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MANUAL TCNICO DE ANLISES

MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS
- MONITORIA -

GEISEANNY FERNANDES DO AMARANTE MELO


JOSSANA PEREIRA DE SOUSA
KARLA KALIGIA DA SILVA
MARIA LCIA DA CONCEIO
Orientadora

Geiseanny Fernandes do Amarante Melo1 (Voluntria)


Jossana Pereira de Sousa1 (Voluntria)
Karla Kaligia da Silva1 (Bolsista)
Maria Lucia da Conceio
Orientadora

MANUAL TCNICO DE ANLISES EM


MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

1
2

Discentes do Curso de Graduao em Nutrio, do Centro de Cincias da Sade/UFPB


Professora Adjunta do Departamento de Nutrio, do Centro de Cincias da Sade/UFPB

Agradecimentos

Primeiramente, agradeo a Deus, pois sem ele nada seria possvel, por guiar meus
caminhos, dando sabedoria para conduzi-lo. Aos meus pais, por todo apoio, compreenso
e respeito. Professora Maria Lcia da Conceio, pela oportunidade de crescimento na
formao acadmica, alm de servir como exemplo de profissional pelo seu incentivo,
dedicao e confiana. Ao Programa de Monitoria, por permitir e incentivar o
desenvolvimento pedaggico na carreira acadmica. s companheiras de Monitoria,
Jossana Pereira de Sousa e Karla Kaligia da Silva, que colaboraram na diviso dos
trabalhos, relatrios, preparao de aulas, pelo apoio, compreenso e fora nos desafios.

Geiseanny Fernandes

A Deus, por estar sempre presente na minha vida, e tornar tudo possvel. Agradeo
Professora Maria Lcia da Conceio pelos ensinamentos, conselhos e incentivos, pela
orientao, compreenso, credibilidade, amizade e oportunidade de, junto Karla e
Geiseanny, realizar este trabalho. s amigas Karla e Geiseanny pelo convvio durante
esse perodo.

Jossana Sousa

Agradeo primeiramente a Deus, o mais fiel companheiro que me concedeu o dom da vida
e me abenoou com sade me proporcionando a capacidade de buscar meus ideais. Aos
meus pais e irms que com amor sempre me incentivaram; ao meu noivo que com pacincia
e carinho abdicou da minha presena e me deu fora a todo o momento; a professora
Maria Lcia da Conceio, e s amigas Jossana e Geisy, pois sem elas no seria possvel
realizao deste trabalho.

Karla Kaligia da Silva

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 rea de produo.............................................................................................12


Figura 2 Autoclave 121 C ...........................................................................................13
Figura 3 Estufa a 180 C ................................................................................................13
Figura 4 Cmara assptica .............................................................................................13
Figura 5 Estufas bacteriolgicas..................................................................................14
Figura 6 Banho-maria ......................................................................................................14
Figura 7 Autoclave a 121 C...........................................................................................15
Figura 8 rea de lavagem e higienizao ...................................................................15
Figura 9 Refrigeradores ................................................................................................16
Figura 10 Armrios..........................................................................................................16
Figura 11 Almoxarifado .................................................................................................17
Figura 12 Layout do laboratrio de microbiologia dos alimentos/DN/CCS/UFPB
..................................................................................................................................................18
Figura 13 Equipamentos utilizados em laboratrios de Microbiologia de
Alimentos................................................................................................................................19
Figura 14 Banho-maria ....................................................................................................20
Figura 15 Balana semi-analtica ..................................................................................21
Figura 16 Contador de colnias.....................................................................................22
Figura 17 B.O.D ................................................................................................................23
Figura 18 Agitador de tubos .........................................................................................23
Figura 19 Estufa bacteriolgica ...................................................................................25
Figura 20 Stomacher.......................................................................................................26
Figura 21 Cmara de fluxo laminar..............................................................................26
Figura 22 Microscpio.....................................................................................................27
Figura 23 Bales de fundo chato..................................................................................28
Figura 24 Proveta, becker, Erlenmeyer e tubo de ensaio ......................................29

Figura 25 Placas de Petri, pipetas sorolgicas, pipetas tipo Pasteur e basto de


vidro.........................................................................................................................................30
Figura 26 Estante de suporte, esptula metlica.....................................................31
Figura 27 Frasco lavador, Bicos de Bunsen ...............................................................31
Figura 28 Telas de amianto, trip de ferro, frascos. .............................................32
Figura 29 Pipetadores automticos, alas de Drigalski,manta aquecedora .......32
Figura 30 Escorredor de vidrarias, agulhas de platina, ala de platina ..............33
Figura 31 Pina metlica, escova ..................................................................................33
Figura 32 Pina de Mohor, pinas de Hofmann, Jarra de Gaspar.........................34
Figura 33 Pina e cronmetro .......................................................................................34
Figura 34 Jaleco branco para uso em laboratrio ....................................................36
Figura 35 Luva cirrgica, culos de proteo, mscara, e touca descartvel....37
Figura 36 Guarda-volumes..............................................................................................37
Figura 37 Tubos de ensaio na estante de suporte ...................................................38
Figura 38 Lavar as mos.................................................................................................39
Figura 39 Extintores de incndio.................................................................................39
Figura 40 Mtodo para preparo de Placas de Petri.................................................42
Figura 41 Mtodo para preparo de pipetas ...............................................................42
Figura 42 Mtodo para preparo de frasco de homogeneizao ............................43
Figura 43 Mtodo para preparo de bales e Erlenmeyeres ...................................44
Figura 44 Mtodo de preparo de Becker.................................................................. 44
Figura 45 Estufa a 180C aberta e fechada..............................................................45
Figura 46 Autoclave vertical .........................................................................................46
Figura 47 Coleta de gua ................................................................................................52
Figura 48 Leitura do rotulo do meio de cultura ........................................................60
Figura 49 Pesagem do meio de cultura........................................................................60
Figura 50 Esquema da metodologia para contagem de bactrias aerbias
mesfilas.................................................................................................................................65

Figura 51 Esquema da metodologia para contagem de bolores e leveduras.......71


Figura 52 Esquema da metodologia dos testes presuntivo e confirmativo para
enumerao de coliformes totais......................................................................................77
Figura

53

Esquema da metodologia para enumerao de coliformes

termotolerantes....................................................................................................................78
Figura 54 - Tubos contendo Caldo Lactose bile Verde Brilhante (CLBVB)
positivos..................................................................................................................................79
Figura 55 Esquema da metodologia para contagem, isolamento e identificao
de Estafilococos coagulase positiva .................................................................................83
Figura 56 Esquema da metodologia para contagem e isolamento de Bacillus

cereus ......................................................................................................................................89
Figura 57 Metodologia da colorao de Gram...........................................................95
Figura 58 (1) Cocos gram-positivos, (2) Bacilos gram-negativos...........................96

SUMRIO
PREFCIO
APRESENTAO
CAPTULO 1 ESTRUTURA DO LABRATRIO DE MICROBIOLOGIA DOS
ALIMENTOS........................................................................................................................11
1.1 APRESENTAO DO LABORATRIO ................................................................11
1.2 DESCRIO DA REA FSICA............................................................................11
1.3 EQUIPAMENTOS.....................................................................................................18
1.4 VIDRARIAS ...............................................................................................................28
1.5 ACESSRIOS ...........................................................................................................30
Exerccios..........................................................................................................................35
CAPTULO 2 A IMPORTNCIA DA APLICAO DAS NORMAS DE
SEGURANA ........................................................................................................................36
2.1 SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA ............................36
2.2 RECOMENDAES SOBRE AS NORMAS DE SEGURANA ........................36
Exerccios..........................................................................................................................40
CAPTULO 3 - PREPARO E ESTERELIZAO DE MATERIAIS PARA USO
EM ANLISES MICROBIOLGICAS..........................................................................41
3.1 PREPARO DE MATERIAIS.....................................................................................41
3.2 ESTERILIZAO ....................................................................................................45
3.3 DESCONTAMINAO E DESCARTE DE RESDUOS ...................................47
3.4 LAVAGEM...................................................................................................................47
Exerccios..........................................................................................................................49
CAPTULO 4 - COLETA DE AMOSTRAS..................................................................50
4.1 OBTENO DAS AMOSTRAS E CONDIES DA COLETA.........................50
4.2 TIPOS DE AMOSTRAS ..........................................................................................52

Exerccios..........................................................................................................................56
CAPTULO 5 MEIOS DE CULTURA .........................................................................57
5.1 DESCRIO DE MEIOS DE CULTURA...............................................................57
5.2 CLASSIFICAO FUNCIONAL DOS MEIOS DE CULTURA.......................58
5.3 CARACTERSTICAS DE ALGUNS INGREDIENTES COMPLEXOS............59
5.4 METODOLOGIA.......................................................................................................60
5.5 EXEMPLOS DE FRMULAS DE UM MEIO DE CULTURA.............................61
Exerccios..........................................................................................................................62
CAPTULO

CONTAGEM

PADRO

DE

BACTRIAS

AERBIAS

MESFILAS.........................................................................................................................63
6.1 CONTAGEM PADRO EM PLACAS ......................................................................63
6.2 MATERIAL NECESSRIO ....................................................................................64
6.3 METODOLOGIA.......................................................................................................64
6.4 LEITURA ....................................................................................................................66
6.5 RESULTADOS...........................................................................................................66
Exerccios..........................................................................................................................67
CAPTULO 7 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS..................................68
7.1 BOLORES E LEVEDURAS .......................................................................................68
7.2 MATERIAL NECESSRIO ....................................................................................70
7.3 METODOLOGIA.......................................................................................................70
7.4 LEITURA ....................................................................................................................72
7.5 RESULTADOS...........................................................................................................73
Exerccios..........................................................................................................................74
CAPTULO

ENUMERAO

DE

COLIFORMES

TOTAIS

TERMOTOLERANTES .......................................................................................................75
8.1 CARACTERIZAO DO GRUPO COLIFORME ..................................................75
8.2 MATERIAL NECESSRIO ....................................................................................76
8.3 METODOLOGIA.......................................................................................................76

8.4 LEITURA ....................................................................................................................79


8.5 RESULTADOS...........................................................................................................79
Exerccios..........................................................................................................................80
CAPTULO

CONTAGEM,

ISOLAMENTO

IDENTIFICAO

DE

ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA .............................................................81


9.1 CARACTERIZAO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA .......81
9.2 MATERIAL NECESSRIO ....................................................................................82
9.3 METODOLOGIA.......................................................................................................83
9.4 LEITURA ....................................................................................................................85
9.5 RESULTADOS...........................................................................................................85
Exerccios..........................................................................................................................86
CAPTULO 10 CONTAGEM EM PLACAS DE BACILLUS CEREUS..................87
10.1 CARACTERIZAO DO GNERO BACILLUS CEREUS ................................87
10.2 MATERIAL NECESSRIO...................................................................................88
10.3 METODOLOGIA .....................................................................................................88
10.4 LEITURA ..................................................................................................................90
10.5 RESULTADOS.........................................................................................................91
Exerccios..........................................................................................................................92
CAPTULO 11 COLORAO DE GRAM...................................................................93
11.1 MTODO COLORAO DE GRAM......................................................................93
11.2 MATERIAL NECESSRIO ...................................................................................94
11.3 METODOLOGIA......................................................................................................94
11.4 LEITURA ...................................................................................................................95
Exerccios..........................................................................................................................97
Bibliografia consultada

PREFCIO
A disciplina Microbiologia dos Alimentos tem um papel fundamental em
firmar conceitos importantes, bem como demonstrar na prtica aos estudantes
do curso de nutrio sobre a importncia do controle-higinico sanitrio dos
alimentos.
Os

contedos

apresentados

na

presente

disciplina

fornecem

os

conhecimentos bsicos no que se refere ao entendimento sobre bactrias e


fontes de contaminao mais propcias de acordo com as caractersticas
especficas de cada grupo de alimentos. Coloca ainda sobre os riscos e
conseqncias de uma proliferao bacteriana indevida que por sua vez podem
implicar deteriorao do alimento ou contaminao por bactrias patognicas
causadoras de doenas.
Neste sentido, constatou-se a necessidade da elaborao da primeira
edio de um manual de tcnicas de anlises no laboratrio de Microbiologia dos
Alimentos que auxilia a insero do alunado de nutrio no ambiente do
laboratrio de Microbiologia dos Alimentos. Este trabalho explana sobre as
metodologias de anlises microbiolgicas desenvolvidas para a deteco de
microrganismos presentes em alimentos bem como no ambiente em que
produzido, nos equipamentos e utenslios utilizados a fim de avaliar se a
segurana do alimento est sendo preservada.
Dessa forma, o manual de tcnicas contribuir no acompanhamento da
disciplina ministrada proporcionando aos estudantes uma formao mais
completa, tendo em vista o acompanhamento dessa rea da nutrio que engloba
questes atuais como o avano pesquisas e desenvolvimento de projetos.

