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enzimas

As
enzimas
na fabricao de
produtos lcteos

O setor de lcteos um tradicional usurio de


enzimas. Alm da sua utilizao na coagulao do
leite para fabricao de queijo, a indstria de lcteos
tambm faz uso de enzimas como lipases, proteases
no-coagulantes, amino peptidases, lisozima, lactase,
e lactoperoxidase. Algumas destas aplicaes so
tradicionais, como por exemplo, a lipase para realar o
sabor, enquanto outras so relativamente novas, como
a hidrlise da lactose para acelerar a maturao dos
queijos, controlar a deteriorao microbiolgica, e
alterar a funcionalidade das protenas.

As enzimas foram descobertas no


sculo XIX, aparentemente por Louis
Pasteur (1822-1895), que concluiu que
a fermentao do acar em lcool pela
levedura catalisada por fermentos. Pasteur postulou que esses fermentos (as
enzimas) eram inseparveis da estrutura
das clulas vivas do levedo, declarando
que a fermentao alcolica um ato
correlacionado com a vida e organizao
das clulas do fermento e no com a sua
morte ou putrefao.
Em 1878, Wilhelm Khne (18371900) empregou pela primeira vez o
termo enzima para descrever este fermento, usando a palavra grega ,
que significa levedar. O termo passou
a ser mais tarde usado apenas para as
protenas com capacidade cataltica,
enquanto que o termo fermento se
referia atividade exercida por organismos vivos.
Em 1897, Eduard Buchner (18601917) descobriu que os extratos de levedo podiam fermentar o acar em lcool
e provou que as enzimas envolvidas na
fermentao continuavam funcionando
mesmo quando removidas das clulas
vivas. Esta descoberta valeu-lhe o Prmio
Nobel de Qumica em 1907.
Restava determinar qual a natureza
das enzimas. Alguns afirmavam que
as protenas, associadas atividade
enzimtica, apenas eram o suporte da
verdadeira enzima e, por si prprias,
incapazes de catlise.
Em 1926, James Batcheller Sumner (1887-1955) purificou e cristali-

ADITIVOS & INGREDIENTES

Histria e definio

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enzimas

enzimas

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raios X, o que aconteceu primeiro com


a lisozima, uma enzima que existe na
saliva, lgrimas e na clara de ovo e
destri a parede celular de bactrias.
Comearam assim a bioqumica e
biologia estruturais, que se esforam
por compreender o funcionamento das
enzimas a nvel atmico.
Quimicamente, as enzimas so
protenas com uma estrutura qumica
especial, contendo um centro ativo,
denominado apoenzima e, algumas
vezes, um grupo no protico, denominado coenzima. A molcula toda
(apoenzima e coenzima) dado o nome
de haloenzima.
Dependendo do tipo de ligao, o

grupo prosttico pode ser separado da


protena por mtodos brandos, como
por exemplo, a dilise. Em alguns
casos, as enzimas podem estar ligadas
a molculas orgnicas de baixo peso
molecular, ou ons metlicos, cuja funo ativar as enzimas a eles ligados,
denominados cofatores.
As enzimas so substncias slidas,
mas difceis de serem cristalizadas devido complexidade de suas estruturas
qumicas. Com algumas excees, so
solveis em gua e lcool diludo e,
quando em soluo, so precipitadas
pela adio de sulfato de amnio,
lcool ou cido tricloroactico. So
inativadas pelo calor e esta, talvez, seja

a propriedade mais importante desses


compostos em relao a tecnologia de
alimentos.
As enzimas so classificadas em
seis principais classes: oxidoredutases,
transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Cada classe dividida em
subclasses que identificam a enzima em
termos mais especficos e que so representadas pelo segundo algarismo. O
terceiro algarismo define com exatido
o tipo de atividade enzimtica e o quarto
o nmero da enzima dentro da sua
subclasse. As enzimas podem tambm
ser designadas por nomes que obedecem
a uma sistemtica e so constitudos de
duas partes: uma indicando o substrato

e a outra indicando a natureza da reao. Como essa nomenclatura tambm


complexa, as enzimas so geralmente
identificadas por nomes triviais, j em
uso h muito tempo.
As reaes qumicas que se processam no organismo so de diferentes
tipos e necessitam de catalisadores
diferentes. Essas reaes so catalisadas
por enzimas diferentes, fato que serviu
de base classificao das enzimas,
agrupando enzimas que catalisam as
mesmas reaes em uma mesma classe.
As enzimas so extremamente
eficientes. Nos processos industriais,
a ao especfica das enzimas permite
obter altos rendimentos com um mnimo de subprodutos indesejveis.
Uma molcula de enzima pode catalisar a transformao de muitas molculas do substrato, por exemplo, a enzima
catalase, encontrada abundantemente
no fgado, to eficiente, que em um minuto uma molcula desta enzima pode
catalisar a separao de cinco milhes
de molculas de perxido de hidrognio,
em gua e oxignio.
Ao contrrio da maior parte dos
catalisadores inorgnicos, as enzimas
trabalham em condies fsicas e qumicas apropriadas de pH, temperatura,
tempo, concentraes de substrato,
enzimas e cofatores; presena ou ausncia de ons ativadores ou inibidores. A
eficcia de cada enzima depende de ter
suas condies ideais respeitadas dentro
de certos limites, seno sero ineficazes
ou sero destrudos reversvel ou irreversivelmente. Muitas enzimas funcionam
otimamente a uma temperatura de 30C
a 40C e em ambientes com pH neutro
(pH=7). Para certas aplicaes foram
desenvolvidas enzimas que aceitam
temperaturas de trabalho mais elevadas,
lembrando que a maioria das enzimas
so desnaturadas sob temperaturas
acima de 100C. por este motivo, que
se costuma dizer que os processos enzimticos so economizadores potenciais
de energia e que eles tambm poupam
investimentos em equipamentos especiais, resistentes a altas temperaturas,
presso ou corroso.
As enzimas podem ser de origem
animal, vegetal e bacteriano, podendo ser produzidas, utilizando-se de
tcnicas simples ou associadas - de

