai jenis tanah
dan iklim dan menurunkan kebutuhan pupuk nitrogen. Pada penelitian lain inokulasi A.
lipoferum pada tanaman jagung dapat menyebabkan peningkatan hasil panen sekitar 10%
(Madigan et af. 1997).
akar padi (Gunarto et af. 1999), tinggi tanaman (Okon dan Kapulnik 1986), dan
menambah konsentrasi fitohormon asam indol asetat (AlA) dan asam indol butirat (AlB)
4
Azospirillum halopraeferans yang tumbuh pada tanah salin di Brazil dapat melarutkan
fosfat (P) tidak tersedia menjadi tersedia bagi tanaman selain dapat menambat N2
(Seshadri et al., 2000).
perpindahan gen di rhizosphere yang tidak diinginkan, transfer gen ke dalam kromosom
merupakan pili han yang dipilih. Tetapi hal itu tidak mudah karena kemungkinan system
yang berbeda dalam hal cell machinery dan mekanisme regulasinya antara sel donor dan
sel resipien.
Laporan menmgenai perbaikan genetik pada Azospirillum dengan rekayasa
genetik masih terbatas, yaitu pada tahap mutasi dengan kimiawi atau transposon, metode
deteksi dengan gen gfp dan penelitian tentang marka gen untuk deteksi.
Perbaikan genetik dari Azospirillum ini telah dilaporkan dengan menggunakan
konstruksi mutan dengan transposon Tn5. Pengubahan pada open reading frame (ORF)
pada 840 bp dan 280 asam amino (ORF280) pada mutan Tn5 pada
A. brasilense
Manipulasi genetik untuk mendeteksi bakteri telah dilaporkan pula oleh Liu et
al (2003).
kromosom beberapa Azospirillum spp., untuk metode deteksi bakteri pada akar-akar
jagung. Gen gusA, pengkode enzim
~-glucuronidase
Sp7 untuk mengevaluasi pengaruh O2 pada ekspresi gen (Sun et al. 2001), dan untuk studi
kolonisasi pada akar padi dan gandum oleh A. /ipoferum (Chebotar et al. 1999; Steenhoudt
et al. 2001).
transposon mini-Tn5, telah diinsersikan pada beberapa PGPB (Bakteri penghasil honnon
pertumbuhan), tennasuk A. brasilense. Metode doble-tagging ini dilaporkan merupakan
5
cara yang bagus untuk studi ekspresi gen pada Azospirillum dan lingkungannya pada tahap
kolonisasi akar (Ramos et al. 2002; Xi et af. 1999).
pengkode enzim
~-galactozidase,
yang dapat tumbuh pada suhu rendah. Marker lacZ-nifA telah diinsersikan ke A.
brasilense Cd untuk studi kolonisasi perakaran dibawah kondisi stres garam (Fischer et al.
2000) dan kolonisasi endofit dari kecambah gandurn yang telah diperlakukan dengan 2,4
D (kolonisasi para-nodule) (Kennedy et al. 1998).
dalam beberapa kategori sebagai berikut: (1). Beberapa mutagen berfungsi sebagai basa
analog yang dapat disisipkan
(2) .
Beberapa
mutagen bereaksi dengan DNA yang menyebabkan perubahan struktur dan menyebabkan
kesalahan mengkopi templat DNA pada waktu proses replikasi, dan (3). Beberapa
mutagen menyebabkan sel mensintesa bahan kimia yang menyebabkan efek mutasi.
EMS merupakan mutagen potensial untuk menghasilkan mutasi poin yang
menyebabkan pergantian OIC menjadi AlI, delesi atau rearrangement kromosom
(Anderson, 1995). Delesi atau rearrangement pada beberapa gen dapat pula disebabkan
oleh formaldehyde (Moerman dan Baillie, 1981). Mutasi dengan EMS pada inkubasi 4
jam pada Serratia marcescens OPS-5 dilaporkan dapat menghasilkan mutan yang
meningkatkan atau menurunkan kemampuan melarutkan P (Iripura et al., 2007).
Hasil penelitian tahun lalu sudah didapatkan 89 isolat Azospirillum dari
berbagai daerah seperti Bandung, Surakarta, Purwakarta. Dari 89 iso1at Azospirillum itu
telah dipilih 22 isolat Azospirillum yang berperan ganda sebagai pelarut P, menghasilkan
Dari ke-22 isolat tersebut telah dipilih Aj
sudah dimonitor kemampuan melarutkan P secara kuantitatif selama 16 hari pada media
cair Pikovskaya (Riyanti et al., in prep.) . Isolat Aj Bandung 6.4.1.2 merupakan isolat
paling bagus dalam melarutkan P dibandingkan dengan isolat lain dan isolat komersial
TOH.
Oleh sebab itu, tujuan dari penelitian tahun ini adalah untuk melakukan
perbaikan genetik isolat Azospirillum lokal Indonesia terpilih tahun 2009 dengan cara
mutagenesis dengan EMS untuk menghasilkan Azospirillum lokal unggul.
Pada tahun
Azospirillum hasil rekayasa genetik yang dapat menurunkan penggunaan pupuk N sebesar
30% dan pupuk P sebesar 15% dari pemupukan padi sawah.