APRESENTAO

O presente manual foi elaborado pela equipe de monitoria da disciplina de


Microbiologia dos Alimentos como uma proposta de material didtico para uso do
alunado nas aulas prticas da disciplina subsidiando tambm os monitores ao
ministrar cada aula.
O manual rene os principais assuntos ministrados durante o curso de
Microbiologia dos Alimentos reunindo os contedos disponveis na literatura,
facilitando o acesso aos contedos e funcionando como guia para o trabalho no
laboratrio de forma objetiva e ilustrada para ser utilizado por profissionais,
estudantes de nutrio e pessoas interessadas nesta rea.
Este trabalho inclui a cada captulo apresentado uma breve introduo que
explana sobre cada assunto de forma descritiva, metodologia que explanada
passo a passo e com a apresentao de esquemas e exerccios que auxiliam na
fixao dos contedos.
Almejamos que este manual sirva como material til para o entendimento e
realizao das atividades no laboratrio, de forma a contribuir para a agregao
de novos conhecimentos e formao acadmica.

Os autores

Manual Tcnico de Anlises Microbiolgicas/Monitoria//DN/UFPB

11

ESRUTURA DO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DOS


ALIMENTOS
Captulo 1
1.1 APRESENTAO DO LABORATRIO_________________________

O Laboratrio de Microbiologia dos Alimentos est dividido em reas


devidamente equipadas e providas de materiais que favorecem uma melhor
organizao e utilizao dos meios necessrios para a execuo das anlises nele
desenvolvidas.
Para que os trabalhos realizados no laboratrio tenham resultados
garantidos e que sejam desempenhados com segurana imprescindvel que tais
recursos sejam mantidos em boas condies de uso e que os usurios estejam
bem instrudos sobre como manuse-los, bem como ter o domnio dos mtodos de
conservao e higienizao de materiais e o conhecimento das tcnicas
microbiolgicas.
O laboratrio constitui-se basicamente pelos setores de produo,
esterilizao e descontaminao, higienizao de materiais, almoxarifado,
incubao e cmara assptica e ainda vestirios, sanitrios e administrao. de
suma importncia que estas reas estejam dispostas em ordem satisfatria a
facilitar as atividades desenvolvidas, seguindo um fluxo que otimize o mnimo de
probabilidade de contaminaes.
1.2 DESCRIO DA REA FSICA________________________________

1.2.1 Setor de produo

o local destinado ao preparo de meios de cultura, solues e materiais


necessrios para a execuo das anlises. importante que neste ambiente as

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12

bancadas estejam sempre organizadas e higienizadas e que sejam dotadas de


gavetas e portas para o acondicionamento devido de vidrarias e acessrios.

Figura 1 rea de produo

1.2.2 Setor de esterilizao

Destina-se a promover a iseno de microrganismos em meios de cultura e


materiais que sero utilizados nas anlises microbiolgicos. Os materiais
destinados esterilizao devem ser previamente preparados como descrito no
captulo 3. A esterilizao pode ser realizada por meio do emprego do calor seco
em estufa 180 C por 2 h a presso 1 atm (mais utilizada para vidrarias) ou por
calor mido em autoclave operando 121 C por 15 minutos e 1 atm (utilizadas
para meios de cultura, suspenses bacterianas, etc.).

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Figura 2 Autoclave 121 C

13

Figura 3 Estufa 180 C

(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

1.2.3 Cmara assptica

Neste local so realizadas exclusivamente as anlises microbiolgicas,


inoculaes e/ou semeadura de colnias, bem como a contagem de placas. de
suma importncia que as superfcies das bancadas estejam sempre desinfetadas,
para isso necessrio o uso de lmpada ultravioleta. O ambiente deve ser dotado
de contador de colnias, agitador de tubos e balana semi-analtica.

Figura 4 Cmara assptica

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1.2.4 Setor de incubao

Este espao destina-se incubao de placas e tubos inoculados e para


isso preciso que este seja dotado de estufas, banho-maria e demanda
bioqumica de oxignio (B.O.D.). Tais equipamentos devem ser regulados quanto
sua temperatura de acordo com os microrganismos estudados, visando
manuteno de ambientes propcios para o desenvolvimento bacteriano.

Figura 5 Estufas bacteriolgicas

Figura 6 Banho-maria

(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

1.2.5 Setor de descontaminao

Aps a leitura de todo o material incubado e tambm aps as anlises, os


materiais que estiveram em contato com os microrganismos esto altamente
contaminados, ento, para serem descontaminados devem ser nesta rea,
submetidos a uma autoclavao de 30 minutos a uma temperatura de 121 C e 1
atm.

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Figura 7 Autoclave 121 C

(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

1.2.6 rea de lavagem e higienizao de materiais


Nesta rea so desenvolvidas as atividades de pr-lavagem com o descarte
do material descontaminado e a retirada do excesso de matria orgnica, a
lavagem propriamente dita material em soluo detergente e deixando de molho
por 2 horas ou um pouco mais, dependendo do grau de aderncia do material.
Devem-se tambm nesta fase, com o auxlio de escovas e esponjas, esfregar os
frascos e demais utenslio e remover tambm as anotaes de lpis e canetas. Em
seguida feito o enxge de todo o material em gua corrente, por dez vezes
sucessivas, depois feito um novo enxge com gua destilada, pelo menos uma
vez e o material exposto secagem ambiente.

Figura 8 rea de lavagem e higienizao

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1.2.7 Setores de materiais


Tem por finalidade armazenar material preparado, no preparado, meios
de cultura desidratados e prontos, como tambm material contaminado. Este
setor dotado de armrios onde so guardadas as vidrarias e duas geladeiras,
uma para acondicionamento de materiais estreis, como meios de cultura
prontos, e outra para os materiais contaminados.

Figura 9 Refrigeradores

Figura 10 Armrios

(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

1.2.8 Almoxarifado
Este local deve ser dividido em setores com diferentes finalidades para
atender as necessidades, ou seja, para a guarda de equipamentos obsoletos e em
desuso, conservao do estoque de meios de cultura, reagentes e solventes, alm
de materiais de limpeza que devem ser mantidos separados e identificados.
Neste ambiente preciso que os materiais, meios de cultura, reagentes,
solventes e materiais de limpeza sejam guardados separadamente e devidamente
identificados. importante que este local esteja sempre limpo, que haja
ventilao e seja livre de iluminao excessiva.

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O profissional responsvel por esse setor deve manter o controle dos


materiais atualizados, com data de entrada, sada e o nome do pessoal que os
solicita.

Figura 11 Almoxarifado

1.2.9 Vestirios e sanitrios


Os vestirios so locais destinados guarda de volumes e troca de
vestimentas. Os sanitrios devem ser para uso exclusivo do pessoal do
laboratrio e de preferncia que seja separado o feminino do masculino. Devem
ser externos s dependncias laboratoriais e estarem sempre com toalhas de
papel de sabonete de preferncia lquido disponveis.
1.2.10 Recepo e Administrao
A recepo o local destinado a receber os visitantes, bem como
execuo da frao terica da aula prtica. A administrao o local destinado
permanncia do pessoal da coordenao, professores e tcnicos. A figura 12
uma

representao

do

Laboratrio

de

Microbiologia

Departamento de Nutrio, Centro de Cincias da Sade, UFPB.

dos

Alimentos,

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Figura 12 Layout do Laboratrio de Microbiologia dos Alimentos/DN/CCS/UFPB

1.3 EQUIPAMENTOS___________________________________________
Os

equipamentos

necessrios

para

um

laboratrio

so

recursos

indispensveis para a execuo e andamento das atividades desenvolvidas. Cada


material apresenta uma operacionalizao individualizada, que requer do pessoal
envolvido conhecimento sobre o funcionamento, limpeza e manuteno de cada
um. Os equipamentos podem ser divididos em: esttico e mvel. Os estticos so
representados por estufas bacteriolgicas, autoclaves e como mveis tem-se
agitador de tubos ou vortex, lavador automtico de pipetas e contador de
colnias. Cada equipamento requer a descrio de suas funes, evitando assim
equvocos execuo de atividades dirias que deve ser disponibilizado para
todos aqueles que trabalham no laboratrio.

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Figura 13 Equipamentos utilizados em laboratrio de microbiologia de alimentos. 1.


Geladeiras; 2. Estufa 180 C; 3. Banho-maria; 4. Depsito de gua; 5. Microondas; 6.
Autoclave vertical 121 C; 7. Agitador de tubos; 8. Microscpio; 9. Estufas
bacteriolgicas; 10. Lavador de pipetas; 11. Contador de colnias; 12. Autoclave vertical
121C; 13. Balana semi-analtica.
(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

1.3.1 DESCRIO DOS EQUIPAMENTOS_________________________


1.3.1.1 Autoclaves
Quais as funes?
Esses equipamentos so amplamente utilizados em laboratrios de
microbiologia, que tem por finalidade propiciar a esterilizao e descontaminao
de materiais e meios de cultura por calor mido, sob presso ou vapor fluente.
Podem

ser

encontradas

comercialmente

sob

diferentes

volumtricas, variando de 18 L a 150 L, munidas de um ou dois cestos.

capacidades

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Como manusear?

Verificar a higienizao do equipamento;

Adicionar gua at o nvel do suporte do cesto;

Colocar os cestos;

Ligar o equipamento;

Baixar a tampa e deixar aquecer a gua;

Colocar o material para esterilizar nos cestos;

Fechar completamente a tampa;

Fechar a vlvula de escape de vapor, se no sob vapor fluente;

Esperar a temperatura alcanar 121 oC;

Marcar o tempo necessrio para a esterilizao (15 ou 30 min.);

Transcorrido o tempo de esterilizao, desligar o equipamento;

Deixar baixar a temperatura;

Abrir a vlvula e em seguida a tampa;

Retirar o material esterilizado.

1.3.1.2 Banho-Maria

Figura 14 Banho-maria

Quais as funes?
Empregado para aquecimentos a baixas temperaturas..
Como manusear?

Verificar se o equipamento est ligado corretamente;

20

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21

Verificar se o reservatrio de gua est limpo;

Adicionar gua corrente no reservatrio at o nvel;

Instalar no orifcio localizado na parte superior do instrumento o


termmetro;

Acionar o dispositivo liga/desliga;

Esperar que a temperatura atinja a desejada;

Caso no esteja estabilizada, ajustar a temperatura movendo para a


direita ou esquerda o t

ermostato;

Quando a temperatura desejada for alcanada, verificar que esta


permanece estvel por aproximadamente 1 hora.

1.3.1.3 Balana Semi-Analtica

Figura 15 Balana semi-analtica

Quais as funes?
Indispensvel no laboratrio. Amplamente utilizada para pesagens de meios
desidratados.
Como manusear?