homogeneizao e centrifugao diferenciada; de extrao e precipitao


fracionada; de macerao e precipitao; de exsudao, filtrao e secagem;
de produo de crescimento bacteriano; de fermentao, etc. Por exemplo,
numa produo de enzimas para fins
comerciais, usando a fermentao industrial, as condies so totalmente
asspticas, o caldo de fermentao
super aquecido para formar um meio de
nutrientes completamente estril, que
ser convertido nas enzimas desejadas
pela ao de microorganismos selecionados, na presena de oxignio. Os
microorganismos so bactrias, fungos
ou leveduras, que podem conter cada
um, mais de 1.000 enzimas diferentes.
Por este motivo necessrio um longo
perodo de estudos em laboratrio,
para isolar e selecionar o melhor microorganismo capaz de produzir a enzima
desejada com altos rendimentos.
A escolha do caldo do microorganismo e das condies operacionais
determinaro o tipo e o rendimento
da enzima. Aplicam-se processos de
centrifugao, filtrao e precipitao
para separar as enzimas e remover
outras partculas slidas do caldo de
fermentao. A biomassa resultante da
filtrao contm os resduos de microorganismos e matrias-primas, formando
um composto que, s vezes, como j foi
mencionado, pode ser um timo fertilizante natural.
O ciclo completo de produo, entre
esterilizao, fermentao e extrao,
leva de 2 a 10 dias.
As principais enzimas utilizadas em
produtos lcteos so apresentadas na
Tabela 1.

A renina, enzima
mais tradicional do
setor lcteo
A preparao enzimtica mais conhecida utilizada pelo setor lcteo o
coalho, nome coletivo dado s preparaes comerciais contendo proteases
cidas extradas de tecidos animais. De
fato, a produo de queijo com o uso
de enzimas exgenas data de 6000 a.C.
O coalho natural, chamado renina,
uma enzima proteoltica secretada
pela mucosa gstrica do 4o estmago
dos bezerros antes do desmame. Esta
secreo produzida na forma de um
precursor inativo, a pr-renina, que em
meio neutro no tem atividade enzimtica, mas em meio cido transforma-se
rapidamente em renina ativa. O coalho
possui duas enzimas: a quimosina e a
pepsina. A primeira o componente
principal a qual, aps o desmame, tem
sua produo reduzida, passando a
pepsina a ser o componente majoritrio.
A atividade proteoltica do coalho
exercida principalmente sobre a casena
e em menor grau sobre as outras protenas. Realiza duas aes fundamentais:
A primeira ao do coalho provocar a desestabilizao das micelas de
casena, rompendo a -casena em um
ponto determinado de sua molcula: o
enlace peptdico entre o aminocido
fenilalanina e seu vizinho, a metionina.
Geralmente a fora do coalho medida
atravs da eficcia ao romper as ligaes
peptdicas, ao que produz a coagulao do leite. Na casena kappa existem
164 ligaes peptdicas que podem ser
atacadas, alm de outras que existem

TABELA 1 - PRINCIPAIS ENZIMAS UTILIZADAS EM LCTEOS


Enzimas

Exemplos de aplicaes

Proteinases cidas

Coagulao do leite.

Proteinases neutras e peptidases

Acelerao da maturao de queijos; tirar o amargor; queijo


enzimaticamente modificado (EMC); produo de alimentos
hipoalergnicos base de leite.

Lipases

Acelera a maturao do queijo; queijo enzimaticamente modificado (EMC); modifica o sabor do queijo; produtos com gordura
lctea estruturalmente modificada.

Beta-galactosidase (lactase)

Produtos de soro de leite com lactose reduzida.

Lactoperoxidase

Esterilizao a frio de leite; substituto do leite para bezerros.

Lisozima

Substituto de nitrato para queijos de coalho e queijos com


burracos (e. g. Emmental).

Transglutaminase

Gelao de casenas e protenas de soro de leite.

nas outras fraes da micela.


O segundo papel do coalho de
hidrolisar essas ligaes segundo uma
ordem especfica, que caracterstica da
enzima utilizada. Esta ao secundria
sobre as protenas comea lentamente
depois da coagulao e continua durante a maturao do queijo.
Os coalhos comerciais esto preparados para ter uma determinada
capacidade coagulante denominada
fora. Expressa-se como a relao
entre o volume de leite coagulado por
unidade de volume de coalho, em condies determinadas. Assim, as unidades
Soxhlet indicam o no de litros de leite
coagulado por um litro de coalho em
40 minutos (2.400 segundos) a 35oC. A
equao abaixo utilizada para calcular
a fora do coalho:
F = 2400 x V / T x v
Nesta equao, F a fora do
coalho, V o volume de leite, T o tempo de
coagulao em segundos e v, o volume
de coalho.
Um dos diversos fatores que influenciam a coagulao enzimtica a dose
de coalho utilizada. Nas mesmas condies, a quantidade de coalho adicionado
influencia proporcionalmente a velocidade de coagulao e as propriedades
reolgicas (firmeza) da coalhada.
A temperatura tambm exerce um
papel importante na coagulao. As condies timas para a ao do coalho so
entre 40C e 42oC, j que em temperaturas inferiores a 10oC e superiores a 65oC,
no se produz coagulao. A temperatura influi sobre o fenmeno global da
coagulao e afeta de diferentes formas
cada uma das fases. A fase primria de
ao enzimtica sobre a -casena pode
ser produzida, inclusive, a temperaturas
inferiores a 10oC; j a fase secundria,
mais sensvel, necessita temperaturas
superiores para que se produza a coagulao propriamente dita.
O pH influi sobre a velocidade de
coagulao e a consistncia da coalhada.
No meio alcalino, o coalho inativado
e o leite no coagula. Ao contrrio, um
abaixamento de pH facilita a ao do
coalho sobre a casena, pois a acidez
reduz sua carga eltrica, diminuindo
a estabilidade da micela. O pH timo