Penelitian tahap lanjut diharapkan petani dapat melakukan perbanyakan stra.ir.
Azospirillum hasil perbaikan genetik sendiri pada skala petani, dan dapat digunakan untuk
mensuplai kebutuhan pupuk P dan N sehingga dapat meningkatkan penghasilan petani dan
menurunkan subsidi pemerintah untuk penyediaan pupuk N dan P.
Tujuan dari penelitian tahun ini adalah perbaikan genetik Azospirilum terpilih hasil
tahun 2009 dengan mutasi kimiawi EMS, mendapatkan informasi pengaruh mutasi dengan
kemampuan pelarutan P, produksi enzim nitrogenase dan lAA serta tingkat kestabilan mutan.
Manfaat akhir dari penelitian ini adalah dihasilkannya Azospirilum sp unggul hasil
rekayasa genetik untuk dapat menurunkan penggunaan pupuk nitrogen sebesar 30% dan
penggunaan pupuk fosfat sebesar 15% dari standar pemupukan padi sawah untuk dapat
digunakan petani untuk meningkatkan pendapatannya. Dalam skala nasional, penggunaan
pupuk hayati unggul yang dapat diperbanyak oleh petani akan menurunkan subsidi pupuk
dan dapat mewujudkan swasembada pangan.
BAB IV.
METODOLOGI
produksi lAA, dan (3) Kestabilan sifat Azospirillum hasil mutasi terhadap kemampuan
pelarutan P dan produksi nitrogenase.
Tiap-tiap koloni tunggal diambil dengan jarurn ose dan digoreskan ke dalam media
okon dalam cawan petri (per 500 ml media terdiri atas: 3 g K2HP04, 2 g KH 2P0 4, 2,5 g
DL-malic acid, . 1,5 g NaOH, 0,25 g yeast extract, 2,5 ml MgS04.7H 20 2%, 2,5 ml NaCl
1%,2,5 ml CaCh 0,2%, 2,5 ml FeCI3.6H20 0,17%, 2,5 ml Na2Mo04.2H20 0,02%, pH
6,8, 10 g bacto agar). Inkubasi dilakukan 1 sampai 2 hari.
Kegiatan 1. Perbaikan genetik strain Azospirillum dengan mutagenesis EMS (Pj. Ir.
Eny Ida Riyanti, MSi, PhD).
a.
10.000 rpm selama 10 menit kemudian dicuci dengan buffer A (mengandung 600mM
K2HP0 4, 33 mM KH 2P04, 7.6 mM
(N~)2S04'
pad a 28C, mutan dengan zona bening besar diisolasi dan dimumikan sebagai mutan
dengan peningkatan pelarutan P. Selanj utnya akan dianalisis untuk kegiatan 2 dan 3 .
10.000 rpm selama 10 menit kemudian dicuci dengan buffer A (mengandung 600mM
K2HP0 4, 33 mM KH2P0 4, 7.6 mM (NlL)2S04, dan 1.7 mM sodiwn citrate, pH 7.3)
sebanyak 2 kali, kemudian diresuspensikan dengan buffer yang sama ditambah
dengan EMS konsentrasi 0, 0.5; 1, 1.5 dan 2%. Sampel diinkubasi selama 1 jam,
kemudian dicuci
kemudian
diresuspensikan pada setengah volume buffer yang sama. Kemudian bakteri ditanam
pada media Pikovskaya dengan pengenceran berseri 10- 1, 10-2, 10-3 ,10_ 4. Percobaan
diulang 3 kali.
sehingga semua sel bakteri mati di plot ke dalam suatu kurva killing curve.
1ndeks kelarutan P
Zona bening menandakan fosfat yang terlarut. Indeks kelarutan diukur berdasarkan
Media yang digunakan untuk mengetahui adanya fosfat terlarut mengandung (gil):
~N03
Mutan dengan indeks kelarutan P yang lebih tinggi dari isolat alam dipindahkan ke
aktivitas
Azospirillum yang mempunyai kemampuan melarutkan P lebih baik dari pada isolat alamo
Mutan-mutan dengan indeks pelarutan fosfat lebih besar atau lebih jemih dibandingkan
10
dengan isolat alam akan dipilih dan diukur aktivitas nitrogenase dan produksi IAAnya.
Dua mutan dengan indeks pelarutan P, aktivitas nitrogenase dan produksi IAA yang tinggi
akan dipilih untuk melihat tingkat kestabilan mutan dibandingkan dengan isolat wild type
(kegiatan 3).
Metode analisis aktivitas nitrogenase dan analisis produksi 1AA akan diuraikan
sebagai berikut:
a.
sumbat kapas diganti dengan sum bat karet. Diambil udara di dalam tabung
sebanyak 10% dari total volume udara menggunakan mikro syringe kemudian
digantikan dengan gas asetilen. Diinkubasi selama dua jam. Diambil sebanyak
10% total volume udara tabung (asetilen telah tereduksi menjadi etilen).
Diinjeksikan ke dalam alat gas kromatografi.
b.
