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BASE
Vermelho
Vermelho
Vermelho
Amarelo
Amarelo
H2S
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
GS
Neg
Neg
Neg
V
V
enzima
cidos
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador
de Andrade. Pode-se utilizar o mesmo inculo para at 04 tubos ou mais
b) Incubar a 37C por 18-24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Amarelo
Rosa
INTERPRETAO
Presena de cido
Ausncia de cido
fermentao
H2 + CO2
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador de Andrade, contendo tubo de
Durhan invertido.
b) Incubar a 37C por 18-24h.
Resultado e Interpretao
A produo de gs pode ser evidenciada em caldos pela formao de bolha no interior do tubo de Durham ou pela
presena de rachaduras, no caso dos meios slidos.
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
INTERPRETAO
Presena de cido s/ gs
Presena de cido c/ gs
Ausncia de fementao
fermentao
cido ltico
cido actico
cido frmico
cido etlico
H2CO2
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubs
b) Incubar a 37C por 24h.
c) No momento da leitura, retirar 2,5mL do meio e acrecentar 0,5mL do indicador (vermelho de
metila em soluo alcolica a 60%)
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Vermelho
Amarelo
INTERPRETAO
Fermentao cida mista
Ph 6,0
Glicose
fermentao
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubs.
b) Incubar a 37C, por 02 a 05 dias.
c) No momento da leitura, acrescentar 0,6 mL (por mL de meio) de -naftol a 5%
d) Adicionar 0,2 mL (por mL de meio) de soluo de KOH em soluo alcolica a 40% e agitar
vigorosamente por aproximadamente 3 minutos. Depois de decorrido pelo menos 5 minutos,
verificar a colorao do caldo.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Vermelho
Amarelo
INTERPRETAO
pH 4,5
pH 6,0
a) Peptdeos
b) Aminocidos
Aminocidos
descarboxilase
amnia + CO2
Metodologia
a) Inocular a bactria no meio para descarboxilao de aminocidos com auxlio de
agulha de inoculao.
b) Acrescentar cerca de 0,5mL de leo mineral ao meio de cultura assepticamente. Caso
o meio j esteja com o leo mineral no momento da inoculao, cuidar para que a agulha
no emita aerossis contaminados ao ser flambada.
c) Incubar a 37 C por 24-48h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
COR DO MEIO
Positivo
Roxo
Negativo
Amarelo
Amarelo
INTERPRETAO
Presena de amnia ou o microrganismo
no utiliza a glicose
Fermentao do acar sem utilizao do
aminocido. Ausncia de amnia
Fermentao do acar
COR DO MEIO
Rosa
Amarelo
INTERPRETAO
Presena de amnia
Ausncia de amnia
- PROVA DO INDOL
Objetivo:
Determinar a habilidade do microrganismo em produzir indol a partir do triptofano.
Base Bioqumica
Triptofano
triptofanase
Reativo de Kovacs
Indol + p-dimetilaminobenzaldeido
composto quinoidal vermelho
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM com o cuidado de no
chegar ao fundo do tubo (2/3 do meio)
b) Incubar a 37C, com papel de filtro embebido em Reativo de Kovac`s (pdimetilaminobenzaldeido) junto tampa do tubo ou acrescentar algumas gotas do reativo ao
meio aps o perodo de incubao.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Vermelho
Incolor
INTERPRETAO
Composto quinoidal
Ausncia do composto
A presena deste composto ocorre ao longo da linha de inoculao e indica que houve produo de sulfureto de
hidrognio (reaco positiva). A ausncia do precipitado negro evidencia uma reaco negativa.
de aminocidos
Base Bioqumica
Muitas protenas so ricas em aminocidos sulfurados, como a cistena. Quando estas protenas esto presentes
no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos que so utilizados como
nutrientes. A cistena, na presena da enzima cistena dessulfurase, perde o seu tomo de enxofre, que por sua
vez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar H2S. O H2S ento produzido pela hidrogenao
(reduo) do enxofre orgnico presente no aminocido cistena.
O meio de cultura agar SIM contm peptonas (a cistena um dos componentes) e tiossulfato de sdio como
substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que actua como indicador da presena de H2S.
Como o H2S incolor e, por conseguinte, no visvel. O sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o
ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que um precipitado negro insolvel.
Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos sulfurados inorgnicos, como os tiossulfatos
(S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contm tiossulfato de sdio alguns
microrganismos tm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertao de
H2S. Os tomos de enxofre, ento, atuam como receptores de hidrognio durante a oxidao dos compostos
inorgnicos.
