Informe Extraccin DNA (Pellet Celular) y Electroforesis
Sergio Andrs Mayorga Barragan 2150119 Paula Andrea Monsalve Agudelo 2150226 Jorge Armando Pea Agudelo El DNA es el material gentico de las clulas eucariticas cuya manipulacin y anlisis es necesario para la investigacin de las bases moleculares en las enfermedades; actualmente diferentes mtodos de biologa molecular permiten extraer DNA; el mtodo usado en la practica de laboratorio se conoce como Salting Out, para iniciar se tomaron 600 L de WCLB seguidamente se tomaron 10 L de proteinasa K y 10 L de SDS 10% es ultimo siendo un detergente permiti la ruptura de las membranas celulares, mientras la proteinasa K destruyo las membranas nucleares liberando los cidos nucleicos; mezclamos con vrtex generando asi una mezcla mas homognea. Se introdujo el vial en una incubadora a 56 C agitando en intervalos de 10 minutos con vrtex por media hora, posteriormente se agregaron 150 L de acetato de sodio (sal) aplicando vortex por 30 segundos precipitando las protenas con la ayuda de la incubacin en frio que se hizo por 5 minutos. Pasado el tiempo tomamos el vial y lo llevamos a la microcentrfuga por 10 minutos a 13.000 r.p.m. Terminada la centrifugacin la cual dejo a las protenas precipitadas se tomo el sobrenadante con una micropipeta transfiriendo este liquido a otro vial. A este nuevo vial se le agregaron 600 L de Isopropanol este deshidrato la molcula del DNA, tal reactivo se encontraba a una temperatura muy baja ( -20 C) y se mezclo por inversin suavemente viendo como apareca la malla del DNA la cual era larga e incolora y se vea de contextura viscosa. Se repiti la centrifugacin pero 10.000 r.p.m por 4 minutos. Se elimino el sobrenadante por inversin de manera rpida para no dejar perder el precipitado formado en el anterior proceso; luego se tomaron 200 L de etanol con una concentracin del 70%, tomado con tal concentracin para hidratar con el 30% restante el DNA, pero igualmente dejndolo precipitado. Se repiti la centrifugacin a 13.000 r.p.m por 4 minutos y se elimino el sobrenadante por inversin para luego ser secado sobre una toalla de papel limpia. Para finalizar se tomo el vial con el pellet y se coloco en el bloque seco para eliminar por completo el etanol por medio de su ebullicin. Despus se agregaron 75 L de buffer de TE siendo este un solubilizador del DNA y ayudando a evitar la degradacin de este. Se dejo en incubacin por una hora a 60 C en un bloque seco y por ultimo fue almacenado a -20 C para realizar el proceso de electroforesis. Luego de 8 das se procedi a tomar 2 L de LB el cual contena azul de bromofenol que serva para referencia en el avance de la separacin, se deposito en un papel que no permita la absorcin de este y se mezclo con 5 L de muestra con la ayuda de la micropipeta; seguidamente se deposito en el poso 2 del gel de agarosa que tenia una concentracin de 1,5% y en los posos 3 y 4 del gel de agarosa con concentracin de 1,8%, teniendo presente que a una mayor concentracin en tal gel mas se separaran los cidos nucleicos; se dejo all corriendo por una hora. 1
1 de Diciembre de 2015
Mientras pasaba el tiempo, se realizo la cuantificacin del DNA por espectrometra
la cual arrojo lo siguiente: Concentracin: -5,0 ng/L A 260 (10 mm Path): -0,067 A 280 (10 mm Path): 230/260: -0,42
260/280: 0,34 -0,197
Con estos valores fue
muestra en el vial el proceso de inversin luego de y su centrifugacin; boca del vial contra manera fuerte contra aqu el pellet.
posible identificar que no haba
usado, se cree que se perdi en eliminacin del sobrenadante por agregar 200 L de etanol al 70% esto debido a que se escurri la una toalla de papel de una el mesn, quizs perdindose