Metode analisis kadar Indol Acetic Acid (IAA) yang dihasilkan Azospirillum
sp. secara spektrofotometri
Koloni isolat mutan diambil satu mata ose Azospirillum sp. dari kultur
agar miring dan diinokulasikan ke dalam 10 ml media NfB cair di dalam tabung
reaksi masing-masing berisi 9 ml (per liter media terdiri atas: 5 g DL-malic acid, 4 g
KOH, 0,5 g K2HP0 4 0,1 g MgS04 .7H20, 0,01 g MnS0 4 .H20, 0,05 g FeS04.7H20,
0,02 g NaCI, 0,0 I g CaCI 2, 0,002 g Na2Mo04.2H20, 1 g
N~CI,
0,05 g yeast
rpm dengan suhu 4C selama 10 menit. Supernatan dipipet dan deret standar (0; 1;
5; 10; 20; 40; 60; 80; 100 ppm) sebanyak 2 ml. Dimasukkan ke dalam tabung
reaksi dan ditambahkan 4 ml pereaksi Salkowski (20 ml FeCl3. 6H20 : 400 ml
H 2S04 (P) : 580 ml aquadest) ke dalam sam pel dan deret standar. Dihomogenkan
menggunakan alat vortex dan dibiarkan selama 1 jam.
Selanjutnya diukur
1: 10 selama 6 han.
Sebanyak 50 III kultur tiap-tiap subkultur dtumbuhkan pad a media P padat dan
perkembangan indeks pelarutan P diukur setelah 6 han inkubasi selarna 6 kali subkultur.
Percobaan diulang sebanyak 3 kali.
12
pelarutan P
a. Peremajaan isolat
b. Mutasi Azospirillum dengan EMS
c. Penentuan killing curve
EMS
e. Analisis data
l.2.
Pengaruh mutasi kimiawi
Azospirillum terhadap aktivitas
nitrogenase dan produksi IAA
a. Peremajaan isolat
b. Pengukuran aktivitas nitrogense
mutan-mutan Azospirillum
tinggi)
kemampuan melarutkan P
mutan
13
x x
x x
10
x x
x x x x
EMS 1.4% sesuai literatur untuk bakteri yang lain, tetapi hasil skrining pada media
Pikovskaya tidak menunjukkan zona pelarutan P yang baik.
Kemudian dilakukan
pepenelitian dengan variasi dosis EMS dari 0, 0,5, 1, 1,5 sampai 2%. Hasil eksperimen
mendapatkan bahwa dosis 2% terlalu tinggi untuk isolat. karena tidak ada koloni yang
turnbuh, sedangkan kontrol (tanpa perlakuan EMS bakteri tetap tumbuh). Percobaan ke 3
dilakukan dengan menggunakan dosis EMS 1.5%, dengan waktu inkubasi selama 0, 15, 30,
45 , 60, dan 90 menit, serta kontrol tanpa perlakuan dengan EMS. Setelah perJakuan sel
dicuci dengan buffer A untuk menghilangkan efek mutagen. Kemudian sel diendapkan
dengan sentrifugasi dan diresuspensikan pada buffer A. Penanaman dilakukan pada media
Pikovskaya padat pada pengenceran 10-5 dan 10-7, dengan tiga ulangan untuk masing
perlakuan, dan diinkubasi pada suhu 29C selama 6 hari.
mutan-mutan yang mempunyai zona bening yang sangat terang. Gambar 1 menunjukkan
cara pemilihan kQloni mutan dengan zona terang pada media Pikovskaya padat.
14
II
f,
Gambar 1. Pemilihan koloni mutan dengan zona sangat terang diantara koloni
bakteri yang lain. Tanda panah menunjukkan koloni dengan zona bening
lebih terang dibanding dengan koloni lain. Tanda panah menunjukkan
koloni yang akan dipilih karena menghasilkan zona yang cerah.
Sebanyak 138 koloni-koloni hasil mutasi yang mempunyai zona lebih terang dibandingkan
dengan koloni yang lain dipindahkan ke media Pikovskaya yang baru, dengan cara koloni
diambil dan diresuspensikan pada air steril dan dittunbuhkan dengan cara diteteskan ke
media Pikovskaya baru sebanyak
5 0~1.
diinkubasi pada suhu 29C selama 6 hari. Masing masing koloni dilihat zona ben ingn 'a
dan dilakukan pengukuran indeks Pnya, j uga dilakukan pengamatan terhadap kejem ihan
zona yang di bentuk.
mutan.
Gambar 2. Pcmilihan mutan dengan zona bening yang lebar dan terang. A. dan B.
Koloni mutan dengan zona bening yang luas, melebar tetapi tidak terlaJu
terang, C.
Koloni dengan zona bening yang sangat terang tetapi
penyebarannya tidak terlalu luas, D media Pikovskaya tan pa zona yang
berwarna putih susu.