ADITIVOS & INGREDIENTES

ADITIVOS & INGREDIENTES

zou a urease, mostrando tratar-se de


uma protena pura, e fez o mesmo,
em 1937, para a catalase. A prova
final foi feita em 1930, com o estudo
de trs enzimas digestivas, a pepsina,
a tripsina e a quimotripsina. John
Burdon Sanderson Haldane (18921964) escreveu um tratado intitulado
Enzimas, onde continha a notvel
sugesto de que as interaes por
ligaes fracas, entre a enzima e seu
substrato, poderiam ser usadas para
distorcer a molcula do substrato e
catalisar a reao. A cristalizao de
enzimas purificadas permitiu que as
suas estruturas moleculares pudessem
ser examinadas por cristalografia de

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enzimas

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para a ao do coalho 5,5. Em condies idnticas, a durao mdia de


coagulao de cerca de 200 segundos
a pH 6,6-6,7; 50 segundos a pH 6,1; e
30 segundos a pH 5,7.
A concentrao do on Ca++ tambm
influencia a coagulao. No intervm
na fase enzimtica, somente na fase secundria, a da coagulao propriamente
dita. Quando o contedo de Ca++ anormalmente baixo, a coagulao lenta
e se obtm uma coalhada branda. Para
evitar este defeito adiciona-se CaCl2.
O contedo de fosfato clcico coloidal tambm importante no processo
de coagulao, principalmente no que
se refere tenso do gel.
Com o aumento da produo mundial de queijo, a demanda de coalho
sofreu um aumento. Ao mesmo tempo, o
preo do coalho subiu consideravelmente. Em parte pelo custo crescente para
a extrao e pela reduo de animais
lactantes disponveis. Como consequncia desta situao, ocorreu um enorme
interesse pelo desenvolvimento e utilizao de substitutos para o coalho animal.
Os primeiros coagulantes utilizados
como substitutos foram uma mistura
de renina e pepsina bovina, extrada de
animais sacrificados com mais idade
ou de terneiros que tiveram alimentao mista. Depois foram empregados
preparados base de coalho de vaca e
pepsina porcina, compostos de pepsina
bovina pura ou mesclada com pepsina de
porco. As comunidades judias utilizam
pancreatina e pepsina de frango. Todas
estas enzimas de origem animal so
instveis a pH neutro e alcalino e so
inativadas pela ao da luz.
Tambm se utilizam enzimas coagulantes extradas de diversos vegetais,
como alcachofra, meles, figos, etc. Os
resultados obtidos no so satisfatrios
porque a ao proteoltica destas enzimas muito intensa.
Os coalhos de origem microbiana
passaram ento a ser utilizados cada
vez mais como substitutos dos coalhos
animais. So preparados extraindo-se
as enzimas coagulantes produzidas por
alguns microorganismos. Os melhores
resultados so encontrados com os
mofos do gnero Mucor, mais especificamente, Mucor miehei.
Na prtica, independentemente do

tipo de coalho utilizado, recomendase no dilu-lo at o momento de sua


utilizao, especialmente o de origem
animal, o qual muito instvel a pH
neutro ou alcalino. No deve ser adicionado at a total dissoluo do cloreto de
clcio. Deve ser armazenado a frio e em
recipiente opaco. Durante sua manipulao deve-se evitar agitao excessiva
e formao de espuma.
Na coagulao mista obtida uma
coalhada com propriedades intermedirias, com caractersticas diferentes das
coalhadas obtidas por um nico mtodo
de coagulao. O percentual de coalho e

te foi a primeira enzima comercial de


qualquer tipo. Desde ento , por definio, um extrato do abomaso (cmara
do estmago, onde ocorre a digesto) de
ruminantes, contendo principalmente
quimosina, enzima especfica para a
hidrlise da -casena e para a desestabilizao da casena. No entanto, dependendo da idade dos bezerros a partir do
qual extrado, o coalho pode conter
maior ou menor quantidade de pepsina,
outra protease cida com uma ampla
gama de substrato de casena. Tanto a
quimosina como a pepsina, assim como
todas as enzimas coagulantes do leite

a acidificao podem variar dependendo


do tipo de queijo que se deseja fabricar.
Obtm-se coalhadas mistas pela
ao do coalho sobre um leite mais
ou menos cido e por acidificao de
um gel obtido enzimaticamente. Entre outros efeitos, no primeiro caso, a
acidez diminui o tempo de coagulao
enzimtica e, no segundo, a coalhada
enzimtica sofre uma progressiva desmineralizao.

utilizadas na tecnologia de fabricao


do queijo, so classificadas como proteinases asprticas pela Comisso de
Enzimas (Enzyme Commission - EC)
sob o nmero 3.4.23. Atualmente,
como existem no mercado vrios tipos
e fontes de enzimas de coagulao do
leite, a Federao Internacional de
Lcteos (International Dairy Federation - IDF) decretou oficialmente que
a definio do nome de coalho seja
reservada para as preparaes enzimticas do estmago de ruminantes, e as
outras enzimas de coagulao do leite
(principalmente as microbianas) sejam
nomeadas coagulantes. Na opinio
dos tecnlogos, quanto a fabricao
do queijo, os coalhos e coagulantes so
mais teis categorizados por sua origem, no apenas para distinguir fontes
animais, vegetais, preparaes microbia-

Enzimas de
coagulao do
leite, coalhos e
coagulantes
A primeira preparao comercial
padronizada de coalho foi desenvolvida
e comercializada pela Chr. Hansen A /S,
na Dinamarca, em 1874, e provavelmen-

nas e OGM, mas tambm para


selecionar a enzima mais
adequada para qualquer
variedade de queijo especial. Esse um aspecto
muito importante da
tecnologia de fabricao
do queijo, que afeta a
produo do queijo, a
vida de armazenamento
e sua qualidade final,
quanto ao sabor/textura
aps a maturao. A Tabela 2 apresenta a relao
de coalhos e coagulantes
disponveis.
Dos coalhos animais, o de
bezerro amplamente considerado
como a enzima ideal para coagulao
do leite para fabricao de queijo. Essa
preferncia decorre da tradicional
familiaridade com o produto, mas tem
tambm uma base cientfica slida de
que o coalho de bezerro possui tipicamente 80% a 90% de quimosina (CE
3.4.23.4). Isso significa que a maioria da
quebra de casena no queijo dirigida
muito especificamente -casena para
coagular o leite, e no a outras casenas.
Ovinos, caprinos e sunos podem
fornecer preparaes de coalho enzimaticamente semelhantes ao coalho de
bezerro, mas no ideais para a coagulao do leite de vaca. A pasta de coalho
uma forma mais bruta de coalho, feita
a partir dos estmagos maceradas do