Antes de iniciar os trabalhos de pesagem, verificar se a balana est bem


instalada, nivelada, zerada e limpa;

Colocar o becker, Erlenmeyer ou balo no prato da balana;

Ligar a balana;

Tarar o peso do recipiente;

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Adicionar cuidadosamente a quantidade necessria do material pesar;

Ajustar o peso;

Ao trmino da pesagem, retirar o recipiente da balana;

Zerar e desligar a balana.

22

1.3.1.4 Contador de Colnias

Figura 16 Contador de colnias


(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

Quais as funes?
Utilizado para a realizao da contagem de colnias em placas de Petri.
Como manusear?

Verificar se o contador est ligado corretamente, acionando o dispositivo


liga/desliga;

Colocar a placa inoculada no suporte do instrumento, com o fundo voltado


para a lente;

Ligar o instrumento;

Retirar a placa do suporte;

Fazer a contagem das colnias por quadrante com o auxlio de lpis


hidrocor;

Desligar o instrumento e mant-lo sempre protegido, para evitar


impregnao de poeira.

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23

1.3.1.5 B.O.D (Demanda Bioqumica de Oxignio)

Figura 17 B.O.D.

Quais as funes?
um equipamento cuja estrutura assemelha-se a de um refrigerador,
entretanto, na para superior encontra-se instalada uma estufa munida de
controles para ajustar a temperatura. Quando da incubao de bolores e
leveduras, a temperatura tima exigida para crescimento 25 0C (Figura 20). O
processo de higienizao deste equipamento deve ser realizado periodicamente,
com a finalidade de evitar contaminaes capazes de comprometer os resultados.
1.3.1.6 Agitador de tubos

Figura 18 Agitador de tubos

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24

Quais as funes?
Empregado para agitao mecnica de reativos e tubos com diluio.
Como manusear?

Verificar se o contador est ligado corretamente, acionando o dispositivo


liga/desliga;

Manter o agitador ligado;

Colocar o tubo na cavidade do instrumento, segurando-o com cuidado por


um tempo para promover a agitao;

Retirar o tubo e repetir a operao quanto necessrio;

Desligar o instrumento;

Fazer a limpeza se for o caso e mant-lo protegido.

1.3.1.7 Estufa para Esterilizao e Secagem


Quais as funes?
Empregada para esterilizao e secagem atravs do calor seco, de frascos,
Erlenmeyer, bales, pipetas, placas de Petri e outros materiais de laboratrio.

Como manusear?

Verificar se a estufa est ligada corretamente, acionando o dispositivo


liga/desliga;

Instalar o termmetro na parte superior da estufa;

Verificar a temperatura inicial;

Estabilizar a estufa para a temperatura de trabalho girando o termostato


para a direita ou para a esquerda de acordo com a temperatura desejada
(180 0C);

Quando a temperatura desejada for alcanada, verificar que esta


permanece estvel por aproximadamente 1 hora.

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25

Iniciar a esterilizao. A contagem do tempo ser realizada aps a estufa


atingir a temperatura ideal e deixar os sob aquecimento por 1 a 2 horas.

1.3.1.8

Estufa Bacteriolgica

Figura 19 - Estufa bacteriolgica

Quais as funes?
Empregada para incubao de placas, tubos ou frascos inoculados com
cultura bacteriana.
Como manusear?

Verificar se a estufa est ligada corretamente, acionando o

dispositivo

liga/desliga;

Instalar o termmetro na parte superior da estufa;

Verificar a temperatura inicial;

Estabilizar a estufa para a temperatura de trabalho girando o termostado


para a direita ou para a esquerda, de acordo com a temperatura desejada
(35 0C ,37 0C, 45 0C ou 55 0C);

Quando a temperatura desejada for alcanada, verificar se permanece


estvel por aproximadamente 1/2 hora.

Manter a estufa sempre ligada para evitar desestabilizao.

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26

1.3.1.9 Stomacher (Homogeneizador de amostra)

Figura 20 Stomacher

Quais as funes?
Empregado para homogeneizar amostras com o diluente.
Como manusear?

um instrumento constitudo de uma cmara contendo duas ps que batem


em movimento de vai-e-vem.

Inicialmente, realiza-se a abertura da porta da cmara e o saco estril


contendo a amostra e o diluente introduzido no seu interior.

Fecha-se a porta mantendo o saco preso.

Ligar e deixar sob agitao por aproximadamente 3-5 min. O batimento


das ps desmancha a amostra, permitindo que os microrganismos nela
presentes se transfiram para a fase aquosa.

1.3.1.10

Cmara de fluxo laminar

Figura 21 Cmara de fluxo laminar

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27

Quais as funes?
Esse equipamento indispensvel em um laboratrio de microbiologia,
principalmente no momento de execuo de atividades que requerem alto grau de
assepsia.
Como manusear?
de manuseio simples, apresenta bancada na qual deve-se dispor todo o
material a ser utilizados durantes uma determinada atividade. Deve ser instalado
bico de Bunsen e lmpadas germicidas; a porta mvel permite manter o ambiente
interno isento de contaminaes.
1.3.1.11

Microscopia

Figura 22 Microscpio

Quais as funes?
Amplamente utilizado para leitura de lminas, com capacidade de aumento
tico, definindo as formas morfolgicas de microrganismos.
Como manusear?

Ligar o microscpio;

Fixar a lmina no suporte e escolher a objetiva para observao;

A objetiva de 40 utilizada para a observao de fungos e a de 100 para


as bactrias.

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28

1.4 VIDRARIAS____________________________________________
As vidrarias so materiais presentes no laboratrio utilizadas na
realizao das anlises microbiolgicas; possuem grande diversidade de formas e
tamanhos que se adequam as diferentes atividades requeridas durante os
trabalhos. So objetos frgeis, que necessitam de cuidado especial quanto ao seu
manuseio, limpeza e armazenamento.

1.4.1 DESCRIO DAS VIDRARIAS_____________________________


1.4.1.1 Bales sem esmerilhao
Os bales sem a esmerilhao so os mais utilizados em microbiologia,
teis no preparo meios.
Fundo chato sem boca esmerilhada

Figura 23 Bales de fundo chato

1.4.1.2 Beckeres, provetas graduadas e tubos de ensaio.


Os beckeres so teis para dissoluo e pesagem de meio de cultura.
Comercialmente, podem ser adquiridos sob as formas vidro e plstico e variados
volumes.

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29

As provetas graduadas ou cilindro de vidro so empregados para a medio


de lquidos. Esto venda em plstico com base hexagonal tambm em plstico,
em vidro com base hexagonal em plstico, em diferentes volumetrias. O cilindro
de vidro tambm designadas como provetas, destinam-se a medies de lquidos,
no caso de preparo de meios til na medio do volume de gua necessrio para
a sua dissoluo.
Os tubos de ensaio empregados na microbiologia para teste bioqumico,
anlises microbiolgicas, inoculao e para conservao de cepas. Em geral, so
preparados e esterilizados antes de seu uso.

Figura 24 Proveta, becker, Erlenmeyer e tubo de ensaio

1.4.1.3 Placas de Petri, bastes de vidro, pipetas sorolgicas ou graduadas.


As placas de Petri so utilizadas durante as anlises para semeadura. So
comercializadas em vidro e em plstico designadas como descartveis em
diferentes dimetros. Os bastes em vidros so empregados para homogeneizar
e auxiliar na transferncia de lquidos.
As pipetas sorolgicas ou graduadas so cilindros com uma das
extremidades afiladas utilizadas para medio de lquidos com escoamento de
volumes fracionados. Comercialmente podem ser encontradas em diferentes
volumetrias, ou seja, de 0,1 a 50 mL e divises decimais de 1/10 ou 1/100.

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30

Figura 25 Placas de Petri, pipetas sorolgicas, pipeta tipo Pasteur e basto de vidro

1.5 ACESSRIOS___________________________________________
Os acessrios so recursos importantes dentro do laboratrio visto que
eles auxiliam nas atividades desenvolvidas antes, durante e aps as anlises
microbiolgicas proporcionando maior facilidade para o manuseio das vidrarias,
dando um suporte para uma melhor segurana, diminuindo o risco de possveis
acidentes.

1.5.1 DESCRIO DOS ACESSRIOS____________________________


1.5.1.1 Esptulas, estantes de suporte.
As esptulas se apresentam comercialmente sob as formas de colher e
meia-calha metlica e com o cabo em madeira. So necessrias na pesagem e
homogeneizao de substncias slidas, alm de auxiliar na transferncia de
material slido.
As estantes ou suporte para tubos so amplamente utilizados na
microbiologia durantes anlise pela tcnica dos tubos mltiplos, para diluies
decimais e para reaes bioqumicas.

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31

Figura 26 Estante de suporte, esptula metlica

1.5.1.2 Frasco lavador ou pincetas, Bico de Bunsen.

O frasco lavador ou pincetas so utilizados para acondicionar gua


destilada ou soluo alcolica, necessrios em laboratrio de microbiologia. O
bico de Bunsen uma boa fonte de calor seco, usado para gerar ou manter
aquecimento, na dissoluo de meios de cultura e flambagem.

Figura 27 Frasco lavador, Bicos de Bunsen

1.5.1.3 Tela de amianto, trip de ferro, frascos.

A tela de amianto um acessrio indispensvel para o processo de


aquecimento, pois d sustentao para o recipiente que vai ser aquecido. As telas
podem ser encontradas no comrcio sob diferentes tamanho, sendo adquiridas
expressando a rea da mesma.

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32

O trip de ferro atua como suporte para a tela de amianto e o recipiente e


adquirido comercialmente em diversificados tamanhos e dimetros. Os frascos
em plstico ou vidro so utilizados para o acondicionamento e conservao de
solues.

Figura 28 Telas de Amianto, trip de ferro, e frascos.

1.5.1.4.Pipetadores automticos, ala de DrigalsK, manta aquecedora.


Os pipetadores automticos so utilizados para pipetar utilizando
ponteiras descartveis que so acopladas na ponta afilada do instrumento. Para
manipular o pipetador, coloca-se a ponteira na extremidade, pressionar a parte
superior com vigor e procede a imerso no lquido, despressionando o dedo. A ala
de DrigalsK pregada para promover o espalhamento de inculo; j a manta
aquecedora para aquecimento, em particular de bales contendo meio de cultura
para dissolver ou outro lquido.
A manta aquecedora, comercialmente pode ser encontrada em diversas
formas e modelos, cujo calor gerado por resistncia eltrica. As mantas de
forma cnica so utilizadas para aquecimento de bales ou dissoluo de meios de
cultura.

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33

Figura 29 Pipetadores automticos, alas de Drigalski, manta aquecedora.

1.5.1.5 Escorredor de vidrarias, alas e agulhas de platina, pina metlica,


escovas.
O escorredor de vidrarias auxilia na secagem das mesmas. As alas e as
agulhas de platina ficaro dispostas no suporte que por sua vez deve ser de fcil
acesso, todas elas devem ficar com o cabo de Kole para baixo. A pina metlica
empregada para auxiliar no manuseio de beckeres. As escovas so indispensveis
na lavagem de vidrarias, como tubos, beckeres, Erlenmeyer e bales, elas so
comercializadas em diferentes tamanhos.

Figura 30 Escorredor de vidrarias, agulhas de platina e alas de platina.

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34

Figura 31 Pina metlica, escovas.

1.5.1.6 Pina de Mohor, pina Hofmann, jarra de Gaspar, pinas.


A pina de Mohor empregada prender a mangueira, auxiliando na
distribuio de meio de cultura lquido. A pina Hofman possui a finalidade de
impedir ou reduzir a operao de fluxo de lquidos ou gases atravs de tubos
flexveis. A jarra de anaerobiose ou jarra de Gaspar o instrumento mais
importante para o isolamento de microrganismos anaerbios. As pinas so
usadas para pegar material slido, com diversificados tipos e aplicaes.