Cistena
ons frricos
cistena sulfidrilase
sulfeto
Metodologia
a) Inocular a cultura com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM, com o cuidado
de no alcanar o fundo do meio de cultura (2/3 do meio).
b) Incubar a 37 C.
c) Observar se h crescimento bacteriano e a formao de precipitado negro.
Resultado e Interpretao
A formao de precipitado negro indica a presena de H2S no meio. Na ausncia de
H2S o meio permanece inalterado.
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Negro
Incolor
INTERPRETAO
Presena de H2S
Ausncia de H2S
- PROVA DE MOTILIDADE
Objetivo
Verificar se o microrganismo dotado de flagelos (mvel) ou no (imvel)
Base Bioqumica
A motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-slido, o que
permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo caso a bactria possua flagelos. Se a
motilidade positiva o aspecto do meio ficar turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s ser
observado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papel
pautado, comparando o tubo inoculado com um tubo no inoculado.
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base.
b) Incubar a 37C por 24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
ASPECTO DO MEIO
Turvo
Inalterado
INTERPRETAO
Presena de flagelos
Ausncia de flagelos
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Oxidativo
Fermentativo
COR DO MEIO
Amarelo ou verde no tubo sem leo
Amarelo nos dois tubos
INTERPRETAO
Aerbio
Facultativo
- PROVA DO CITRATO
Objetivo:
Determinar a habilidade do microrganismo de utilizar o citrato como nica fonte de carbono (meio de citrato de
Simmons).
Base Bioqumica
Na ausncia de glicose ou lactose fermentveis, alguns microrganismos so capazes de usar o citrato como nica
fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presena de citrato permease que facilita o
transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da clula o citrato degradado pela enzima citratase,
produzindo cido oxalactico e acetato. Estes produtos so depois convertidos enzimaticamente em cido pirvico
e CO2.
O meio de citrato de Simmons contm citrato de sdio como nica fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e
o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova feita com meio em rampa e sem base, uma vez que o O2
necessrio para a utilizao do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre
libertao de CO2. Durante esta reao o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sdio
(fornecido pelo citrato de sdio) e gua para formar carbonato de sdio, que um produto alcalino. A presena de
carbonato de sdio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte.
Citrato +NH4 piruvato CO2 + Na + H2O Na2CO3 (pH alcalino)
Metodologia
a) Inocular a bactria, com auxlio de agulha de inoculao, em estrias na superfcie do agar
inclinado.
b) Incubar a 37C/24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Azul
Verde
INTERPRETAO
Utilizao do citrato
No houve utilizao do citrato
- PROVA DO MALONATO
Objetivo:
Verificar se a bactria utiliza malonato de sdio como nica fonte de carbono e sulfato de amnio como nica
fonte de nitrognio.
Base Bioqumica
O malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido
succnico, com interrupo do ciclo de Krebs. Esta reao tira da bactria sua principal fonte de energia e impede
a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. A utilizao do sulfato de amnio produz
hidrxido de sdio, o qual alcaliniza o meio tornando-o azul. A mudana de cor verde para o azul propiciado pelo
aumento do pH, visualizado atravs da viragem do indicador azul de bromotimol do verde para o azul.
Metodologia
a) Inocular a bactria, com auxlio de ala de inoculao no caldo malonato.
b) Incubar a 37C/24h
c) Observar se houve crescimento bacteriano e a colorao do meio.
Resultado e Interpretao
A viragem da cor verde para o azul indica prova positiva para a utilizao do malonato. A
manuteno da cor
verde indica prova negativa para a utilizao do malonato.
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Azul
Verde
INTERPRETAO
Utilizao do malonato
No houve utilizao do malonato
- PROVA DO NITRATO
Objetivo: Verificar a capacidade de um microrganismo de reduzir o nitrato a nitrito.
Base Bioqumica
A reduo dos nitratos por alguns microrganismos aerbios ou anaerbios facultativos ocorre na ausncia de
oxignio. Nestes microrganismos a respirao anaerbia um processo oxidativo pelo que as clulas usam
substncias inorgnicas como os nitratos (NO3-) ou os sulfatos (SO42-) para fornecer oxignio que so
subsequentemente utilizados como aceitadores finais de eltrons durante a formao de energia. Nesse processo,
os nitratos so reduzidos a nitritos (NO2-).
Por outro lado, alguns desses microrganismos possuem capacidade enzimtica para atuarem sobre os nitritos
reduzindo-os a amnia (NH3+) ou a azoto molecular (N2). A capacidade de alguns microrganismos reduzirem os
nitratos pode ser usada na sua identificao.