(tipo L), muito estvel ao


calor e hidrlisa todas as
casenas, e no apenas
a -casena. Embora
tenha sido usada com
sucesso em uma variedade de queijos leves,
mais suaves, sua ao
proteoltica no especfica reduz os rendimentos em queijos duros e
semi-duros, causando
amargor em queijos
de longa maturao. A
resistncia trmica da
enzima tambm uma
Estmagos
de bezerros
potencial desvantagem nas
bezerro, cordeiro ou cabrifbricas de queijos, nas quais
to, que contm lipase pr-gstrica,
o soro do leite processado como
para adicionar sabor picante ao queijo.
ingrediente alimentcio. O tratamento
muito usada nos queijos italianos
trmico e o processamento no elimitradicionais.
nam a atividade do coagulante e podem
Muitas plantas produzem proteinacausar degradao das protenas em
ses que servem para coagular o leite. No outros produtos alimentcios, onde a
entanto, coagulantes vegetais no so
protena de soro de leite um ingreproduzidos em escala comercial, mas diente complementar (por exemplo,
somente localmente (principalmente salsichas, tortas de carne, sopas).
em Portugal) para a produo de queijo
Para superar esses problemas, os
artesanal.
produtores de enzimas lcteas desenvolO coagulante microbiano mais conheveram verses do coagulante R. miehei
cido e mais utilizado produzido a (TL e XL) que se destroem no calor,
partir de Rhizomucor miehei (veja
utilizando oxidao qumica para moTabela 2). A preparao comercial dificar as cadeias laterais de metionina.
uma mistura de aspartil proteinases
Essas enzimas podem ser desnaturadas
(CE 3.4.23.23), comercializada em trs
por pasteurizao do soro, e so geraltipos. A nativa, enzima no modificada
mente menos proteolticas do que a

TABELA 2 - PRINCIPAIS TIPOS E FONTES DE ENZIMAS DE COAGULAO DO LEITE (COALHOS E COAGULANTES) UTILIZADAS NA PRODUO DE QUEIJOS
Tipo
Animal

Fonte

Enzima(s) componente(s)

Caractersticas tecnolgicas
Alta proporo de -casena: hidrlise da casena; mxima produtividade;
textura e sabor tradicional em queijos de massa dura e semi-dura.

Coalho de bezerro;
Coalho bovino

Estmagos de bovinos

Pasta de coalho

Estmagos de bezerros, idem ao coalho de bezerro


cabritos e ovelhas
+ lipase pr-gstrica

tima coagulao e rendimento, com produo de sabor picante.

Coalho de ovinos e
sunos
Vegetais

Estmagos dos animais


correspondentes

Quimosina, pepsina
e gastricina

No amplamente utilizado; melhor uso com leite dos animais


correspondentes.

Coagulante vegetal
Microbiano

Cynara cardunculus

Ciprocina, cardosina

Produzido localmente, em pequena escala para queijo artesanal.

Coagulante Miehei
Tipo L, TL e XL

Rhizomucor miehei

Proteinase asprtica
de R. mucor

A enzima nativa do tipo L muito estvel ao calor e proteolticas na fabricao de queijos duros; tambm produzido como desestabilizado ,TL e XL.

Coagulante Pusillus

Rhizomucor pusillus

Proteinase asprtica
de R. mucor

Propriedades semelhantes ao tipo de enzima L-miehei, porm mais


sensveis ao pH.

Coagulante Parastica Cryphonectra parastica

Proteinase asprtica
C. parastica

Muito resistente ao calor; uso limitado a queijos de alto cozimento,


como o Emmental.

Quimosina produzida
*Kluyveromyces lactis;
por Fermentao
*Aspergillus niger
(ChymaxTM; MaxirenTM)

Quimosina de bezerro

Idntica a quimosina de bezerro em todos os aspectos.

Quimosina A e B,
pepsina e gastricina

* Geneticamente modificados para expressar as copias do gene pr-quimosina do bezerro.

ADITIVOS & INGREDIENTES

ADITIVOS & INGREDIENTES

enzimas

31

proteinase nativa. Esses coagulantes so


uma boa alternativa para a quimosina
produzida por fermentao utilizada na
fabricao de queijos vegetarianos,
mas a textura do queijo torna-se mais
rapidamente quebradia do que aquela
do queijo feito com quimosina natural.
Alm disso, o perfil de sabor dos queijos
de massa dura feitos com coagulante
fungico no o mesmo do que o do
queijo feito com quimosina.
A alternativa para o coalho de bezerro mais utilizada na indstria queijeira
no mundo inteiro a quimosina produzida por fermentao, FPC (FermentationProduced Chymosin). produzida por
fermentao em larga escala de Kluyveromyces lactis ou Aspergillus Nger, geneticamente modificados. Em ambos os
casos, o microorganismo foi modificado
geneticamente, com a incorporao do
gene da pr-quimosina do bezerro no organismo hospedeiro como um promotor
adequado para assegurar a sua secreo
eficiente no meio de crescimento. A
enzima relativamente fcil de colher e
purificar a partir da cultura, ao contrrio
do sistema de produo anterior, que utilizava Escherichia coli e a proquimosina
era empacotada em corpos de incluso,
solubilizada, isolada, purificada e tratada
com cido para produzir uma quimosina
geneticamente ativa.