Figura 32 Pina de Mohor, pinas Hofmann, Jarra de Gaspar

Figura 33 Pina e cronmetro

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35

EXERCCIOS
Exerccio n0 _______

Assunto: ____________________

1. Explane sobre a importncia de um laboratrio bem organizado com relao


diviso de suas reas, e como isso contribui no andamento das atividades
desenvolvidas.

2. Crie uma situao de atividade no laboratrio em que voc precisar utilizar


pelo menos um equipamento, uma vidraria e um acessrio conjuntamente para a
realizao desta atividade.

3. Selecionar os equipamentos que considerar importante e descrever suas


funes e aplicaes.

4. Qual a aplicao para a jarra de Gaspar?

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36

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36

A IMPORTNCIA DA APLICAO DAS NORMAS DE


SEGURANA
Captulo 2
2.1. SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA____________
Nos Laboratrios de Microbiologia onde amostras biolgicas e culturas
com agentes infectantes so manipulados, de grande importncia que sejam
priorizados os cuidados de segurana j que tais amostras significam riscos ao
pessoal desse setor.
Nas aulas prticas sero estudados vrios microrganismos, inclusive alguns
patognicos ao homem. Dessa forma, essencial observar normas de segurana
no laboratrio para evitar contaminao de estudantes, de tcnicas e de
professores.
2.2 RECOMENDAES SOBRE AS NORMAS DE SEGURANA__________

O uso do avental branco, comprido e abotoado, deve obrigatoriamente ser


utilizado no laboratrio de Microbiologia, pois o mesmo protege a roupa de
contaminao;

Figura 34 Jaleco branco para uso em laboratrio

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37

deve-se usar luvas cirrgicas estreis antideslizantes e individuais, sapato


fechado, culos de proteo, mscara e touca descartveis;

Figura 35 Luvas cirrgicas, culos de proteo, mscara e touca descartveis.

bolsas, pacotes, livros, etc. devem ser guardados em local apropriado,


como mostra a Figura .

Figura 36 Guarda-volumes

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no fumar, comer ou beber gua das torneiras;

manter as mos, canetas e quaisquer outros

38

objetos longe da boca ou face;

em caso de qualquer acidente (derramamentos de culturas, ferimentos


etc.) comunicar imediatamente ao professor ou ao pessoal tcnico do
laboratrio;

o avental deve ser mantido limpo;

todo material contaminado dever ser colocado em recipientes adequados


para serem esterilizados posteriormente, nunca deix-los sobre a mesa de
trabalho ou pia;

os tubos de cultura devero ser colocados nas estantes ou suportes


adequados, nunca nos bolsos do avental ou deitados sobre as bancadas;

Figura 37 Tubos de ensaio na estante de suporte.

cuidado ao acender o bico de gs (Bico de Bunsen). Observar se no existe


produtos inflamveis (lcool, ter, acetona etc.) nas proximidades da
chama;

a ala de platina deve ser flambada at o rubro, tanto antes do uso como
depois dele. Antes de tocar o material de cultura, deve-se deixar a ala
esfriar, mantendo-a prxima da chama;

os tubos de ensaio e placas de Petri com meios de cultura s podero ser


abertos nas proximidades da chama. No tocar no meio de cultura com

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39

dedos ou quaisquer objetos e manter as placas e tubos abertos o mnimo


tempo possvel;

os tubos de ensaio contendo culturas bacterianas devero ser flambados


aps sua abertura e antes de recolocar a tampa (tampo de algodo). Nunca
coloque o tampo de algodo sobre a bancada;

identificar o material que ser utilizado;

o aluno responsvel por todo o material com que trabalha. Qualquer


acidente, dano ou defeito em equipamentos deve ser imediatamente
comunicado ao professor;

lavar sempre as mos, usando sempre sabo lquido e assepsia com lcool a
70 %, antes e aps o trabalho com material biolgico e, ou sempre que
houver suspeita de contaminao;

Figura 38 Lavar as mos

o aluno deve deixar o laboratrio apenas ao trmino do trabalho, sem


dvidas nas tcnicas realizadas e ao final da aula deve limpar a bancada,
desligar e cobrir os microscpios, fechar o bico de Bunsen e a vlvula de
segurana, descartar as luvas e lavar as mos antes de deixar o laboratrio.

manter extintores devidamente posicionados e com dentro do prazo


validade ao alcance do pessoal, que por sua vez deve ser instrudo para o uso
em caso de acidentes.

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Figura 39 Extintores de incndio

40

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41

EXERCCIOS
Exerccio n0 ____

Assunto: __________________

1. Identifique cinco possveis riscos em um laboratrio e sugestione medidas para


combat-los.

2. Qual a importncia da flambagem na preveno de riscos biolgicos?

3. Justifique a instalao de extintores em laboratrio e especificar os tipos


adequados para laboratrio.

4. Discernir sobre a segurana do trabalho em laboratrio

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41

PREPARO E ESTERILIZAO DE MATERIAIS PARA O USO


NAS ANLISES MICROBIOLGICAS
Captulo 3
3.1 PREPARO DE MATERIAIS____________________________________

A preparao do material de laboratrio para utilizao em anlises


microbiolgicas envolve todas as atividades necessrias para garantir que os
frascos, utenslios, instrumentos e vidrarias, destinados ao contato com as
amostras de alimentos, encontrem-se totalmente limpos, estreis e isentos de
resduos qumicos e orgnicos, no momento das anlises. Esse trabalho envolve as
atividades de descontaminao, descarte de resduos contaminados, lavagem,
acondicionamento e esterilizao.

3.1.1. ACONDICIONAMENTO DO MATERIAL PARA ESTERILIZAO POR


CALOR SECO OU MIDO
O procedimento de esterilizao de materiais pode ser feito em autoclave
por meio do calor mido ou em estufa por calor seco; mas antes disso preciso
preparar o material acondicionando-os devidamente para que depois de
esterilizados no sofram contaminaes subseqentes.
3.1.1.1 Mtodos
a) Placas de Petri - Acondicion-las em estojos porta-placas de alumnio ou
ao inoxidvel, ou embrulhadas em papel kraft, em grupos de at quatro placas.

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42

Figura 40 Mtodo de preparo de placas de Petri


(Ilustrao elaborada pela Monitoria)

b) Pipetas - Preencher o bocal com algodo e acondicionar em estojos portapipetas com as pontas para baixo. importante que o fundo dos estojos seja
protegido com um chumao de gaze ou algodo para evitar danos s pontas das
pipetas. As pipetas devem podem ainda ser embrulhadas uma a uma manualmente
como representado na figura 41 abaixo.

Figura 41 Mtodo de preparo de pipetas


(Ilustrao elaborada pela monitoria)

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c)

43

Tubos de ensaio - Tampar com tampo de algodo ou com as respectivas

tampas rosqueveis deixando-as frouxas, acondicion-las em grupos e cobrir a


parte superior dos tubos com papel Kraft e amarrar com barbante.
d)

Frascos de homogeneizao tampados com algodo - cobrir a tampa ou o

tampo com papel Kraft e amarrar com barbante individualmente, cuja seqncia
est representada na Figura 3.

Figura 42 Preparo de frascos de homogeneizao


(Ilustrao elaborada pela Monitoria)

e)

Bales ou Erlenmeyeres - Estender a gaze na boca do Erlenmeyer,

preencher com algodo e amarrar, formando o tampo, em seguida cobrir com


papel Kraft envolvendo o tampo e amarr-lo firme.

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44

Figura 43 Mtodo de preparo de bales ou Erlenmeyeres


(Ilustrao elaborada pela monitoria)

f) Becker Tampar o becker com papel alumnio e em seguida sobrepor o papel


kraft amarramdo-o.

Figura 44 Mtodo de preparo de Becker


(Ilustrao elaborada pela monitoria)

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45

g) Esptulas, pinas, tesouras e demais utenslios Embrulhar individualmente em


papel de kraft, identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no
momento da anlise.
3.2 ESTERILIZAO________________________________________
Nos laboratrios de microbiologia prefervel a utilizao de estufas
(calor seco) para a esterilizao de vidrarias porque ao final do processo as
vidrarias esto secas e prontas para serem utilizadas.
Os meios de cultura so exemplos de material destinado a anlises
microbiolgicas que devem ser submetidos esterilizao por calor mido, tendo
em vista a eficaz ao a gua aquecida que gera grande presso capaz de
destruir clulas vegetativas.
3.2.1 Esterilizao por calor seco
a) Acondicionar os materiais devidamente.
b) Organizar os materiais dentro da estufa com o cuidado de no deixa-las
muito cheias para que a circulao do calor no seja comprometida.
c) Submeter os materiais esterilizao em estufa a uma temperatura de
180C por 2 horas.
d) Guardar os materiais em seus respectivos locais.

Figura 45 Estufa 180 C fechada e aberta

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3.2.2

46

Esterilizao por calor mido

a) Averiguar o nvel da gua da autoclave retirando o cesto, que deve estar a


1 cm da cruzeta.
b) Completar com gua se necessrio e repor o cesto.
c) Colocar todo o material a ser esterilizado.
d) Fechar a tampa da autoclave e fechar os manpulos em crus.
e) Ligar a autoclave na potencia mxima e esperar ate que se atinja 121C.
f) Ao atingir 121C, colocar a chave para potencia mdia.
g) Marcar 15 minutos para que a autoclave seja desligada.
h) Esperar que o ponteiro do monmetro atinja a posio zero.

i) Abrir o registro aos poucos e esperar a sada do vapor por completo.


j) Abrir os manpulos em cruz e retirar os materiais estreis.

Figura 46 Autoclave vertical


(Cortesia do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrio/CCS/UFPB)

3.3 DESCONTAMINAO E DESCARTE DE RESDUOS________________


Aps as anlises microbiolgicas os meios de cultura e toda a vidraria
envolvida encontram-se altamente contaminados devido ao favorecimento dos
mtodos analticos proliferao bacteriana. Para descontaminar o material
deve-se:

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47

a) Preparar todo o material, embalando as placas de Petri com papel de embrulho


e acomodando os tubos e vidrarias menores em recipientes adequados e cobertos
com o papel de embrulho;
b) Identificar o material colocando o nome do responsvel e a data;
c) Submeter o material esterilizao em autoclave, a 121C por 30 minutos.
Aps a descontaminao deve-se aguardar a sada de todo o vapor, abrir a
tampa da autoclave e esperar que o material esfrie, em seguida, descartar os
resduos slidos no lixo com o auxlio de esptulas e os lquidos na pia, proceder
com a lavagem.

3.4 LAVAGEM
O processo de lavagem deve ser feito mediante a escolha correta do tipo
de detergente, bem como o mtodo de enxge mais apropriado para a remoo
dos resduos. Os detergentes aninicos so os mais utilizados, mas se for
necessrio aplicao de um agente mais forte utilizado, por exemplo, a
soluo sulfocrmica constituda de cido sulfrico e dicromato de potssio.
A lavagem deve ser eficaz retirando ao mximo compostos orgnicos
aderidos s vidrarias e tambm etiquetas com anotaes de identifica
3.4.1 Mtodos

a)

Descartar o material descontaminado retirando o excesso de matria

orgnica. O material no dever ser misturado com o resduo seco, mas deve ser
coletado e acondicionado separadamente;
b)

Mergulhar o material em soluo detergente neutro e deixar imerso por 2

horas, dependendo do grau de aderncia do material.


c)

Com o auxlio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais

utenslios, remover tambm as anotaes de lpis e canetas.

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d)

Enxaguar todo o material em gua corrente, por dez vezes sucessivas.

e)

Enxaguar com gua destilada, pelo menos uma vez.

f)

Dispor o material sobre bancada limpa para secagem ambiente.