15
Dari hasil pengamatan mutan setelah penanaman kembali pada media Pikovskaya seperti
diterangkan pada paragraf sebelumnya, maka dilakukan pemilihan mutan-mutan dengan
zona bening yang luas dan yang sangat terang sebanyak 53 isolat untuk dilakukan
pengamatan dan penelitian selanjutnya. Zona luas menunjukkan enzim pelarut dimana P
yang dihasilkan mudah menyebar ke media yang mengandung fosfat terikat dan kemudian
melarutkan fosfat,
Tabel2. Daftar isolat yang dipilih dan disimpan untuk penelitian selanjutnya
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Nama isolat
AzM 1.5.1.5
AzM 1.5.1.6
AzM 1.5.1.7
AzM 1.5.1.8
AzM 1.5.1.9
AzM 1.5. 1.1 0
AzM 1.5.1.11
AzM 1.5.1.12
AzM 1.5.1.13
AzM 1.5.1.14
AzM 1.5.1.15
AzM 1.5.1.16
AzM 1.7.2.9
AzM 1.7.2.10
AzM 1.7.2.11
AzM 1.7.2.12
AzM 2.7.3.2
AzM 2.7.3.3
AzM 2.7.3.4
AzM 2.7.3.5
AzM 2.7.3.6
AzM 2.7.3.7
AzM 2.7.3.8
AzM 2.7.3.9
AzM 2.7 .3.10
Rata-rata D
zona
Rata-rata
D koloni bening
(cm)
(cm)
0.9
1.6
1
1.8
1
1.4
0.9
1.6
1.8
1
0.9
1.5
0.9
1.5
0.9
1.6
1.6
1
1.8
1
1
1.8
1
1.7
0.8
1.9
0.6
1.4
0.9
1.7
0.8
2
0.8
1.7
0.9
1.4
0.8
1.5
0.9
1.9
0.8
1.8
0.9
1.9
0.8
1.8
0.9
1.8
0.9
1.8
16
Indeks
P (%)
1.8
1.8
1.4
1.8
1.8
1.7
1.7
1.8
1.6
1.8
1.8
1.7
2.4
2.3
1.9
2.5
2.1
1.6
1.9
2.1
2.3
2.1
2.3
2.0
2.0
efektivitas
1.8
1.9
2.0
1.9
2.3
1.8
2.0
1.7
2.0
2.3
2.0
4.4
1.9
1.9
2.4
1.9
2.1
1.9
2.0
2.0
2.6
2.4
1.8
2.1
2.1
1.9
2.1
2.3
Dari 53 isolat yang disimpan dipilih 10 isolat (huruf tebal) untuk dilihat aktivitas
nitrogenasenya dan produksi IAAnya uotuk kegiatan 2 dan 2 isolat dipilih untuk kegiatan 3
uotuk uji stabilitas mutan pada kegiatan 3 (Isolat AzM 1.7.2.12 dan AzM 3.7.1.14).
Kemudian
diinkubasi dengan larutan EMS dalam buffer A dengan konsentrasi yang berbeda selama
15 menit pada suhu ruang. Kemudian sel dicuci dengan buffer Alkali dan diendapkan
dengan sentrifugasi. Sel kemudian ditanam pada media agar Pikovskaya pada pengenceran
10.3, 10.5 dan 10.7 dengan masing-masing 3 ulangan.
4E il2
3.5E112
3[112
::::
25[112
.t:
2[112
(!)
(/)
co
E 1.5[ ~ 12
:J
J
1[112
5E~
11
0
0.50%
140%
1.50" ~
2",'
.''..'
18
j ::
4[ 112
3 .5[ f12
';;::
Q)
VI
.t::.
3[112
2.5[112
r.l
2[+12
....
1.5[j 12
E
::J
1E~
--JumIJh scl/ml
12
5[ 111
0
0
15
30
45
60
90
Gambar 4. Kurva viabilitas isolat alam Aj Bandung 6.4.1.2 terhadap lama inkubasi
EMS 1.5% untuk waktu inkubasi 0, 15, 30, 45, 60 dan 90 menit.
Keterangan: angka 4.5E+ 12 = 4.5xl 0 12 sellml)
Kurva ini dapat digunakan untuk mengetahui lama inkubasi EMS yang dapat
mematikan sel Azospirilim yang diuji.
menit inkubasi pada EMS 1.5% dapat menyebabkan sel tidak viable lagi. Dan setengah
dari lama waktu tersebut (45 menit) diharapkan merupakan waktu yang efektif untuk
inkubasi EMS 1.5%.
Kegiatan 2. Pengaruh mutasi kimiawi Azospirillum terhadap aktivitas nitrogenase
dan produksi lAA (PJ. D.N. Susilowati, MSi)
Sepuluh isolat terpilih hasil mutasi genetik dengan EMS 1.5 % telah dipilih dari
kegiatan 1. Sepuluh isolat tadi sekarang sedang diukur aktivitas nitrogenase dan produksi
IAAnya.
hubungan perubahan nilai antara indeks P, nitrogenase dan produksi IAA. Sepuluh isolat
terpilih tersebut dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 5.
19
Tabel 3. Sepuluh isolat mutan Azospirilum yang terpilih untuk analisis nitrogenase dan
produksi lAA
No .