Metodologia
a) Semear o microrganismo em um caldo nutritivo suplementado com 0,5% de nitrato de potssio (KNO 3) como
fonte de nitratos (caldo nitrato), com auxlio de ala bacterilogica.
b) Incubar a 37C/24h.
c) Proceder leitura dos resultados adicionando 0,5mL da soluo A (c. sulfanlico) e, a seguir, 0,5mL da
soluo B (-naftilamina). Os nitritos presentes no meio vo reagir com esses reagentes produzindo uma
mudana de cor imediata para vermelho.
Nota: se a cultura no mudar de cor existem duas possibilidades: o microrganismo possui enzimas que reduziram
os nitratos a nitritos e estes a amnia ou a azoto molecular ou os nitratos no foram reduzidos pelo
microrganismo.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DESENVOLVIDA
Vermelho a vinho
Inalterado*
INTERPRETAO
Reduz nitrato a nitrito
No reduz nitrato a nitrito
* - Para determinar se os nitratos foram ou no reduzidos a nitritos, adiciona-se uma pequena quantidade de zinco
em p cultura incolor que j contm os reagentes. Uma vez que o zinco reduz os nitratos a nitritos, o
aparecimento de uma cor vermelha aps a sua adio revela que os nitratos no foram reduzidos a nitritos pelo
microrganismo (reao negativa). Por outro lado, se a adio de zinco no produzir uma mudana de cor indica
que os nitratos j tinham sido reduzidos a nitritos e este a amnia ou a azoto (reao positiva).
ASPECTO DO MEIO
Turvo
Inalterado
INTERPRETAO
Tolerante ao KCN
No tolerante ao KCN
- PROVA DA CITOCROMO-OXIDASE
Objetivo:
Determinar se um microrganismo possui a enzima citocromo oxidase.
Base Bioqumica
Este sistema enzimtico est relacionado com o citocromo c da cadeia respiratria de alguns microrganismos, que
oxidam o reagente dihidrocloreto de tetrametil-p-fenilenodiamina originando colorao prpura. Este reagente,
de cor rosa plido, age como um substrato artificial, fornecendo eltrons e, consequentemente, ficando oxidado e
tornando-se um composto escuro (prpura) na presena de oxidase e de oxignio livre.
Metodologia
a) Colocar uma ou duas gotas do reagente incolor dihidrocloreto tetrametil p-fenilenodiamina, recmpreparado e protegido da luz, em uma tira de papel de filtro.
b) Espalhar uma colnia do microrganismo (cultura de 18-24h) sobre a rea do papel de filtro contendo o
reagente, utilizando uma ala de platina, um basto de vidro ou palito de madeira.
c) Observar por at 60seg.
E. coli
e. C e.e. COLI
Pseudomonas
Vibrio
Resultado e Interpretao
A prova considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor
prpura em at 1 minuto e considerada negativa quando a colorao da massa bacteriana permanece com
colorao inalterada. A alterao da cor da cultura aps o perodo de tempo estipulado consequncia da
oxidao do reagente em contato com o ar.
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DESENVOLVIDA
Prpura
Inalterado
INTERPRETAO
Citocromo oxidase +
Citocromo oxidase -
As enterobactrias so oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outras famlias de bastonetes Gram
negativos. Como a famlia Pseudomonadaceae e a famlia Vibrionaceae. A prova pode ser feita tambm em
culturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reao inicia-se com o
desenvolvimento de cor rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie das colnias, indicativa da
produo de citocromo-oxidase (teste positivo). O teste negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver o
desenvolvimento de uma cor rsea plida.
COR DO MEIO
Amarelo
Incolor
INTERPRETAO
Presena de -galactosidase
Ausncia de -galactosidase
COR DO MEIO
Verde
Incolor
INTERPRETAO
Presena de cido fenilpirvico
Ausncia de cido fenilpirvico
- PROVA DA CATALASE
Objetivo:
Determinar se o microrganismo possui a enzima catalase
Base Bioqumica
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio.
H2O2
catalase
2H2O + O2
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao em agar inclinado ou
em placa;
b) Incubar a 37C/24h;
c) Verter 0,1 mL (ou algumas gotas) de gua oxigenada sobre o crescimento
bacteriano e observar.
Nota: Este teste pode ser feito tambm colocando uma colnia em uma lmina e
adicionando-se uma gota de gua oxigenada.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
ASPECTO DO MEIO
Formao de bolhas
Ausncia de bem bolhas
INTERPRETAO
Catalase +
Ausncia de catalase
- PROVA DA COAGULASE
Objetivo
Verificar a capacidade de microrganismos coagularem o plasma meso em presena de anticoagulante.
