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1 de Diciembre de 2015

Informe Extraccin DNA (Pellet Celular) y Electroforesis


Sergio Andrs Mayorga Barragan 2150119
Paula Andrea Monsalve Agudelo 2150226
Jorge Armando Pea Agudelo
El DNA es el material gentico de las clulas eucariticas cuya manipulacin y
anlisis es necesario para la investigacin de las bases moleculares en las
enfermedades; actualmente diferentes mtodos de biologa molecular permiten
extraer DNA; el mtodo usado en la practica de laboratorio se conoce como
Salting Out, para iniciar se tomaron 600 L de WCLB seguidamente se tomaron
10 L de proteinasa K y 10 L de SDS 10% es ultimo siendo un detergente
permiti la ruptura de las membranas celulares, mientras la proteinasa K destruyo
las membranas nucleares liberando los cidos nucleicos; mezclamos con vrtex
generando asi una mezcla mas homognea. Se introdujo el vial en una incubadora
a 56 C agitando en intervalos de 10 minutos con vrtex por media hora,
posteriormente se agregaron 150 L de acetato de sodio (sal) aplicando vortex por
30 segundos precipitando las protenas con la ayuda de la incubacin en frio que
se hizo por 5 minutos. Pasado el tiempo tomamos el vial y lo llevamos a la
microcentrfuga por 10 minutos a 13.000 r.p.m. Terminada la centrifugacin la cual
dejo a las protenas precipitadas se tomo el sobrenadante con una micropipeta
transfiriendo este liquido a otro vial. A este nuevo vial se le agregaron 600 L de
Isopropanol este deshidrato la molcula del DNA, tal reactivo se encontraba a una
temperatura muy baja ( -20 C) y se mezclo por inversin suavemente viendo
como apareca la malla del DNA la cual era larga e incolora y se vea de
contextura viscosa. Se repiti la centrifugacin pero 10.000 r.p.m por 4 minutos.
Se elimino el sobrenadante por inversin de manera rpida para no dejar perder el
precipitado formado en el anterior proceso; luego se tomaron 200 L de etanol con
una concentracin del 70%, tomado con tal concentracin para hidratar con el
30% restante el DNA, pero igualmente dejndolo precipitado. Se repiti la
centrifugacin a 13.000 r.p.m por 4 minutos y se elimino el sobrenadante por
inversin para luego ser secado sobre una toalla de papel limpia. Para finalizar se
tomo el vial con el pellet y se coloco en el bloque seco para eliminar por completo
el etanol por medio de su ebullicin. Despus se agregaron 75 L de buffer de TE
siendo este un solubilizador del DNA y ayudando a evitar la degradacin de este.
Se dejo en incubacin por una hora a 60 C en un bloque seco y por ultimo fue
almacenado a -20 C para realizar el proceso de electroforesis.
Luego de 8 das se procedi a tomar 2 L de LB el cual contena azul de
bromofenol que serva para referencia en el avance de la separacin, se deposito
en un papel que no permita la absorcin de este y se mezclo con 5 L de muestra
con la ayuda de la micropipeta; seguidamente se deposito en el poso 2 del gel de
agarosa que tenia una concentracin de 1,5% y en los posos 3 y 4 del gel de
agarosa con concentracin de 1,8%, teniendo presente que a una mayor
concentracin en tal gel mas se separaran los cidos nucleicos; se dejo all
corriendo por una hora.
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1 de Diciembre de 2015

Mientras pasaba el tiempo, se realizo la cuantificacin del DNA por espectrometra


la cual arrojo lo siguiente:
Concentracin: -5,0 ng/L
A 260 (10 mm Path): -0,067
A 280 (10 mm Path):
230/260: -0,42

260/280: 0,34
-0,197

Con estos valores fue


muestra en el vial
el
proceso
de
inversin luego de
y su centrifugacin;
boca del vial contra
manera fuerte contra
aqu el pellet.

posible identificar que no haba


usado, se cree que se perdi en
eliminacin del sobrenadante por
agregar 200 L de etanol al 70%
esto debido a que se escurri la
una toalla de papel de una
el mesn, quizs perdindose

Luego de pasado una


DNA
por
oscuro, mostrando lo siguiente:

hora fue posible visualizar el


electroforesis en el cuarto

Figura No 01

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