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nama isolat
AzM 1.5 .l.14
AzM 1.7.2.9
AzM 1.7.2.12
AzM 2.7.3.2
AzM 2.7.3.4
AzM 3.7.1.14
AzM 3.7.1.15
AzM 3.7.1.16
AzM 5.7.2.11
AzM 6.7.1.4
Indeks P (%)
1.80
2.38
2.50
2.13
l.88
4.44
1.90
1.90
2.00
2.13
5
4 .5
Indcks P
3. 5
a..
VI
..::.::
Q)
2 .5
"C
s::
1. S
0 .5
Nama Mutan
Gambar 5.
20
a.
Sepuluh isolat (9 mutan terpilih Azospirillum sp dengan kontrol wild type Aj Bandung
6.4.1.2) tersebut diukur aktivitas nitrogenasenya dengan metode ARA.
Masing masing
data merupakan rata-rata dari 3 kali pengukuran. Data yang diperoleh disajikan pada
Gambar 6.
menonjol, meningkat sampai 33,5 ppm dan 25,7 ppm dibandingkan isolat wild type sekitar
1,7 ppm
40
E
0
0-
35
30
(I)
II>
/';l
(I)
~
0
.......
25
20
'c 15
2'"
:~
....
.:;,t;
<I:
Nilrop'C" ~ 2SC
10
5
0
..
Nama Mutan
Pengukuran produksi IAA juga dilakukan untuk kesepuluh isolat tersebut diatas.
diperoleh dari rata-rata tiga ulangan.
Data
peningkatan produksi IAA karena mutasi dengan EMS 1.5 % (Gambar 7). Isolat wild type
menghasilkan lAA sebesar 101,4 ppm. Dua isolat yaitu AzM 3.7.1.16 dan AzM 1.7.2.12
mengalami peningkatan yang menonjol dibandingkan dengan isolat mutan lainnya sebesar
131,5 ppm dan 132 ppm.
21
140
120
E
c...
c... 100
80
CJ)
60
~
~
:::J
'0
0
....
a..
40
.IAA
20
0
22
hari diambil sampel kultur untuk diukur aktivitas nitrogenase, IAA dan indeks Pnya.
Indeks P selama sub kultur 10 hari disajikan pada Gambar 8.
Stabilitas Indeks P
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
-
CL
V>
"""
"0
1.00
-=
AzM1.7.1.12
AzM 3.7 . 1.14
0.80
. . .. . .. Aj Bdg 6.4.1.2
0.60
0.40
0.20
0.00
1
<J
10
Gambar 8. Indeks P isolat mutan AzM 1.7.1.12, AzM 3.7.1.14 dan isolat alam Aj
Bandung 6.4.1.2 selama sub kultur selama 10 hari.
Dari Gambar 4 terlihat Indeks P mutan relatif stabil dari hari ke 1 sampai hari ke- 4, tetapi
rulai indeks P pada pengamatan stabilitas ini mengalami penurunan di bawah 2.
Pengukuran indeks P ini memang kurang akurat untuk pengukuran kemampuan melarutkan
P secara kuantitatif, oleh sebab itu masih dilakukan pengukuran P terlarut secara
kuanti tat if.
Tingkat kestabi1an dalarn melarutkan P secara kuantitatif dari mutan terpilih dibandingkan
dengan isolat wild type Az 6.4.1.2 disajikan pada Gambar 9. Isolat mutan AzM 1.7.2.12
dapat melarutka P sekitar 400 ppm pada hari ke-1 dan masih relative stabil sampai
subkultur ke 10.
23
500
450
400
E 350
c..
c.. 300
::J
~
ro
(l)
0-
250
200
150
100
50
0
-+-1.7.2 .12
* *
1
-.
.-.
<J
3.7 .1.14
--......6 .4.12
10
Hari keGambar 9. Kemampuan pelarutan P isolat mutan AzM 1.7.1.12 dan AzM 3.7.1.14
dibandingkan isolat wild type / kontrol Aj Bandung 6.4.1.2.
Kestabilan produksi IAA juga telah diamati untuk dua mutan terplih ( AzM 1.1 .1.12 dan
AzM 3.7.1.14) dibandingkan dengan isolat wild type dengan melakukan subhltur selama
10 kali (Gambar 10). Masing-masing subkultur diukur IAAnya dengan tiga kali ulangan.
Produksi IAA mutan AzM l.7.2.12 selama subkultur 1-3 mengalami penurunan, sedangkan
pada subkultur ke 4- 10 relatif stabil, sekitar 102 ppm. Sedangkan mutan AzM 3.7.1.14
dari subkultur ke-l sampai subkultur ke -10 sekitar 105 ppm sampai dengan 108 ppm.
Sedangkan isolat wild type sampai sub kultur ke 10 menurun dan 101 ppm menjadi sekitar
77,2 ppm.
24
140
120
a.
a.
10 0
<{
<{
80
<Jl
60
:J
"0
40
a..
20
....0
. ~
Ja. - -
" -
" - ~. --
oJ(
-
'.-.'
-
-.... . 64 .1.2
____ 1 7. 2 .12
-. -a.- - 37 .1.14
0
1
')
10
Hari ke-
Gambar 10. Pengaruh mutasi terhadap produksi lAA isolat mutan AzM 1.7.1.12 dan
AzM 3.7.1.14 dibandingkan isolat wild type / kontrol: Az Bandung
6.4.1.2.