ADITIVOS & INGREDIENTES

As lactoperoxidases

32

A lactoperoxidase uma enzima que


faz parte da famlia das peroxidases. Foi
descoberta no leite, em 1929, quando
se constatou que sob certas condies,
o leite no se contaminava. Foi identificada e estudada por B. Reiter e K.M.
Pruitt (Biochemistry of peroxidase
system: antimicrobial effects). A lactoperoxidase produz principalmente o
composto hipotiocianeto, a partir do
tiocianato, que est em equilbrio com a
funo cida, HOSCN. O hipotiocianeto
conhecido por ter uma ao sob os
grupos SH dos microorganismos.
Os principais compostos antimicrobianos gerados pela lactoperoxidase so
compostos conhecidos por serem bactericidas ou bacteriostticos, dependendo
do tipo de bactria (gram+, Gram-). Os
antimicrobianos (OSCN-, OI-) gerados so
geralmente viruscidas e fungicos (OI-).

Essa enzima no somente tem


propriedades antioxidantes para a
detoxificao do perxido de hidrognio, como tambm permite a produo de compostos antimicrobianos.
capaz de catalisar reaes na
presena de perxido de hidrogeno,
de iodo, de bromo e de tiocianato,
produzindo assim os compostos de
hipotiocianato (OSCN-), hipoidito
(OI-) e hipobromito (OBr-). Essa enzima
possui um ncleo frrico e no suporta
os tratamentos trmicos. Por isso, pode
ser usada como indicador de um tratamento trmico do leite. Sem a presena
dos cofatores iodo, tiocianato e bromo,
ela detoxifica o perxido e produz o que
se costuma chamar de inibio sucida
(se destri na catlise).
Exemplo de reao (detoxificao
do perxido e catlise do tiocianato):
H2O2 + SCN- OSCN- + H2O
A maior parte da lactoperoxidase
disponvel extrada do leite de vaca
ou do soro do leite, onde est presente
em grandes quantidades (50mg/l). As
concentraes mais importantes foram
observadas no porquinho-da-ndia. Tambm est presente em todas as mucosas.
Em particular, pode ser encontrada
na saliva, nas lgrimas, no mucus dos
pulmes e na mucosa vaginal.
O sistema lactoperoxidase (lactoperoxidase-tiocianato-percarbonato)
reconhecido pelo Codex Alimentarius
como sendo uma alternativa refrigerao do leite porque permite, a 37C,
conservar o leite sem contaminao

microbiana. Assim, dependendo das


condies climticas vigentes no pas,
ativando essa funo pode-se transportar o leite em longas distncias, em
temperatura ambiente. A lactoperoxidase tem sido objeto de vrios estudos
visando sua utilizao como meio de
controlar o desenvolvimento da acidez
e mudanas de pH durante a estocagem
resfriada de iogurte.
A lactoperoxidase tambm esta sendo estudada quanto possibilidade de
ser utilizada como conservante natural.
usada no tratamento de frutas, como
as mangas, por exemplo. Em combinao com outros conservantes, a lactoperoxidase usada como ingrediente em
pasta de dente para combater cries.
Funciona muito bem em sinergia
com a lactoferina e lisozima.

As enzimas para
maturao de
queijos
Como o caso da maioria das boas
idias cientficas, a transferncia de tecnologia de processos para a fabricao
de produtos exclusivos, muitas vezes,
apresenta desafios imprevistos. E assim
o foi para aqueles que tentaram colocar
enzimas proteolticas em queijo. A Figura 1 ilustra as etapas da fabricao de
queijos de massa dura e semi-dura que
podem ter pontos de adio de enzimas
para o amadurecimento. Este esquema
se aplica a qualquer enzima, mas as
implicaes do processo so mais graves
no caso das proteinases, da a nfase.
A adio de proteinase no queijo,

FIGURA 1 - POSSVEIS PONTOS DE ADIO DE ENZIMAS DURANTE A


FABRICAO DE QUEIJOS

para quebrar a casena, necessria


em quantidades muito pequenas porque, assim como todas as enzimas, as
proteinases so catalisadoras e uma
pequena quantidade ir converter uma
grande quantidade de substrato. Isso
bom do ponto de vista da eficincia
de custos e da converso, mas significa
misturar gramas de enzimas ativas com
toneladas de queijo.
Colocar uniformemente as enzimas
na complexa matriz tridimensional que
o queijo j , por si s, suficientemente
difcil, mas o problema da distribuio
das quantidades to pequenas est longe
de ser trivial.
A adio de enzimas no leite para
fabricao de queijo no ponto a, como
mostra a Figura 1, seria logisticamente
ideal, pois nesse ponto tambm adiciona-se a cultura starter e o coalho, sendo
tudo cuidadosamente misturado. No
entanto, ao contrrio dos outros componentes da receita, as proteinases de
amadurecimento comeam rapidamente a remover os peptdeos solveis das
casenas. Esses peptdeos so perdidos
no soro de leite quando a coalhada
separada, causando perdas inaceitveis
para a produo de queijo. Alm disso,
o colapso precoce das casenas quebra
sua estrutura ordenada, evitando a
devida formao de gel, e tornando
a coalhada macia e impraticvel nos
estgios posteriores da acidificao da
coalhada, antes da salga e prensagem

do queijo. Adicionando-se, ainda, a estes


problemas a perda de enzimas adicionadas ao soro de leite (com uma taxa de
cerca de 95%), fica claro que a adio de
proteinases diretamente no leite no
uma opo. Se as preparaes de peptidase fossem extremamente baratas,
poderiam ser adicionadas nesse ponto,
mas a maioria dos grandes fabricantes
de queijo comercializa seu soro como
concentrados para serem adicionados
a diversos alimentos, devido a sua funcionalidade. Qualquer carga de enzima
de amadurecimento deveria ento ser
retirada ou destruda, antes do soro de
leite ser processado e comercializado.
A microencapsulao da enzima a
soluo bvia para o problema acima,
para proteger as casenas do leite e
garantir o seu aprisionamento fsico na
matriz de gel da coalhada. As opes
incluem amido, gordura ou cpsulas de
gelatina, mas nenhum deles apresenta
um mecanismo de liberao satisfatrio
no caso dos queijos.
Os queijos semi-duros Gouda e
Edam so fabricados por um processo
que inclui uma etapa de lavagem da
coalhada, no qual a mesma lavada em
gua quente, reduzindo a sua acidez e
contribuindo para um queijo de sabor
mais suave. Embora essa fase (ponto b
na Figura 1), e o prprio ponto onde a
coalhada macia (ponto c) oferecem
uma nova oportunidade para introduzir uniformemente enzimas na matriz