Base Bioqumica
As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similar
ao da coagulao normal.
A atividade da coagulase utilizada para distinguir a espcie Staphylococcus
aureus das demais espcies do gnero. Pode ser feita de duas maneiras: em
lmina e em tubo. Na coagulase ligada ou conjugada, pesquisa-se a presena
da enzima que se encontra ligada parede celular bacteriana (no est presente
em filtrados de cultivos. Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma
(fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento
sob a forma de grumos visveis.
A coagulase livre uma substncia similar trombina (presente em filtrados de
cultivos). secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente
no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um
complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio que convertido em fibrina,
originando os cogulos.
Metodologia
- Prova da coagulase em tubo (coagulase livre):
a) Colocar 0,5mL de plasma (obtido de sangue de carneiro, cavalo ou coelho) em um tubo de ensaio pequeno (13
x 100mm);
b) Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, suspender uma colnia da cultura em estudo em caldo BHI e colocar
em estufa 37C at que turve. Se necessrio, acertar a turbidez at o tubo 0,5 da escala de MacFarland;
c) Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5mL de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento
bacteriano recm preparado;
d) Incubar em estufa 37C at que turve.
e) Verificar a formao de cogulos aps 2h, 4h, 6h e 24h de incubao pela inclinao do tubo em um ngulo de
quase 90. A formao de cogulo a qualquer momento encerra a prova, que considerada positiva. A ausncia
de coagulao aps 24 horas de incubao indicativa de uma prova negativa.
COR DO MEIO
Bolhas
Sem bolhas
INTERPRETAO
Catalase +
Ausncia de catalase
- PROVA DA DNAse:
Objetivo
usado para detectar a degradao do cido Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por
bactrias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease,
Base Bioqumica
A enzima DNAse, que quebra o DNA em subunidades compostas de
nucleotdeos, produzida por muitas espcies de microrganismos.
Assim, esta prova muito til para diferenciaro gnero Serratia do
gnero Enterobacter; a espcie Staphylococcus aureus das espcies de
estafilococos coagulase
negativos
e Moraxella
catarrhalis de
espcies
de Neisseria. O DNA acrescentado ao meio de cultura e se no hidrolisado
precipitado por uma soluo de HCl a 0,1N, que torna o meio opaco. Quando o
DNA hidrolisado forma-se um halo translcido em torno da cultura.
Metodologia
a) Fazer uma estria ou uma macrocolnia na superfcie do agar DNAse co o
auxlio de uma ala bacteriolgica.
b) Incubar a 37C por 18 a 24h.
c) Derramar cerca de 1mL de HCl a 0,1N na superfcie do meio de cultura, fechar
e deixar descansar por cerca de 5min.
Resultado e Interpretao
A presena de zona clara em volta da colnia indica reao positiva. Caso no haja atividade dessa enzima o HCl
reagir com o cido nuclico intacto, formando um precipitado (meio opaco), o que indica a reao negativa.
RESULTADO
Positivo
Negativo
ASPECTO DO MEIO
Formao de halo translcido
Ausncia de halo translcido
INTERPRETAO
Presena de DNAse
Ausncia de DNAse
Metodologia
a) Inocular a cultura em agar amido;
b) Incubar a 37C/24h;
c) Cobrir com uma soluo de iodo (3 a 4 mL por placa) e observar.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo
COR DO MEIO
Halo translcido
Ausncia de halo
INTERPRETAO
Presena de amilase
Ausncia de amilase
O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. Assim, o surgimento de uma zona clara em
torno do crescimento bacteriano aps a adio de iodo a um meio que contenha amido indica que a -amilase foi
produzida pela bactria. Se no ocorrer a formao de uma zona clara ao redor do crescimento bacteriano, o
amido no foi hidrolisado, indicando que a cultura em teste no produtora da -amilase.
Amilase negativa
Amilase positiva
COR DO MEIO
Halo translcido
Ausncia de halo
INTERPRETAO
Presena de gelatinase
Ausncia de gelatinase
ASPECTO DO MEIO
Halo translcido em trono do
crescimento bacteriano
Ausncia de halo
INTERPRETAO
Atividade hidroltica da casena
Ausncia de atividade hiroltica
COR DO MEIO
Violeta escuro
Inalterado
INTERPRETAO
Presena de hipuricase
Ausncia de hipuricase
COR DO MEIO
Marrom a negro
Inalterado
INTERPRETAO
Presena de gelatinase
Ausncia de gelatinase
3- Bactray