Stabilitas produksi nitrogenase juga sudah diamati dengan melakukan pengukuran pada
subkultur ke-l sampai dengan ke 10 dari dua mutan terpilih AzM 1. 7.1.12 dan AzM
3.7 .1.14 dibandingkan dengan mutan wild type Aj Bandung 6.4.1.2.
Hasil menunjukan
kedua mutan sampai subkultur ke 10 mempunyai tingkat produksi nitrogenase yang stabil
(Gam bar 11).
0..
0..
(])
<Jl
<"0
(])
Ol
0
....
.~
c
<Jl
<"0
.s;
.~
<"0
1 .8
1.6
1.4
1 .2
1
0 .8
0.6
0.4
0.2
0
_ 6 .4.1.2
- .... -1 .7.2 .12
--*- 3. 7 .1 .14
1
10
Hari ke
..
Gambar 11. Pengaruh mutasi terhadap aktivitas nitrogenase. Isolat mutan: AzM
1.7.1.12 dan AzM 3.7.1.14. Isolat wild type / kontrol: Az Bandung
6.4.1.2.
25
Dari hasil pengujian stabilitas kemampuan pelarutan P, produksi nitrogenase dan IAA
mutan terpilih, kedua mutan tersebut relatif stabil sampai subkultur ke 10.
26
BAB VI.
A. KESIMPULAN
Kedua
Dengan dihasilkan mutan Azospirillum yang bersifat stabil dan lebih baik dari isolat alam
dengan multi fungsi (penambat N, pelarut P dan produksi IAA), disarankan bahwa isolat
mutan ini dapat diteruskan untuk diteliti dengan mengaplikasikan pada tanaman padi pad a
percobaan pot dan selanjutnya pada percobaan di lapang.
Dalam aplikasinya, mutan-mutan ini dapat digunakan sebagai inokulan tunggal maupun
inokulan campuran dari berbagai sifat superior yang dimiliki oleh beberapa isolat.
27
Dengan diperolehnya mutan yang stabil dan multi fungsi sebagai penambat N, pelarut P
dan produksi lAA, diharapkan pada waktu yang akan dating petani dapat memperbanyak
dan mengaplikasikan sendiri pada tanaman padi atau tanaman lain sebagai substitusi atau
pupuk kimia, sehingga Negara dapat menghemat subsidi pupuk.
28
Lestari, P, D.N. Susilowati, dan E.!. Riyanti. 2007. Pengaruh hormon asam indol
asetat yang dihasilkan Azospirillum sp terhadap perkembangan akar padi. Jurnal
AgroBiogen 3(2):66-72.
Liu, Y, S-F Chen and J-I Li. 2003. Colonization pattern of Azospirillum brasilense
yu62 on maize roots. Acta Bot. Sin. 45: 748-752.
Madigan, M.T., J.M. Martinko, and 1. Parker. 1997.
Brock, the Biology of
Microorganisms. 8th Prentice Hall. Upper saddle River, New Jersey.
Moerman, D.G., dan D.L. Baillie. 1981. Formaldehyde mutagenesis in the nematode C.
Elegans. Mutat Res. 80:273-279.
Okon, Y., and Y Kapulnik. 1986. Development and function of Azospirillum
inoculated roots. Plant Soil 90:3-16.
Pierzynski, G.M. 2000. Method for P Analysis. Methods of Phosphorus Analysis for
Soils, Sediments, Residuals, and Waters Southern Cooperative Series Bulletin
No. # 396 http://wvvw.soil.ncsu.edu/sera17/publicationslsera17-2/pmcover.htm
North Carolina State University.
Rao, V.R., D.N. Nayak, P.B.B.N. Charyulu and T.K. Adhay. 1983. Yield responses of
rice to root inoculation with Azospirillum. J. Agric. Sci. 100: 689-691.
Ramos, H.J.O., L.D.B. Roncato-Maccari, E.M. Souza, 1.R.L. Soares-Ramos, M.
Hungria, and F.O. Pedrosa. 2002. Monitoring Azospirillum-wheat interactions
using the gfp and gusA genes constitutively expressed from a new broad-host
range vector. J Biotechnol. 97: 243-252.
Reinhold, B., T. Hurek, I. Fendrik, B. Pot, M. Gillis, K. Kersters, S. Thielemans and 1.
De Ley. 1987. Azospirillum halopraeferens sp. Nov., a nitrogen-fixing organism
associated with roots of Kallar Grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth). Int J Syst
Bacteriol. 37:43-51.
Riyanti, E.I., D.N. Susilowati, dan B.A. Husain. Monitoring pelarutan P oleh isolat
baru Azospirillum. In prep
Lestari, P, D.N. Susilowati, dan E.!. Riyanti. 2007. Pengaruh hormon asam indol
asetat yang dihasilkan Azospirillum sp terhadap perkembangan akar padi. Jurnal
AgroBiogen 3(2):66-72.
Liu, Y., S-F Chen and J-I Li. 2003. Colonization pattern of Azospirillum brasilense
yu62 on maize roots. Acta Bot. Sin. 45: 748-752.
Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker. 1997.