do queijo, ambos criam problemas de


amolecimento prematuro da coalhada,
reduo de produtividade/rendimento
e perda de enzimas no inclusas na
coalhada. Os queijos de coalhada lavada
so salgados por salmoura e no por sal
convencional, por isso poderia se pensar que o ponto c (veja Figura 1) seria
um timo ponto de adio de enzimas;
contudo, as pesquisas indicam que a
penetrao das enzimas em salmoura,
na textura do queijo prensado, seria
muito baixa, descartando assim este
caminho, tornando o coalho de queijo
lavado muito difcil de ser tratado com
enzimas de amadurecimento.
Nas variedades de queijo salgados
com sal seco, como o Cheddar, a adio
de enzimas junto com o sal em coalhadas modas (ponto d, imediatamente
antes da prensagem para formar blocos
de queijo) foi originalmente proposta
para fabricao de queijos... em escala
laboratorial. No entanto, esta tcnica
difcil de ser adaptada aos equipamentos automatizados de salga em fbricas
com produo de larga escala e, embora
as enzimas pudessem ser granuladas e
misturadas com o sal seco, trata-se de
um processo caro para um ingrediente
barato (sal), e por isso no muito
utilizado.
Como pde ser observado, a rea
que envolve a tecnologia da adio de
enzimas necessita de novas idias. Por
exemplo, h conhecimentos suficientes
em enzimologia molecular aplicada para
a elaborao de matrizes e materiais de
apoio para a criao de micropartculas
complexas de enzimas, que possam
tanto liberar como metabolizar aminocidos, cidos graxos e acares para se
obter os conhecidos compostos de sabor
e aroma desejados. Tais conhecimentos
j existem e so aplicados em outros setores, porm, no campo da maturao de
queijo ou affinage como falam os tcnicos franceses, ainda a me natureza e
o tempo que so os grandes atores nesse
processo de amadurecimento.

Lisozima
A lisozima uma enzima descoberta pelo mdico escocs descobridor da penicilina Alexander Fleming
(1881-1955), em 1922. Sua estrutura

ADITIVOS & INGREDIENTES

enzimas

enzimas

33

enzimas

enzimas

34

caractersticas de salgado, picante e


(40% a 45% de slidos), pasteurizados por
Queijos enzimaticamente modificalipolisada. A escolha da temperatura
10 minutos a 72C e, em seguida, resfriados
dos no so realmente queijos do ponto
de incubao (ou temperaturas)
por tratamento enzimtico. A temperatura
de vista do consumidor do alimento. So
fundamental para o equilbrio dessas
ingredientes aromatizantes de queijos, de incubao para o tratamento enzimtico
notas de sabor, mas geralmente esto
depende das reaes de sabor que se deve
utilizados em snacks, molhos, sopas e
na faixa de 40C a 55C. Esse intervalo
usar para a fabricao do produto. Por
outros. Para a produo de queijo entambm regido por um compromisso
exemplo, uma temperatura de 25C a 27C
zimaticamente modificado necessrio
entre a necessidade de um perodo de
apropriada para fabricar um produto com saa escolha de enzimas apropriadas e sua
incubao curto, de alta temperatura
bor de queijo faixa azul, a partir de um mofo
aplicao sob condies timas de tempara a eficincia do processo e reduo
de cultura Penicillium roqueforti, para crescer
peratura e pH. A maioria das pesquisas
da deteriorao microbiolgica, por um
e metabolizar os cidos graxos do leite em
nesta rea tem sido sobre as lipases. A
lado, e a necessidade de evitar a tempemetilcetonas caractersticas. No entanto,
escolha da lipase crtica porque cada
ratura de desnaturao das enzimas. Os
necessrio um pr-tratamento da pasta a
lipase tem uma especificidade para
produtores de EMC gostariam de ter
40C ou 45C, com uma lipase, para gerar
hidrlise, determinando assim o perfil de
enzimas microbianas mais robustas, que
suficientes cadeias curtas e mdias de cidos
cidos graxos livres em EMC. As lipases
pudessem produzir os bioqumicos de
mais utilizadas so de origem microbiana. graxos livre para o rpido desenvolvimento
sabor das matrias-primas em algumas
do sabor de queijo faixa azul.
A maioria das lipases microbianas aprehoras e a temperaturas de at 70C. No
Aps o perodo de incubao, a enzima
senta especificidade pela posio 1 ou 3
entanto, isso poderia criar problemas de
deve ser inativada para interromper a reao e
do triglicerdeo, onde os cidos de cadeia
shelf life e utilizao em funo de uma
garantir a estabilidade do aroma (veja Figura 2)
curta so encontrados, que caracterizam
atividade enzimtica residual no produto.
Os emulsificantes e estabilizantes mais
os queijos naturais.
Atualmente, os produtos EMC so pascomuns utilizados na produo da EMC inCom base nos resultados de um esteurizados a 72C por 30 minutos, aps
cluem mono- e diglicerdeos, fosfatos, cido
tudo sobre a contribuioo da liplise em
a incubao da enzima, para destruir a
ctrico e goma xantana. Normalmente, os
alguns tipos de queijo enzimaticamente moatividade residual e eliminar os microantioxidantes so adicionados na forma de
dificado (Enzyme-modified cheese technology. Journal of Dairy Science., v. 70, p. leos vegetais e vitaminas lipossolveis (e.g. organismos de deteriorao.
As EMCs podem ser liofilizadas ou
tocoferis). Os sabores bsicos gerados en1761-1769, 1987) conclui-se que o perfil
acondicionadas em pasta com diferentes
zimaticamente podem ser complementados
ou intensidade do aroma foi proporcional
contedos de gua, dependendo da precom compostos de aromas idnticos aos
ao grau de liplise e liberao de cidos
naturais de grau alimentcio, como aldedos, ferncia do cliente e da utilizao de uso
de baixa massa molecular. Enquanto as
nos alimentos.
lactonas e lcoois, ou refinados por ferlipases apresentam papel principal na deO uso de queijo enzimaticamente
terminao do aroma de muitos queijos, mentao por culturas lcteas de bactrias
modificado pode resultar em economia
lcticas e de mofos.
a atividade proteoltica importante para
nos custos de materia-prima, na formuOs queijos enzimaticamente modificacontribuio do aroma em queijos duros,
dos aromatizados tipo Cheddar, Parmeso, lao de alguns produtos uma economia
como o cheddar, segundo a classificao
superior a 50% da quantidade de queijo
Romano, Suo e Gouda requerem um
da literatura.
natural pode ser alcanada substituindo
tratamento enzimtico composto, utiliO EMC geralmente feito a partir
por uma pequena quantidade de queijo
zando lipases, proteases e peptidases, para
de pasta de queijos elaborada a partir
enzimaticamente modificado.
desenvolver um equilbrio entre as notas
de queijos do mesmo tipo. A matriaprima para o fabricante
de EMC um queijo FIGURA 2 - PROCESSO DE PRODUO DE QUEIJO ENZIMATICAMENTE MODIFICADO
jovem duro ou semiduro, cortes ou sobras
de cortes, e/ou queijo
Adio de enzimas
Queijo
de coalhada Cheddar,
Mistura
(lipases,
Pasta de
pasteurizar
parteurizar
jovem,
Chorume
proteinases,
recm salgado. So misEMC
duro ou
emulsionado a frio em
peptidases )
turados para homo72C
semi-duro
40C - 50C
30 min.
geneizao com sais
incubar
fundentes e emulsifi40% - 55%
60% - 65%
spray dry ou uso direto
a 40C - 55C
de slidos
de slidos
cantes, at obteno de
por 8-36 h
uma pasta semi-lquida