48

Ressalta-se ainda, que as escovas e esponjas devem ser conservadas em


recipiente apropriado. No recomendado o uso desses materiais por longos
perodos, em vista das possibilidades de aderncia de material resduo com
formao de biofilme.
Manter o controle microbiolgico e fsico-qumico da gua de torneira e
destilada atualizadas, com periodicidade de um ms.
Na ausncia de cuba de inox, empregar no processo de higienizao
recipiente metlico ou em plstico, tendo o cuidado de higieniz-los diariamente
antes e aps as atividades.

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49

EXERCCIOS

Exerccio n0 ____

Assunto: __________________

1. Qual a importncia do preparo e esterilizao de vidraria para a qualidade das


anlise?

2. Explicar as diferenas de temperatura nos tratamento por calor seco e mido.

3. Qual a diferena existente entre os processos de esterilizao pelo calor


mido e pelo calor seco?

4. Investigar outros mtodos de esterilizao pelo calor seco e relacion-los.

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50

COLETA DE AMOSTRAS
Captulo 4
4.1 OBTENO DAS AMOSTRAS E CONDIES DA COLETA__________
A obteno correta das amostras, seu transporte para o laboratrio e sua
preparao para anlise so etapas fundamentais para o sucesso de uma anlise
microbiolgica. Da execuo correta dessas trs etapas depende a exatido dos
resultados obtidos. A amostra deve ser a representao do produto como um
todo, logo, de suma importncia que todas as precaues sejam tomadas.
A ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria adota para a avaliao
de lotes os planos de duas e trs classes estabelecido pela International
Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, 2002).
Seja qual for a finalidade das anlises microbiolgicas dos alimentos,
muito importante respeitar rigorosamente as seguintes condies para coleta de
amostras:

Evitar a contaminao
durante a coleta

Deve-se higienizar bem as mos lavando-as com


gua e sabo e fazer anti-septicemia com lcool a
70% ou similar; faz-se necessrio tambm o uso
de luvas e mscara descartveis e da utilizao de
frascos de vidro esterilizados e/ou sacos
esterilizados.
Os utenslios utilizados pelos para coleta (garfos,
facas, pinas, etc) devem ser lavados com gua e
sabo e esterilizados.
O local utilizado para realizar a coleta das
amostras de alimentos deve ficar fora de
circulao das pessoas e sem corrente de ar,
sendo que a coleta dever ser feita com rapidez e
assepsia.
No falar, tossir ou espirrar durante a coleta.
Abrir a embalagem de maneira a garantir que
eventuais contaminaes presentes na superfcie

externa no contaminem o produto.

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As amostras coletadas devem ser refrigeradas a


uma temperatura entre 0C e 4C, em 1 hora. As
amostras podem ser armazenadas abaixo de 4C
ou congeladas entre 10C e -15C por, no mximo,
72 horas, sendo o ideal at 48 horas.

As amostras devem ser transportadas para o


laboratrio em embalagens isotrmicas (isopor)
com gelo para manter o ambiente de refrigerao
(abaixo de 10).
As amostras devem ser identificadas no rtulo de
embalagem, com todas as informaes que
facilitem a interpretao dos resultados, como a
temperatura do alimento no ato da coleta, hora da
coleta, etc. e observar se os frascos e sacos de
plsticos esto bem fechados para evitar a
contaminao no transporte ou pela gua
proveniente do gelo.
A quantidade de alimentos em cada amostra deve
ser no mnimo de 100 g de produto vivel para
anlise microbiolgica e 200 g quando se destina a
anlise bromatolgica completa. Para diagnstico
de surto, como para anlise fiscal, uma amostra
apenas no suficiente, havendo necessidade de
coleta de amostras em nmero compatvel com o
lote ou quantidade de alimentos embalados.
Devem ser coletadas amostras na superfcie e no
centro geomtrico de alguns lotes de alimentos
industrializados que sejam compatveis com a
produo do produto em teste.

Evitar a multiplicao dos


microrganismos durante o
armazenamento

Evitar a multiplicao
dos microrganismos
durante o transporte

51

Coletar um nmero
representativo de
amostras

4.2 TIPOS DE AMOSTRAS______________________________________


Amostras Lquidas
gua potvel da torneira
As coletas de gua so geralmente realizadas em frascos com volume de
100 ml, que por sua vez devem ser limpos esterilizados e tampados. Previamente

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52

deve ser averiguado se a gua foi adicionada de cloro, pois nesse caso, o frasco
alm de esterilizado, deve conter em seu interior 1 ml de tiossulfato de sdio
para promover a eliminao da influncia do cloro.

Figura 47 Coleta de gua

Metodologia
necessrio frasco estril (ou sacos estreis), lamparina, lcool a 70 % ou
lcool-gel, algodo, pina metlica, caixa isotrmica e gelo.

Passar um chumao de algodo umedecido com lcool a 70% ou lcool-gel em

torno da abertura da torneira;

Esperar alguns minutos para o lcool evaporar;

Flambar o tubo ou frasco, empregando a lamparina;

Abrir a torneira e deixar a gua fluir por 2-3 minutos;

Coletar aproximadamente 200ml;

Flambar novamente o frasco e repor a tampa ou tampo;

Colocar a caixa isotrmica com gelo e transportar para o laboratrio;

Se a anlise no for realizada no mesmo dia, a amostra deve ser mantida sob

refrigerao;

Quando sob refrigerao, a amostra deve ficar em repouso at atingir a

temperatura ambiente.

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53

CUIDADOS ESSENCIAIS
Em caso de torneira ou bomba, deixar correr as primeiras guas;
Flambar a torneira com chama de lcool;
No tocar com os dedos na parte da rolha que fica no interior do vidro;
O exame bacteriolgico deve ser feito o mais rpido possvel. As amostras
devem ser conservadas temperatura de 6 a 10 (refrigerador) para evitar o
crescimento da quantidade de micrbios.
O tempo mximo permitido entre a coleta da amostra e o exame no laboratrio
de 06 (seis) horas, isto para gua pouco poluda.

Sucos e bebidas envasados

Quando o produto industrializado e encontra-se exposto em prateleira,


proceder amostragem de duplicata, de um mesmo lote. Identificar cada
amostra com a hora da coleta, data, procedncia, nmero do lote e nome do
responsvel pela coleta. Transportar as amostras ao laboratrio, uma amostra
ser analisada e a outra servir de contraprova.
Sucos preparados e prontos para beber, caldo de cana similares.
Coletar a amostra utilizando frasco estril, encher o frasco at 2/3 do
volume total. Flambar o frasco e fechar. Acondicionar em caixa isotrmica com
gelo e transportar ao laboratrio. Identificar as amostras com o dia, hora da
coleta, local onde foi coletada, e nome de quem realizou a coleta.

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54

Amostras Slidas

Pores de alimentos prontos para consumo


Coletar as amostras em separado de cada componente, no setor de
distribuio. Acondicionar o alimento em saco plstico estril e transportar para
o laboratrio sob refrigerao em caixa isotrmica com gelo. Identificar a
amostra com o nome do estabelecimento, hora da coleta, data e nome do
responsvel.

Salgados e Similares
Os produtos como coxinhas, pastis e similares devem ser expostos
comercializao em estufa e sob temperatura controlada. Deve-se recolher o
salgado em aleatoriamente com luvas e acondicion-lo em saco plstico,
transportando-o para o laboratrio sob refrigerao em caixa isotrmica com
gelo.

Peas de carne

Neste caso, retiram-se pequenas pores de vrios pontos da pea de


carne, de modo a perfazer 200g do produto. Acondicion-la em saco plstico e
transportar sob refrigerao em caixa isotrmica com gelo.

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55

Superfcies de contato

Bancadas, superfcies de equipamentos


Metodologia
Empregar a tcnica de superfcie, utilizando-se dos seguintes materiais:
molde, swab e diluente gua peptonada.

Preparar tubos de ensaio contendo 10ml de diluente gua peptonada;

Tamponar;

Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos;

Esterilizar o molde em estufa a 180 C por 1 a 2 horas;

Fixar o molde sobre a superfcie;

Umedecer o swab no tubo com diluente a transportar ao laboratrio o mais


rpido possvel;

Colocar o swab no tubo com diluente e transportar ao laboratrio o mais


rpido possvel, sob refrigerao;

Utenslios (garfos, faca, colher, etc)


Metodologia
Em um saco plstico estril, adicionar 100ml de diluente gua peptonada;
Colocar o utenslio dentro do saco;

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56

Fechar o saco e acondicionar em caixa isotrmica com gelo;


Transportar ao laboratrio;
Friccionar o material e preparar as diluies decimais.

EXERCCIOS

Exerccio n0 ____

Assunto: __________________

1. Relate sobre a coleta de amostras, sobre a sua importncia para os resultados


da anlise.

2. Na coleta de gua, representada na figura ___ identifique possveis erros


durante a tcnica que pode levar a contaminao da mesma.

3. O que h em comum nas tcnicas de coleta de bancadas, superfcies de


equipamentos e utenslios?

4. Suponha que voc far anlises microbiolgicas a fim de avaliar as condies


higinicas de um determinado alimento. Escolha um alimento e descreva os passos
para colet-lo com segurana identificando os riscos de contaminao e os
cuidados para combat-los.

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57

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57

MEIOS DE CULTURA
Captulo 5
5.1 DESCRIO DE MEIOS DE CULTURA____________________________
Os meios de cultura so preparaes slidas, lquidas ou semi-slidas que
contm todos os nutrientes necessrios para o crescimento de microrganismos,
so utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viveis no
laboratrio, sob a forma de culturas puras.
Os meios de cultura devem ter na sua composio, os nutrientes
indispensveis ao crescimento do organismo em questo, sob forma assimilvel e
em concentrao no inibitria do crescimento. Alm disso, aps a sua
preparao, cada meio de cultura deve ser submetido a esterilizao, por forma a
eliminar qualquer organismo vivo contaminante.
Por outro lado, para manter uma cultura pura, necessrio que o meio de
cultura que se pretende utilizar seja mantido desprovido de qualquer organismo
vivo contaminante. Para a preveno de contaminaes durante a manipulao de
culturas puras recorre-se a tcnicas de assepsia.
De um ponto de vista geral, os meios de cultura podem ser classificados
tendo em conta o seu estado fsico, a sua composio qumica e os objetivos
funcionais a que se destinam.
A especificidade dos meios de cultura muito importante, nomeadamente
no isolamento e identificao de certos microrganismos (por exemplo, no
isolamento de microrganismos do solo) ou em testes de sensibilidade a
antibiticos ou na anlise microbiolgica de guas, de alimentos, etc.

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58

5.2 CLASSIFICAO FUNCIONAL DOS MEIOS DE CULTURA_____________


Os meios de cultura podem ser usados na seleo e crescimento de um
determinado microrganismo ou na identificao de uma espcie em particular.
Desta forma, a funo de um dado meio depende da sua composio. O isolamento
de uma determinada estirpe microbiana pode ser feito por meio do recurso e/ou
combinao dos seguintes tipos de meios:
Meios

seletivos:

suprimem

crescimento

de

determinados

microrganismos em benefcio de outros.


Exemplo: meio seletivo para pesquisa de coliformes, utilizado na anlise
microbiolgica de guas: os meios complexos que permitem o isolamento de
coliformes (enterobactrias Gram negativas) so suplementados com sais biliares
ou com o sal lauril-sulfato de sdio, que atuam como agentes inibidores do
crescimento de bactrias Gram positivas.
Meios diferenciais: permitem a distino entre diferentes grupos de
microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes especficas
do meio de cultura ou na morfologia (aparncia) das colnias. Permitem, por
vezes, a identificao de microrganismos com base nas suas caractersticas
biolgicas.
Exemplo: meio Agar de sangue, que permite a distino entre bactrias
hemolticas e no hemolticas. O padro de hemlise (dos glbulos vermelhos de
sangue) no meio agar de sangue permite distinguir bactrias, tais como

Streptococcus pyogenes (causadora de faringite) que causa a lise completa dos


glbulos ermelhos do sangue produzindo halos transparentes volta das colnias,

Streptococcus mutans (causa crie dentria), que no hemoltica, e


Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia bacteriana) que lisa
parcialmente os glbulos vermelhos do sangue.