Brock, the Biology of
th
Microorganisms . 8 Prentice Hall. Upper saddle River, New Jersey .
Moerman, D.G., dan D.L. Baillie. 1981. Formaldehyde mutagenesis in the nematode C.
Elegans. Mutat Res. 80:273-279.
Okon, Y , and Y Kapulnik. 1986. Development and function of Azospirillum
inoculated roots. Plant Soil 90:3-16.
Pierzynski, G.M. 2000. Method for P Analysis. Methods of Phosphorus Analysis for
Soils, Sediments, Residuals, and Waters Southern Cooperative Series Bulletin
No. # 396 http://wvvw.soil.ncsu.edu/seraI7/publications/seraI7-2/pm cover.htm
North Carolina State University.
Rao, Y.R., D.N. Nayak, P.B.B.N. Charyulu and T.K. Adhay. 1983. Yield responses of
rice to root inoculation with Azospirillum. J. Agric. Sci. 100: 689-691.
Ramos, H.J.O., L.D.B. Roncato-Maccari, E.M. Souza, J.R.L. Soares-Ramos, M.
Hungria, and F.O. Pedrosa. 2002. Monitoring Azospirillum-wheat interactions
using the gfp and gusA genes constitutively expressed from a new broad-host
range vector. J Biotechnol. 97: 243-252.
Reinhold, B., T. Hurek, 1. Fendrik, B. Pot, M. Gillis, K. Kersters, S. Thielemans and 1.
De Ley. 1987. Azospirillum halopraeferens sp. Nov., a nitrogen-fixing organism
associated with roots of Kallar Grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth). Int J Syst
Bacteriol. 37:43-51.
Riyanti, E.!., D.N. Susilowati, dan B.A. Husain. Monitoring pelarutan P oleh isolat
baru Azospirillum. In prep
Seshadri, S., R. Muthukumarasamy, C. Lakshminarasimhan, and S. Ignacimuthu. 2000.
Solubilization of inorganic phosphates by Azospirillum halopraeferans. CUIT Sci.
79: 565-567.
Sly, L.1., and E. Stackebrandt. 1999. Description of Skermanella parooensis gen. nov.,
sp. Nov. to accommodate Conglomeromonas largomobilis subsp. Parooensis
following the transfer of Conglomeromonas largomobilis subsp. Largomobilis to
the genus Azospirillum. Int J Syst Bacteriol. 49:541-544.
Steenhoudt, 0., V. Keijers, Y Okon and J. Vanderleyden. 2001. Identification and
characterization of a periplasmic nitrate reductase in Azospirillum brasilense
Sp245. Arch Microbiol. 175: 344-352.
Sun, J. , Smets, 1., Bernaerts, K., van Impe, J., Vanderleyden, J., and Marchal, K. 2001.
Quantitative analysis of bacterial gene expression by using the gusA reporter
gene system. Appl Environ Microbiol. 67: 3350-3357.
30
Tarrand, J. J., N.R. Krieg and 1. Dobereiner. 1978. A taxonomic study of the Spirillum
lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov., and
two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. Nov. and Azospirillum
brasilense sp. Nov. Can J Microbiol. 24:967-980.
Tien, T.M., H. Gaskins, and D.H. Hubbell. 1979. Plant growth substances produced by
Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum
americanum L.). App Environ Microbiol. 37:1016-1024.
Tripura, C. , B Sasidar dan A.R. Podille. 2007. Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis
Enhanced mineral phosphate solubilization by groundnut-associated Serratia
marcescens GPS-5. Curr Mikrobiol 54(2):79-84.
Watanabe, 1. and C. LIN. 1984. Response of wetland rice to inoculation with
Azospirillum lipoferum and Pseudomonas sp. Soil Sci. Plant Nutr. 30: 117-124.
Warembourg, F. R., R. Dreesen, K. Vlassak, and F. Lafont. 1987. Peculiar effect of
Azospirillum inoculation on growth and nitrogen balance of winter wheat
(Triticum aestivum). BioI. Fertil. Soils, 4: 55-59.
Xi,
c.,
31
..