tridimensional foi definida por David


Chilton Phillips (1924-1999), em 1965,
quando conseguiu uma imagem com
uma resoluo de 2 angstrom (200pm).
Howard Florey (1898-1968) e Ernst B.
Chain (1906-1979) tambm estudaram as lisozimas; embora no tivessem
muito xito nesse campo, trousseram
bastante progresso no desenvolvimento
da penicilina, completando o trabalho
de Fleming.
A lisozima uma protena globular
formada de resduos de aminocidos
(129 no ser humano) que pode ser
encontrada em algumas secrees (lgrimas, saliva, leite materno, mucus )
e na clara de ovo. tambm produzida
pelas bactrias e por outros organismos.
Ela digere certos carboidratos de alto
peso molecular; assim as bactrias que
contm esses carboidratos na estrutura
de sua parede celular desintegram-se
ou partem-se sob a ao da lisozima. A
lisozima destri o esqueleto glicosdico
do peptideoglicano, ou seja, destri a
camada protetora de muitas bactrias.
A sua ao se deve hidrlise das
ligaes glicosdicas beta 1,4 entre
resduos do cido N-acetilmurmico
(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina
(GlcNAc) num pepitdeoglicano
A enzima usa um mecanismo de
catlise covalente e catlise cida geral,
promovendo duas reaes de desloca-

mento nucleoflicos sucessivos. Ela se


liga a seis resduos de Mur2Ac e GlcNAc
que se alternam num peptdeoglicano
tpico de bactrias, como o PDP ID 1
LZE. A ligao clivada aquela entre
o 4 e 5 resduos que foram ligados
pela enzima. Existem dois mecanismos
propostos para esta reao. O primeiro
deles, proposto por Phillips e colegas,
leva em considerao um mecanismo
SN1, que atualmente no mais aceito.
O mecanismo mais aceito atualmente,
proposto por Stephen Withers e colegas,
leva em conta um mecanismo SN2. Neste mecanismo, o 4 e 5 resduos entram
no stio ativo da enzima, e o aminocido
Asp52 da lisozima ataca o carbono anomrico do Mur2Ac. Este ataque libera o
par de eltrons do carbono da GlcNAc,
que se liga a um hidrognio cedido
pelo Glu35. Neste ataque, a ligao
clivada, e a GlcNAc (junto com o resto
do peptdeoglicado ligado a ela) agora
liberada da enzima, que ainda est
ligada covalentemente ao Mur2Ac. Esta
ligao quebrada com o ataque da
gua, que cede um -OH ao Mur2Ac e
um H ao Glu35, restaurando a enzima e
liberando o restante do peptdeoglicano.
As lisozimas comerciais de grau alimentcio so oriundas da albumina do ovo.
A lisozima usada pelos fabricantes
de queijos como agente de controle de
deteriorao, defeitos texturais apre-

Transglutaminase
Com a disponibilidade de preparaes de transglutaminase comerciais de
origem microbiana (protena-glutamnaglutamiltransferase; EC 2.3.2.13)
ocorre um interesse crescente na sua
aplicao como agente de gelao de casena e protena de soro de leite, embora
isto no seja uma tecnologia que j seja
amplamente difundida. Mesmo assim, a
transglutaminase eficiente na reduo
da sinerese em gis de leite cido e tambm tem sido estudada como meio de
melhorar a textura e shelf life de iogurte.

ADITIVOS & INGREDIENTES

ADITIVOS & INGREDIENTES

Queijo Enzimaticamente Modificado ou EMC


(Enzyme-modified cheese)

sentando fissuras e burracos irregulares causados por fermentao


butirica em variedades de queijos
de massa dura e semi-dura, como
Gouda, Grana Padano, Emmental,
Gryyre, Danbo e outros. Tradicionalmente, esse defeito, causado
por Clostridium tyrobutyricum no
leite cru, tem sido controlado pela
adio de nitrato de potssio. Mas,
essa prtica esta sendo eliminada
por ser associada a produo de
carcinogenos e, por isto, a lisozima
tornou-se o agente de controle preferido. O Clostridium tyrobutyricum
um formador de esporos e, como
tal, no pode ser eliminado por
pasteurizao, da a necessidade de
tratar o leite por outros mtodos. A
lisozima mata as celulas vegetativas
e tambm elimina o crescimento
de esporos em queijo. Embora a
lisozima iniba tambm as bactrias
cido-lcticas usadas como starters no
processo de fabricao de queijos, elas
so menos sensveis do que as bactrias
Clostridium e uma dose de enzimas de
500 unidades/ml suficientemente
seletiva (as preparaes comerciais
de lisozima contm cerca de 20.000
unidades/mg).
A lisozima tambm inibe o crescimento de Listeria monocytogenes
em iogurtes e queijos frescos de alta
acidez (<pH 5,0), mas o efeito no
suficientemente consistente para se
basear nele na produo comercial de
produtos base de leite fermentado
e, em todos os casos, uma alta acidez
normalmente suficiente em si para
inibir esses patognos.