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5.3 CARACTERSTICAS DE ALGUNS INGREDIENTES COMPLEXOS________


a) Extrato de carne
Caractersticas: Extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob a
forma de pasta ou p. Valor nutritivo: Contm substncias solveis dos
tecidos animais, incluindo carboidratos, compostos orgnicos de nitrognio,
vitaminas hidrossolveis e sais.
b) Peptona
Caractersticas: Produto que resulta da digesto de materiais proticos
como carne, casena e gelatina: a digesto protica feita por meio de cidos
ou enzimas. Valor nutritivo: Principal fonte de nitrognio orgnico: pode
conter vitaminas e, s vezes carboidratos.
c) gar
Caractersticas: Carboidrato complexo, obtido de certas algas marinhas e
tratado para a remoo de substncias estranhas. Usado como agente
solidificante dos meios, ele gelifica quando a temperatura reduzida a menos
de 45 oC. Valor nutritivo: No fonte nutritiva.
d) Extrato de leveduras
Caractersticas: Extrato aquoso de leveduras. Valor nutritivo: Rico em
vitamina B.
e) Extrato de malte
Caractersticas: Extrato aquoso de cevada mateada. Valor nutritivo: Rica
em carboidratos, contm material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.

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60

5.4. METODOLOGIA_________________________________________
Em geral, para os meios de cultura comercializados na forma de p, devese:
o Ler o rtulo do meio de cultura que ser utilizado.

Figura 48 Leitura do rtulo do meio de cultura

o Calcular a proporo de p para quantidade de gua destilada


conveniente.
o Pesar o meio desidratado em balo ou Erlenmeyer mantendo-o sempre
tampado.

Figura 49 Pesagem do meio de cultura

o Acrescentar a gua destilada em quantidade adequada.


o Tamponar e esterilizar conforme a indicao do rtulo.

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61

Obs: Os meios de cultura que contm agar devem ser dissolvidos em banhomaria ou bico de Bunsen antes de ser esterilizados. J os caldos antes de ser
esterilizados devem ser distribudos nos tubos, assim como os diluentes em seus
frascos. Alguns meios de cultura precisam ainda ser adicionados de algumas
substncias, nestes casos, proceder conforme indicao no rtulo.
5.5 EXEMPLOS DE FRMULAS DE UM MEIO DE CULTURA_______________
a) gar Padro para Contagem (PCA = Plate Count Agar)
Tiptona .........................................5g
Extrato de leveduras ................2,5g
Glicose ...........................................1,0g
gar .............................................15,0g
gua destilada .............................1000 mL

Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do


material. Ajustar o pH em 7,0. Distribuir em frascos apropriados e
autoclavar por 15 min a 121oC.
b) Caldo Simples ou caldo nutriente
Extrato de carne ....................3,0g
Peptona ......................................5,0g
gua destilada .........................1,0 L

Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo


do material. Ajustar o pH em 7,0. Distribuir em frascos apropriados e
autoclavar por 15 min a 121oC.

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EXERCCIOS

Exerccio n0 ____

Assunto: __________________

1. Qual a importncia da escolha do meio de cultura a ser utilizado conforme o


tipo de anlise microbiolgica desenvolvida?

2. Pesquise trs meios de cultura diferentes descrevendo sobre os principais


componentes de sua frmula e a finalidade do uso.

3. Relate as etapas do preparo de um meio de cultura que contm agar.

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63

CONTAGEM PADRO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS


Captulo 6
6.1 CONTAGEM PADRO EM PLACAS_______________________________
PLACAS
A contagem padro em placas utilizada tanto para a quantificao de
grandes

grupos

microbianos,

como

os

aerbios

mesfilos,

os

aerbios

pscicrotrficos, os bolores e leveduras, entre outros. O procedimento bsico a


inoculao da amostra homogeneizada (de suas diluies) em um meio slido (com
agar), contido em placas de Petri, seguida da incubao das placas at o
crescimento visvel.
A contagem Total de Aerbios Mesfilos em placas, tambm denominada
Contagem Padro em Placas, o mtodo mais utilizado como indicador geral de
populaes bacterianas em alimentos. No diferencia tipos de bactrias, sendo
utilizada para se obter informaes gerais sobre a qualidade de produtos,
prticas

de

manufaturas,

matrias-primas

utilizadas,

condies

de

processamento, manipulao e vida de prateleira.


No um indicador de segurana, pois no est diretamente relacionado
presena de patgenos ou toxinas. Dependendo da situao, pode ser til na
avaliao da qualidade, porque populaes altas de bactrias podem indicar
deficincias na sanitizao ou falha no controle do processo ou dos ingredientes.
Os produtos fermentados, ao contrrio, apresentam populaes naturalmente
altas de mesfilos, sem qualquer relao com a qualidade.
A contagem pode ser feita utilizando-se os mtodos de plaqueamento em
profundidade (pour plate), superfcie (spread plate) e filtrao em membrana.

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6.2 MATERIAL NECESSRIO____________________________________


{ Vidraria
{ Equipamentos:
1 Erlenmeyer;

balana semi-analtica;

3 frascos de diluio;

estufa bacteriolgica;

3 placas de petri.

autoclave;

Acessrios

pipetador automtico;

contador de colnias.
o Meio de cultura:

ponteiras descartveis;

Agar Nutrient, Plate Count

ala de Drigalski;

Agar ou Agar Muller Hinton.

tesoura e pina;
etiquetas;
bico de Bunsen.
6.3 METODOLOGIA_____________________________________________
A quantificao de bactrias aerbias mesfilas em alimentos feita pelo
mtodo de contagem padro em placas, determinando-se o nmero de unidades
formadoras de colnias (UFC).
Para procedimento da anlise deve-se higienizar a bancada e dispor o
material, codificar as placas e os frascos de diluio e realizar diluies, para
ento transferir com o pipetador automtico 1ml de cada um dos fracos de
diluio para as respectivas placas de Petri codificadas.

Em seguida deve-se

verter em cada placa 15-20 mL do meio de cultura, homogeneizar com


movimentos em forma de oito ou circular e deixar as placas sobre a bancada at
completa solidificao do meio. Aps realizao da anlise, deve-se incubar a 3537C por 48 horas. Aps esse perodo, realizar a contagem com auxlio do
contador de colnias. A metodologia descrita abaixo utilizada para amostra
slida, mas se for lquida o que diferenciar que a primeira diluio ser a 100

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65

que ser a prpria amostra, as demais diluies proceder como no esquema


abaixo:
Contagem em Placas de bactrias aerbias mesfilas
1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+
25 g
25 gr

225 mL gua
de peptona
10-2

1mL

1 mL

10-3

10-4

1 mL

10-5

1 mL

1 mL

Duplicata

Meio de cultura: Agar Nutrient, Plate Count Agar ou


Agar Muller Hinton
Incubao: a 35-37 C por 48 horas

Aps o perodo de incubao

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66

Aps incubao
Contagem de placas com 30-300 UFC
Figura 50 Esquema da metodologia para contagem de bactrias aerbias mesfilas
(Imagens cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/DN/UFPB)

6.4 LEITURA _________________________________________________


Selecionar as placas com 30 a 300 colnias e contar as colnias com o
auxlio de uma lupa, em um contador de colnias. Calcular o nmero de unidades
formadoras de colnias (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o
nmero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Caso tenham sido utilizadas
duas placas por diluio (duplicata) considerar como nmero de colnias a mdia
aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.
6.5 RESULTADO ______________________________________________
Usar notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula, na
apresentao dos resultados. Para calcular o nmero de UFC/g ou ml de
bactrias, multiplicar o nmero de colnias por dez e pelo inverso da diluio.
Para a interpretao dos resultados deve-se pesquisar nas normas existentes
para o alimento avaliado quanto aos valores de referncia.

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EXERCCIOS

1 O que a contagem de bactrias aerbias mesfilas avalia?

2 Quais mtodos utilizados para anlise desse microrganismo?

3 Qual o perodo e temperatura de incubao para crescimento desse


microrganismo?

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68

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS


Captulo 7
7.1 BOLORES E LEVEDURAS ____________________________________
Os bolores e leveduras constituem um grande grupo de microrganismos, a
maioria originria do solo ou do ar. Os bolores so extremamente versteis, a
maioria das espcies capaz de assimilar qualquer fonte de nitrognio, podendo
utilizar nitrato, os ons de amnia e o nitrognio orgnico. Entretanto, se for
necessrio utilizar protenas ou aminocidos como fonte de nitrognio ou de
carbono, vrias espcies vo apresentar um crescimento limitado. As leveduras,
de maneira geral, so mais exigentes do que os bolores. Muitas so incapazes de
assimilar nitrato e carboidratos complexos, algumas exigem vitaminas e outras,
como Zygosaccharomyces bailli, por exemplo, no conseguem utilizar a sacarose
como nica fonte de carbono. Esses fatores, de certa forma, limitam a gama de
alimentos susceptveis deteriorao por leveduras.
Os bolores e leveduras so tambm bastante resistentes s condies
adversas, como pH cido e atividade de gua baixa. A maioria das leveduras
apresenta atividade de gua mnima de crescimento na faixa de 0,88 e a maioria
dos bolores na faixa de 0,80. Os bolores e leveduras capazes de crescer em
atividades de gua abaixo do limite de 0,85 so chamados de xeroflicos, e
aqueles que crescem em altas concentraes de sal so chamados haloflicos. Com
relao ao pH, os fungos so muito pouco afetados pela variao na faixa de 3,0 a
8,0. Vrios bolores crescem abaixo de 2,0 e diversas leveduras abaixo de 1,5.
Entretanto, quando o pH afasta-se do timo (geralmente prximo de 5,0) a
velocidade de crescimento diminui e, se houver outros fatores de inibio
(atividade de gua, temperatura, etc.), seu efeito restritivo sobre a velocidade
de crescimento torna-se mais acentuado.

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69

A temperatura tima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na


faixa de 25 a 28 C, no crescendo bem nas temperaturas mesfilas (35-37 C) e
raramente nas temperaturas de bactrias termotolerantes (45 C). Seu
crescimento no incomum sob condies de refrigerao (5 C), porm, abaixo
de 10 C negativos os alimentos podem ser considerados microbiologicamente
estveis.
Os bolores deteriorantes de alimentos, com quase todos os outros fungos
filamentosos, exigem oxignio para crescimento, podendo ser considerados
aerbios estritos. No entanto, vrias espcies, so eficientes em utilizar
pequenas quantidades de oxignio, de forma que o efeito do O2 dependente da
quantidade absoluta dissolvida no substrato, e no da concentrao presente na
atmosfera. Ao contrrio dos bolores, muitas espcies de leveduras so capazes
de crescer na completa ausncia de O2 e em diferentes concentraes de CO2.
Isso as torna os deteriorantes mais comuns de alimentos lquidos engarrafados,
nos quais o crescimento dos bolores limitado pela disponibilidade de oxignio.
A consistncia do alimento, assim como a atmosfera de armazenamento,
exerce uma considervel influncia sobre os tipos de fungos que iro provocar a
deteriorao do produto. Em linhas gerais, as leveduras predominam em
alimentos lquidos, porque so unicelulares e se dispersam mais facilmente em
lquidos. Alm disso, substratos lquidos oferecem maior oportunidade para
desenvolvimento

de

condies

anaerbias,

ideais

para

as

leveduras

fermentativas. Os bolores, ao contrrio, so favorecidos por substratos slidos


firmes, em cuja superfcie h fcil acesso ao oxignio. Por outro lado, essa
afirmao no dever ser entendida como absoluta, sugerindo que leveduras no
possam deteriorar alimentos slidos ou bolores alimentos lquidos. Simplesmente,
as leveduras so mais competitivas em lquidos, provocando alteraes
percebidas mais fcil ou rapidamente.

