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  • Manejo y Procesamiento de Muestras Foliares de Papa

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    procedimientos paso a paso para determinar el virus del amarrillamiento de las venas de la papa.

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    UNESUILA CONT XetLO) NTU DE INVESTIGACIONES AGRICOLAS MANEJO Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS FOLIARES DE PAPA * CON SINTOMAS DEL VIRUS DEL AMARILLAMIENTO Dea AUT MPC (OURO a eB MARTHA OSORIO aol) jeer ey bales ete El virus del amarillamento de las venas de papa o Potato yellow vein virus (PYVV) pertenece a género Crinivrus, familia Closteroviridae yes expecticodepaisesandinoscomo Peri, Ecuador, Colombia y Venezuela Es "un problema importante debido a que ocasiona pérdidasen a produccion de papa al causarreduccidn en el nimero y tamano de lo tubérculs I diagndstico de vieus se ha basado en la expresin de sintomas, sn «embargo, éste puede serimpreciso debidoa queen algunos casos el virus puede infecta en forma latente y asintomitica alas plantas ye serldgico sche dificultado por Is inexistencia de estuches comerciales disponible, El diagnéstico molecular a través de la reaccién en cadena de la pplimerasa con transcripelén reversa o RT-PCR, por sus siglas en Inglés, es el mas sensible y preciso para deterinar infecci com PYVV cen dl cukvo de papa, por lo que se converte en una herramienta de suma imporancia pars el monitorco epidemioligico y para evitar la dlispersén del virus (Salazar, 1998; Salarar etal, 2000; Liveratos etal, 2004; Dol 2006; Cubillos, 2011; Guzmén-Barney etal, 2013). La scloccidn de las mucstras pars el diagnéstico del PYVV se apoya fn I observacion de los sintomes, éstos se manifiestan durante la tap inicial de la enfermedad como pequetios puntos amarillos que faparecen en los bordes de la limina foliar, posteriormente aumentan fen nimero y tamafo hasta juntarse dejando las wenas de color amarillento y los espacios intevenales de color verde. (Figura 1) Figur. Shtomas ocarionsds poe PYVY. a pequebos panes sarin en losbordes ‘cleojs hr sens erally cpanel verdes > wo es of, Fuente: Ora 204 rane Lars et a 2008 Cuando el ataque es muy severoy la variedad susceptible, Extraccion del ARI Existen numerosos estuches comerciales paia Ia extraccbi del ARN Viral de muestas de plantas sintomiticas Ia seleccién dependert. de la disponibilidad en el mercado, Aqui se describe el protacolo de entraccén del estche RNeasy Plant Mini de QUIAGEN (Figura 3), om tuna modificacin en la fase ical del proceso de extracién, donde ‘¢ incarpor la ultracongelaciin del tj foliar a -60" C, previa 8st pulverizacién con Nitrégeno liquide (NL2), y metabisulfito de sodio, a ‘azin de 005mgg-1 de teido, durante el macerado de la muestra para cevitaroxidacin y mejorar la calidad del ARN, gt - = “ = 4->5-i- ese 0d == gua. Proocolo de extrac» puicatn del ARN de lartas can sionas de PYVY-tlzand el este RNeasY Pan Min! Se OUIAGEN, aren eR te Unan) WeC inca oerd(c4 8} rear eee unres| eC carat ae) 1-@- €-9 es aera Comin ie aoa Ree ders dela eee eer uae mplean ay ate ie fe unin Ese BE aster Mixlos none war) iB =e PSM sticelamenco | texbermt © i— a cextraccion fain 20U (acon 1 be BR Yo ceirven seams incase revosleanptescse ake devenctonen acolo de fee nee at )-—_—_——_——_—————- <)-—_—_—_——- - = Esquema del Proceso de la RT-PCR Esquema del Proceso de la RT- = eee Sq ‘Cumple 2 = Master mix Voters 35 4b Avalre de Nucleasas Termociclador J PERFIL TERMICO PARALOS GENES CPy CPm Cree T=aTIS 982 Cporncominutoe =) Correia dal a peoeod ¢ 'S28C por un minute etd 100V Ana ySW ono soe 722°C por un minuto aia storie porta trac eo edn Sptcta rr coon Pre de RT-PCR ono alas Sl PYVY, clades expec para Py CP, > <)-_—_—_—_——cx“—“ © ——-(JF Proceso dela RT-PCR Referencias bibliografica 1a reaceién de amplificaciin pata la RT-PCR consist en: 1X de Butfer (Promega, ImM de MigCl2(Promeya"), 0.2mM de dNTPs (Promega, 02 uM de iniciadores especiticns par os genes dels proteinas mayor (CP) Forward SATGGAAATCC TGGAACCT 8’ Reverse FCTACTCAATAGATCCTGCTA 51) y menor de a capsie (CPi) (CPm Forward SGACOGCCGACTTGTTGAATT 3" Reverse STIGCIGCATTCTTGAACAGGTAA 5), (Eurogente’), 40 dde'Taq Polimerasa Gotag flexi Promega’) y 20/ng de ADNe. ‘La mercla de amplificaciin se colaca en un termociclador para ‘cumplir un peril de temperatara que iniciacon un paso de

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