35

enzimas

ADITIVOS & INGREDIENTES

Lipase

36

FIGURA 3 - APLICAES DE LACTASE NO PROCESSO DE HIDRLISE DA LACTOSE DO SORO

Embora as lipases sejam


Lactase
de uso nico
utilizadas na tecnologia de
em soluo
produo de aromas de queijos, so tambm usadas para
Troca
Permeato
Concentrao
fabricar produtos de gordura
inica
de soro
lctea modificada para outras
aplicaes alimentcias.
Lactase
imobilizada
Gordura de leite lipolisano bioreator
da (LMF, Lipolysed Milk Fat).
A gordura de leite lipolisada
possui aroma cremoso, de
manteiga e de queijo, derivado
dos cidos graxos de cadeia
curta a mdia e de derivados
qumicos de cidos graxos liberados da as esterases pr-gstricas tambm progordura de leite por lipases. O substrato duzem uma proporo demasiadamente
de matria-prima para a fabricao de elevada de cido butrico para fabricagordura de leite lipolisada ou leite con- o de po, no qual tendem a produzir
densado ou leo de manteiga emulsiona- notas aromticas de rano.
do, para maximizar a rea superficial da
Modificao intra- e intermolecular
gordura para ativar a lipase. As lipases de gordura lctea por lipase cataliso adicionados e deixadas em contato sada. A interesterificao qumica,
com o substrato temperatura tima acidlise, alcolise e transesterificao
(para as enzimas utilizadas), at o sabor/ tm sido usadas por
muitos anos para
aroma requeridos ser alcanado, ou at modificar as propriedades fsicas/funque um valor pr-determinado de grau cionais da gordura do leite, mas recende acidez seja atingido, correspondendo temente, a tecnologia usando as lipases
a uma liberao mensurvel de cidos tem substitudo a tecnologia qumica,
graxos pela lipase.
propiciando um processamento mais
O produto pasteurizado, liofilizado preciso e mais limpo.
(ou ajustado de outra forma para um
Em particular, substitutos de gorteor de slidos padro) e embalado. dura do leite tm sido preparados
Os produtos de gordura de leite lipoli- como substitutos parciais da gordura
sada incluem coberturas de chocolate do leite em alimentos para bebs. No
e xaropes, aromas de manteiga para entanto, o fracionamento da gordura
margarina, cremes e molhos artificiais, por mtodos fsicos ainda a opo
flavorizantes para branqueadores de comercial preferida para a modificao
caf e aditivos saborizantes de queijo.
da gordura do leite em aplicaes para
O tipo de lipase utilizada na pro- produtos lcteos.
duo de LMF depende da aplicao
alimentcia na qual se pretende us- Lactase
lo. Geralmente, bons produtos LMF
A lactase em forma de tabletes (por
para uso em produtos cozidos podem
ser fabricados usando preparaes exemplo, Lactaid), mastigveis ou no,
base de lipase pancretica, esterase comercializada como um medicamenpr-gstrica de cordeiro e cabrito, e to in vitro para a intolerncia lactose,
fungos/mofo de lipases de Aspergillus uma condio generalizada causada
niger, Geotrichum e Penicillium ro- por uma deficincia de lactase no trato
queforti. Algumas lipases bacterianas digestivo, tendo como sintomas, clitambm so adequadas (Achromobacter cas abdominais, flatulncia e diarria,
lipolyticum e Pseudomonas), mas as devido ao acmulo de lactose no lmen
LMF para uso em panificao no devem intestinal. Os tabletes de lactase da
ser preparadas com lipases de Achromo- Lactaid fornecem lactase ativa ao inbacter, Penicillium ou Geotrichum, para testino para quebrar a lactose ingerida
evitar sabores ensaboado e mofo/bolor; e aliviar os sintomas da intolerncia.

Lactase em
35C - 40C
Evaporao

Xarope de
soro de leite
hidrolisado

Coluna
imobilizada
de lactase
em
35C- 50C

O xarope hidrolisado de soro de leite


produzido a partir do soro de leite,
subproduto da fabricao de queijos e
produo de casena. A etapa de hidrlise pode ser sobre o soro em si, ou sobre o
permeado do processo de ultra filtrao
(UF), usado para fazer o concentrado
protico de soro. O permeado da UF
ainda contm algumas protenas do
soro, mas enriquecido com lactose.
concentrado com 15% a 20% de slidos
totais, desmineralizado, normalmente
por troca inica, atravs de eletrodilise
ou nanofiltrao, sendo, ento, aquecido
em funo do tipo de tratamento de
lactase a ser utilizado. A etapa de hidrlise pode ser por enzima imobilizada
em reator de coluna, utilizando lactase
(Aspergillus Oryzae). Os reatores com
enzimas imobilizadas podem alcanar
90% de hidrlise de lactose, enquanto
que o processo tradicional por lotes
(yeast lactase) atinge apenas 70%. No
entanto, ambos os processos produzem
glicose livre e galactose suficiente para
adoar o produto, sendo essa propriedade alcanada pela evaporao do
hidrolisado, a 60% de slidos totais,
para fabricao do xarope final. Um
diagrama tpico do fluxo desse processo
apresentado na Figura 3.
O xarope de soro de leite viscoso
devido alta concentrao de glicose e galactose, sendo comercializado e utilizado
dessa forma. usado na fabricao de alimentos para substituir o leite condensado,
acar e leite desnatado em muitos produtos, como sorvetes, sobremesas lcteas
e molhos. O xarope tambm um excelente ingrediente caramelo, bem como
adoante/ligante em barras de cereais.