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70

7.2 MATERIAL NECESSRIO___________________________________


{ Vidraria
{ Equipamentos:
1 erlenmeyer;
balana semi-analtica;
3 frascos de diluio;
estufa bacteriolgica a 25C;
3 placas de petri.
autoclave;
{

Acessrios

contador de colnias.

pipetador automtico;
ponteiras descartveis;
ala de Drigalski;
tesoura e pina;

Meio de cultura:

Potato Dextrose Agar ou Sabouraud;


Diluente: gua peptonada 0,1 %

etiquetas;
bico de Bunsen.
7.3 METODOLOGIA____________________________________________
A quantificao de bolores e leveduras em alimentos feita pelo mtodo
de contagem padro em placas, determinando-se o nmero de unidades
formadoras de colnias (UFC). A tcnica mais recomendada o plaqueamento em
superfcie (spread plate), pois aumenta a exposio ao oxignio, evita o stress
causado pelo meio de cultura quente, permite uma visualizao morfolgica e
diferencial, alm de facilitar a transferncia de colnias.
Para procedimento da anlise deve-se higienizar a bancada e dispor o
material, codificar as placas e os frascos de diluio e realizar diluies. Em
seguida, deve-se verter em cada placa 15-20 mL do meio de cultura e aguardar
para a solidificao deste, para ento transferir com o pipetador automtico 0,1
mL de cada um dos fracos de diluio para as respectivas placas de Petri
codificadas. Aps realizao da anlise, deve-se incubar a 25C por 3 a 5 dias no

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71

escuro e sem inverter. Aps esse perodo, realizar a contagem com auxilio do
contador de colnia.
Contagem em Placas de bolores e leveduras
Amostra slida
1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

25g
10-2

225 mL gua
de peptona

1mL

10-3

1 mL

10-4

1 mL

10-5

1 mL

Duplicata

Meio de cultura: Potato Dextrose Agar


ou Sabouraud
Incubao: 25 C por 3 a 5 dias

Aps o perodo de incubao

1 mL

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Figura 51 Esquema da metodologia para contagem de bolores e leveduras


(Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

7.4 LEITURA ________________________________________________


O meio de cultura utilizado para promover o crescimento desse tipo de
microrganismo pode conter o cloranfenicol que inibe bactrias, a dicloran e rosa
de bengala para restringir o espalhamento da colnia e o glicerol que reduz a
atividade de gua do meio.
Para a contagem de colnias e clculo dos resultados, selecionar as placas
com 25 a 250 UFC/g ou mL com o auxlio de uma lupa, em um contador de
colnias.
Na placa selecionada, contar separadamente as colnias com aspecto
filamentoso, cotonoso ou pulverulento, caractersticas de bolores, anotando o
resultado.
Na mesma placa, contar as demais colnias, que podem ser de leveduras ou
de bactrias, eventualmente capazes de crescer. Selecionar pelo menos cinco
dessas colnias e verificar a morfologia das clulas ao microscpio, observando
se a cultura de leveduras, bactrias ou mistura de ambas. Para isso, pode ser
feita uma montagem mida ou uma colorao de Gram, conforme procedimento
descrito no Captulo 5. Considerar como confirmadas todas as colnias que

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73

apresentarem levedura ou mistura de leveduras e bactrias. Determinar o


numero de colnias de leveduras na placa em funo da porcentagem confirmada.
7.5 RESULTADO ______________________________________________
O clculo dos resultados deve ser feito pelo nmero de UFC/g ou ml de
bolores, multiplicar o nmero de colnias tpicas de bolores por dez e pelo
inverso da diluio. Para calcular o nmero de UFC/g ou ml de leveduras,
multiplicar o nmero de colnias confirmadas como leveduras por dez e pelo
inverso da diluio. Para calcular o nmero total de bolores e leveduras, somar o
nmero de colnias bolores e o nmero de colnias confirmadas como leveduras e
multiplicar por dez e pelo inverso da diluio.
Exemplo:
-Diluio 10-2 (inoculados 0,1 mL)
-Total de colnias tpicas de bolores na placa = 30
- Colnias presuntivas de levedura na placa = 40, cinco submetidas
confirmao, quatro confirmadas (80 %)
-Total de colnias de levedura na placa = 40x0,8 = 32
-UFC/g ou mL de bolores = 30x102x10 = 3,0x104
- UFC/g ou mL de leveduras = 32x102x10 = 3,2x104
-UFC/g ou mL de bolores e leveduras = (30 + 32)x102x10 = 6,2x104

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74

EXERCCIOS

Em que condies adversas os bolores e leveduras so considerados


resistentes?

2 Qual a consistncia do alimento em que predomina bolores e leveduras?


Justifique.

3 Qual a tcnica mais recomendada para anlise desses microrganismos?


Justifique sua resposta

4 O que a contagem de bolores e leveduras avalia?

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ENUMERAO DE COLIFORMES TOTAIS E


TERMOTOLERANTES

75

Captulo 8

8.1 CARACTERIZAO DO GRUPO COLIFORMES_____________________


No grupo dos coliformes totais esto apenas as enterobactrias capazes
de fermentar a lactose com produo de gs, em 24 a 48 horas a 35 C. Mais de
20 espcies se encaixam nessa definio, dentre as quais encontrando-se tanto
bactrias originrias do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de
sangue quente (Escherichia coli), com tambm bactrias no entricas (espcies
de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia, dentre outras).
A capacidade de fermentar a lactose pode ser verificada pela formao de
gs e/ou cido, nos meios de cultivo contendo lactose. Essas caractersticas so
utilizadas nos mtodos tradicionais de contagem de coliformes totais. Os
mtodos mais modernos detectam diretamente a atividade da enzima galactosidase, envolvida no metabolismo fermentativo da lactose, incorporando
substratos para a enzima nos meios de cultivo.
O grupo dos coliformes termotolerantes, comumente chamados de
coliformes fecais, um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros
capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5-45,5 C, com produo de
gs. Essa definio objetivou, em princpio, selecionar apenas as enterobactrias
originrias do trato gastrintestinal (E. coli), porm, atualmente sabe-se que o
grupo inclui membros de origem no fecal. Em funo dissoo termo fecal tem sido
gradativamente, substitudo por coliformes termotolerantes.
As principais aplicaes das enterobactrias e coliformes so como
indicadores das condies de higiene dos processos de fabricao, porque so
facilmente inativados pelos sanitizantes e capazes de colonizar vrios nichos das
plantas de processamento, quando a sanitizao falha. Os coliformes so

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76

indicadores de falha de processo onde contaminao ps-processo em alimentos


pasteurizados, porque so facilmente destrudos pelo calor e no devem
sobreviver no tratamento trmico. E. coli indicador de contaminao fecal em
alimentos in natura (mas no em alimentos processados).

8.2 MATERIAL NECESSRIO____________________________________


{

Vidraria

Equipamentos:

9 tubos de ensaio;

estufa bacteriolgica;

9 tubos de Durham.

autoclave.

Meio de cultura:

Acessrios

Caldo Lactose Bile Verde Brilhante

pipetador automtico;

(CLBVB)

ponteiras descartveis;
estante para tubos;
ala de platina;
etiquetas;
bico de Bunsen

8.3 METODOLOGIA____________________________________________
Para procedimento da deteco de coliformes totais a 35 C faz-se os
testes presuntivo e confirmativo. Para a realizao das anlises deve-se
higienizar a bancada e dispor o material, codificar os tubos e os frascos de
diluio e realizar diluies, para ento transferir com o pipetador automtico
1ml de cada um dos fracos de diluio para os respectivos tubos de ensaio
codificados (srie de trs tubos para cada diluio) e homogenizar os tubos de
ensaio aps inoculao. Em seguida, incubar os tubos a 35 ou 37 C por 48 h. Aps
esse perodo, realizar a leitura observando a produo de gs retido no tubo de
Durhan.

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77

Enumerao dos Coliformes a 35 0C: Amostra Lquida


I Teste Presuntivo

1 mL

1 mL

100

Lquido

10-1
1 mL

100

1 mL

10-1

10-2
1 mL

10-2

Meio de cultura: Caldo Lactose ou Lauryl Sulfato


Incubao a 35-37 0C por 48 horas
1 mL

100

II teste confirmativo
1 mL

10-1

1 mL

10-2

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78

Meio de cultura: Caldo Lactose Bile Verde Brilhante 2%


Incubao: 35 37 C por 48 horas
Figura 52 Esquema da metodologia dos testes presuntivo e confirmativo para enumerao
de coliformes totais

Enumerao dos Coliformes Termotolerantes (a 45 0C)

Tranferir uma alada do CLBVB positivo para Caldo EC

Meio de cultura: Caldo Escherichia coli (EC)


Incubao a 45 0C por 24 horas
Figura 53 Esquema da metodologia para enumerao de coliformes termotolerantes
(Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

Obs.: No caso de amostras slidas proceder com a primeira diluio sendo a 10-

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79

8.4 LEITURA _________________________________________________


As caractersticas a serem consideradas como indicao da presena dos
microrganismos alvo so: crescimento e produo de gs.
O crescimento verificado pela turvao do meio de cultura, desde que
no provocada pela prpria amostra. Nesse segundo caso, pode ser necessrio um
procedimento alternativo para confirmar o crescimento. Portanto, transfere-se
uma alada o caldo suspeito para um novo tubo do mesmo meio e verifica-se a
turvao confirma-se o crescimento do primeiro.
A produo de gs pode ser verificada pela formao de bolhas em turvos
invertidos (tubos de Durhan), colocados nos tubos de caldo antes da
esterilizao.

Figura 54 Tubos contendo Caldo Lactose Bile Verde Brilhante (CLBVB) positivos

8.5 RESULTADO ______________________________________________


A contagem de coliformes totais e termotolerantes realizada
respectivamente, a partir da contagem de tubos de CLBVB e EC, com
crescimento e produo de gs, confirmativos da presena de coliformes totais e
termotolerantes. Determinar o NMP/g ou mL usando uma das tabelas de NMP.

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EXERCCIOS

1 Cite gneros de bactrias do grupo coliformes totais:

2 O que indica a contaminao por coliformes totais e termotolerantes?

3 Qual caracterstica encontrada na contagem de coliformes totais?

80

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81

CONTAGEM, ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE


ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA.
Captulo 9

9.1 CARACTERIZAO DO ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA____

As bactrias do gnero Staphylococcus so cocos Gram-positivos


anaerbios

facultativos.

Este

gnero

formado

por

32

espcies

Staphylococcus aureus a mais relacionada a surtos de intoxicao alimentar,


devido capacidade de produzir enterotoxina. Os estafilococos so bactrias
mesfilas apresentando temperatura de crescimento na faixa de 7 a 47,8 C e as
enterotoxinas so produzidas entre 10 e 46 C, contudo a temperatura tima
est entre 40 e 45 C. As bactrias desse gnero so tolerantes a concentraes
de 7 a 20 % de sal e a nitratos. Em relao ao pH, S. aureus cresce na faixa de 4
e 9,8 e em atividade de gua mnima de 0,86.
Os Estafilococos so amplamente difundidos na natureza e fazem parte da
microbiota normal da pele e mucosas de mamferos e aves. O principal
reservatrio, no homem, so as fossas nasais. A incidncia nesta rea tamanha,
que parece ser impossvel sua eliminao. Ele um microrganismo oportunista
encontrado como microbiota das membranas mucosas (bucal, nasal e oral) em
seres humanos. Porm, cerca 50 % das pessoas sadias so portadoras de S.

aureus nas fossas nasais e garganta.