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
1.5.1.1
1.5.1.2
1.5.1.3
1.5.1.4
1.5.1.5
1.5.1.6
1.5.1.7
1.5.1.8
1.5.1.9
1.5.1.10
1.5.1.11
1.5.1.12
1.5.1.13
1.5.1.14
1.5.1.15
1.5.1.16
1.5.1.17
1.5.1.18
1.5.1.19
1.5.1.20
1.7.2.1
1.7.2.2
1.7.2.3
1.7.2.4
1.7.2.5
1.7.2.6
1.7.2.7
1.7.2.8
1.7.2.9
1.7.2.10
1.7.2.11
1.7.2.12
1.7.2.13
1.7.2.14
D
koloni
(cm)
0.9
0.8
0.9
0.9
0.9
1
1
0.9
1
0.9
0.9
0.9
1
1
1
1
0.8
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1
1
0.9
0.9
0.9
0.9
0.8
0.6
0.9
0.8
0.9
0.9
32
Rata-rata
Indeks
zona P
bening
(cm)
(%)
1.4
1.6
1.4
1.8
1.5
1.7
1.5
1.7
1.8
1.6
1.8
1.8
1.4
1.4
1.6
1.8
1.8
1.8
1.7
1.5
1.5
1.7
1.6
1.8
1.6
1.6
1.8
1.8
1.8
1.8
1.7
1.7
1.4
1.8
1.8
1.6
1.4
1.6
1.5
1.7
1.3
1.4
1.3
1.4
1.4
1.4
1.6
1.6
1.4
1.6
1.8
2.0
1.5
1.7
1.35
1.5
1.9
2.4
1.4
2.3
1.7
1.9
2
2.5
1.7
1.5
1.4
1.6
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
AzM 1.7.2.15
AzM 1.7.2.16
AzM 1.7.2.17
AzM 1.7.2.18
AzM 1.7.2.19
AzM 1.7.2.20
AzM 2.7.3.1
AzM 2.7.3.2
AzM 2.7.3.3
AzM 2.7.3.4
AzM 2.7.3.5
AzM 2.7.3.6
AzM 2.7.3.7
AzM 2.7.3.8
AzM 2.7.3.9
AzM 2.7.3.10
AzM 2.7.3.11
AzM 2.7.3 .12
AzM 2.7.3.13
AzM 2.7.3.14
AzM 2.7.3.15
AzM 2.7.3.16
AzM 2.7.3.17
AzM 2.7.3.18
AzM 2.7.3.19
AzM 2.7.3.20
AzM 3.7.1.1
AzM 3.7.1.2
AzM 3.7.1.3
AzM 3.7.1.4
AzM 3.7.1.5
AzM 3.7.1.6
AzM 3.7.1.7
AzM 3.7.1.8
AzM 3.7.1.9
AzM 3.7.1.10
AzM 3.7.1.11
AzM 3.7.1.12
AzM 3.7.1.13
AzM 3.7.1.14
AzM 3.7.1.15
0.9
1
1
0.9
1
1
0.8
0.8
0.9
0.8
0.9
0.8
0.9
0.8
0.9
0.9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0.9
0.8
0.9
0.9
1
1
1
0.8
0.9
0.8
1
0.9
1
33
1.4
1.6
2
1.8
1.6
1.7
1.5
1.7
1.4
1.5
1.9
1.8
1.9
1.8
1.8
1.8
1.8
1.9
2
1.9
2.3
1.8
2
1.8
1.8
1.8
2
1.7
1.8
1.8
1.9
1.9
1.8
1.7
1.8
1.9
1.9
1.7
2
4
1.9
1.6
1.6
2.0
2.0
1.6
1.7
1.9
2.1
1.6
1.9
2.1
2.3
2.1
2.3
2.0
2.0
1.8
1.9
2.0
1.9
2.3
1.8
2.0
1.8
1.8
1.8
2.0
1.7
2.0
2.3
2.1
2.1
1.8
1.7
1.8
2.4
2.1
2.1
2.0
4.4
1.9
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
1
1.3
1.1
0.8
0.8
0.9
0.8
1
1
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1
0.9
1
0.9
0.7
1
0.7
1
0.9
0.9
0.9
0.8
0.9
1
0.9
1
0.8
0.9
0.9
0.6
0.9
1
0.9
1
0.9
0.9
1
34
1.9
1.6
1.5
1.4
1.3
1.7
1.8
1.6
1.7
1.6
1.5
1.4
1.4
1.8
1.6
1.9
2
1.7
1.4
1.6
1.6
1.6
1.7
1.8
1.8
1.9
1.7
1
1.8
1.7
1.8
1.5
1.6
1.9
1.5
1.8
1.6
1.7
1.6
1.9
1.9
1.9
1.2
1.4
1.8
1.6
1.9
2.3
1.6
1.7
1.8
1.7
1.6
1.6
2.0
1.6
2.1
2.0
1.9
2.0
1.6
2.3
1.6
1.9
2.0
2.0
2.4
1.9
1.0
2.0
1.7
2.3
1.7
1.8
3.2
1.7
1.8
1.8
1.7
1.8
2.1
1.9
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
no
131
132
133
134
135
136
137
138
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
AzM
5.7.2.11
5.7.2.12
6.7.1.1
6.7.1.2
6.7.1.3
6.7.1.4
6.7.1.5
6.7.1.6
6.7.1.7
6.7.1.8
6.7.1.9
6.7.1.10
6.7.3 .1
6.7.3.2
6.7.3.3
6.7.3.4
6.7.3.5
6.7.3 .6
6.7.3.7
6.7.3 .8
6.7.3.9
6.7.3.10
1
1
0.7
0.7
0.9
0.8
0.7
0.8
0.9
0.6
0.9
1
1
1
1
1
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.8
35
2
2
1.8
1.7
1.6
1.7
1.5
1.5
1.9
1.4
2
1.8
1.8
1.8
1.8
l.8
l.6
l.8
l.8
l.9
l.5
l.5
2.0
2.0
2.6
2.4
1.8
2.1
2.1
1.9
2.1
2.3
2.2
1.8
1.8
1.8
l.8
1.8
1.8
2.0
2.0
2.1
1.7
1.9