Os fatores que mais predispem contaminao vm da inadequada
manipulao dos produtos, resultando em contaminao cruzada na exposio dos
mesmos a temperaturas adequadas ao crescimento bacteriano. Cepas de S.

aureus enterotoxignicas podem ser encontradas nos alimentos a partir de sua


obteno primria, especialmente alimentos de origem animal. O alimento
contaminado tambm durante o processamento, a partir de manipuladores e a

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82

manipulao inadequada dos alimentos por portadores da bactria ou por pessoas


com ulceraes nos braos e nas mos, constitui-se na principal fonte de
contaminao dos alimentos por estafilococos.
As doenas causadas por toxinas apresentam amplo espectro de
manifestaes clnicas, como celulite, sndrome da pele escaldada, sndrome do
choque txico e intoxicao alimentar. Staphylococcus aureus uma bactria
patognica que, freqentemente, acomete pacientes hospitalizados, associandose a morbidades e mortes.
Os sintomas da intoxicao estafiloccica aparecem geralmente dentro de
quatro horas aps a ingesto dos alimentos contaminados. Os sintomas (nusea,
cibras abdominais, diarria, dor de cabea, sudorese, prostrao, e, algumas
vezes, uma queda na temperatura corporal) geralmente tm durao de 24 a 48
horas, e a taxa de mortalidade bastante baixa ou nula. O tratamento usual para
pessoas saudveis consiste em repouso e manuteno do balano de fluidos.

9.2 MATERIAL NECESSRIO____________________________________


o Vidraria
3 placas de petri.

o Equipamentos:
balana semi-analtica;
estufa bacteriolgica;

o Acessrios
pipetador automtico;

autoclave;
contador de colnias.

ponteiras descartveis;
ala de Drigalski;

o Meio de cultura:

tesoura e pina;

Agar Vogel Johnson ou

etiquetas;

Agar Baird Parker

bico de Bunsen.
o Reagentes
Telurito de Potssio a 20%;

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83

9.3 METODOLOGIA____________________________________________
Diluir 25 g da amostra em 225 mL de gua de peptona tamponada 0,1 % e
homogeneizar por trs minutos, correspondendo a diluio 10-1. A partir desta
suspenso, transferir 1 mL para um frasco contendo 9 mL de gua de peptona
tamponada 0,1% obtendo a diluio 10-2, e assim sucessivamente at a diluio
10-5.
Em seguida, transferir com o auxlio de um pipetador automtico e
ponteiras descartveis 0,1 mL de cada diluio para placas de Petri contendo
Agar Vogel Johnson adicionado soluo de telurito de potssio. Realizar
espalhamento com ala de Drigalsky e incubar a 35 C por 48 h.
Isolar as colnias as colnias tpicas em Agar Nutriente inclinado a 35 C
por 24 h, em seguida inocular uma alada da cepa em caldo BHI e incubar a 35 C
por 24 h. Aps esse perodo realizar o teste da coagulase. Transferir 0,2 mL da
cultura do BHI e 0,5 mL de plasma para um tubo estril, homogeneizar e incubar
no banho-maria por 4-12 h por 37 C.

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84

Contagem de Estafilococos coagulase positiva


1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+
25 g

225 ml de gua
de peptona
0,1mL

10-2

10-3

0,1 mL

0,1 mL

10-4

10-5

0,1mL

Duplicata

Agar Vogel-Johnson adicionado de


Soluo de telurito de potssio
Incubar a 35-37 0C por 48 h
Aps o perodo de incubao

1
2
3
1=2 Colnias tpica de Staphylococcus aureus 3= S. epidermidis

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85

Isolamento das colnias suspeitas

Colnias tpicas Agar Nutrient inclinado (35 C/24 h) Caldo BHI (35 C/24 h)

Teste da Coagulase

Caldo BHI

Coagulase

Teste da coagulase positivo - Nvel ++++


Figura 55 Esquema da metodologia para contagem, isolamento e identificao de
Estafilococos coagulase positiva
(Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

9.4 LEITURA ________________________________________________


{

Contagem em placas
Aps o perodo de incubao, observar o aspecto das colnias.

Staphylococcus aureus (coagulase positiva) apresenta colnias de colorao negra


em funo da reduo do telurito de potssio e halo amarelo, s vezes at a placa
inteira, devido utilizao do manitol pelo microrganismo. Ao identificar as
colnias tpicas, realizar a contagem das colnias nas placas que apresentarem
nmero de colnias entre 25 e 250, a raiz quadrada do nmero obtido deve ser a
quantidade de colnias a ser submetida ao teste da coagulase.

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Teste da coagulase

Aps 4 horas da realizao do teste da coagulase observar se houve a


formao dos cogulos, se no houver a formao do cogulo, aguardar 12 horas
para fazer a leitura novamente. Por fim observar o nmero de colnias coagulase
positivas e seus nveis.
9.5 RESULTADO ______________________________________________

UFC/g = n de colnias tpicas x D x % de colnias coagulase positiva x F


D = diluio
F = fator

10 se o inculo foi de 0,1 mL


05 se o inculo foi de 0,2 mL

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EXERCCIOS
Exerccio n0 ____
1

Estafilococos

Assunto: __________________
coagulase

positiva

considerado

um

microrganismo

toxignico ou infeccioso?

Quais os alimentos mais envolvidos em surtos de doenas de origem

alimentar causadas por este enteropatgeno?

3 Qual a importncia de sua deteco em alimentos?

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CONTAGEM EM PLACAS DE BACILLUS CEREUS


Captulo 10
10.1 CARACTERIZAO DO GNERO BACILLUS CEREUS______________

As bactrias pertencentes ao gnero Bacillus compreendem um grande


nmero de espcies, estando relatadas, at o momento 48 espcies diferentes.
Dentro do gnero Bacillus sp., a espcie Bacillus cereus tem grande importncia
em sade pblica em virtude do potencial perigo devido produo de toxinas
durante o armazenamento do produto aps envasado.
O Bacillus cereus um microrganismo Gram-positivo, aerbio, mesfilo,
produtor de esporos, amplamente distribudo na natureza, sendo o solo seu
reservatrio natural. Multiplica-se bem entre 10 e 48 C, apresentando um timo
de temperatura entre 28 e 35 C. A atividade de gua necessria para seu
crescimento 0,95, sendo seu crescimento bastante reduzido quando a
concentrao de Na Cl do meio 7,5 %. A faixa de pH em que ocorre
multiplicao varia de 4,9 a 9,3.

Bacillus cereus so geralmente isolados a partir de produtos crus e


processados, como arroz, condimentos, vegetais, preparaes crneas e
laticnios. A presena desse patgeno ou de seus esporos em alimentos
relativamente freqente e a indstria de alimentos encontra dificuldades para
eliminar o microrganismo do ambiente industrial. O Bacillus cereus pode causar
duas formas distintas de gastrenterites: a sndrome diarrica e a sndrome
emtica.

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10.2 MATERIAL NECESSRIO___________________________________


{

Vidraria
3 placas de petri.

estufa bacteriolgica;
autoclave;
contador de colnias.

Acessrios
pipetador automtico;

ponteiras descartveis;

Meio de cultura:
Agar Manitol gema de ovo

ala de Drigalski;

polimixina

tesoura e pina;
etiquetas;
bico de Bunsen
{

Reagentes
Gema de ovo a 50 %.

Equipamentos:
balana semi-analtica;

10.3 METODOLOGIA___________________________________________

Diluir 25 g da amostra em 225 m de gua de peptona tamponada 1 % e


homogeneizar por trs minutos, correspondendo a diluio 10-1. A partir desta
suspenso, transferir 1 ml para um frasco contendo 9 ml de gua de peptona
tamponada 1% obtendo a diluio 10-2, e assim sucessivamente at a diluio 10-5.
Em seguida, transferir com o auxlio de um pipetador automtico e
ponteiras descartveis 0,1 ml de cada diluio para placas de Petri contendo Agar
Manitol gema de ovo polimixina adicionado de gema de ovo 50 %. Realizar
espalhamento com ala de Drigalsky e incubar a 30 C por 18 h. Isolar as colnias
as colnias tpicas em Agar Nutrient inclinado a 35 C/24 h, em seguida
submeter as cepas aos testes bioqumicos:

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o Teste de utilizao anaerbia da glicose;


o Teste de decomposio da tirosina;
o Teste de Voges-Proskauer;
o Teste de reduo do nitrato;
o Teste de hidrlise da gelatina;
o Teste de resistncia a lisozima;
o Teste de colorao de cristais de toxina intracelulares;
o Teste de motilidade;
o Teste de crescimento rizide;
o Teste da atividade hemoltica.
1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+
25 g

225 ml de gua
de peptona

0,1mL

10-2

10-3

0,1 mL

10-4

0,1 mL

Duplicata

Agar Manitol Gema de Ovos- Polimixina


Incubao a 30 0 C por 18-24 horas

10-5

0,1mL

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Contagem de colnias
20 a 200 UFC/g

Colnias tpicas de Bacillus cereus

Isolamento em agar inclinado

Figura 56 Esquema da metodologia para contagem e isolamento de Bacillus cereus


(Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

10.4 LEITURA ________________________________________________


As colnias de Bacillus cereus so enrugadas, com um substrato rseo
variando at prpura, rodeadas por um espesso halo de precipitado branco.

Bacillus cereus so manitol negativo e por isso no h uma viragem a amarelo do


indicador de pH vermelho de fenol presente no meio de cultura, ou seja, o meio
permanece vermelho. Estes microrganismos apresentam tambm a lecitinase que
degrada a lecitina da gema de ovo e provoca a acumulao de produtos de
degradao em torno das colnias formando o precipitado branco. Ao identificar
as colnias tpicas, realizar a contagem das colnias nas placas que apresentarem
nmero de colnias entre 20 e 200.

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10.5 RESULTADO _____________________________________________

UFC/g = n de colnias tpicas isoladas x D x % de colnias confirmadas x F

D = diluio
F = fator

10 se o inculo foi de 0,1 ml


05 se o inculo foi de 0,2 ml

EXERCCIOS

1 Descreva a morfologia das colnias de Bacillus cereus no meio Agar manitol


gema de ovo polimixina e explique as reaes responsveis pelo aspecto das
colnias.

2 Quais os alimentos mais envolvidos em surtos de doenas de origem alimentar


causadas por este enteropatgeno?

3 Caracteriza o gnero Bacillus Cereus.

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93

COLORAO DE GRAM
Captulo

11

11.1 MTODO COLORAO DE GRAM_____________________________

A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido


pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e
que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo
calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica.
Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e
Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras
analisadas.
O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes
celulares de bactrias de reterem ou no o corante cristal violeta no citoplasma
durante

um

tratamento

com

etanol-acetona,

classificando

as

bactrias

basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. No que


diz respeito s caractersticas tintoriais, as bactrias Gram-positivas coram-se
de roxo e as bactrias Gram-negativas coram-se de vermelho.
Durante a colorao das bactrias do esfregao o cristal violeta e o lugol
formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere colorao
roxa tanto pelas bactrias Gram-positivas, quanto pelas Gram-negativas. Com a
adio de etanol-acetona, as bactrias Gram-negativas liberam o complexo
formado, pois a camada de peptidoglicana de pequena espessura , enquanto que
as Gram-positivas retm o comlexo, permanecendo roxas. A adio da fuccina no
altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactrias
Gram-negativas, que foram descoradas pelo lcool-acetona.

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11.2 MATERIAL NECESSRIO___________________________________

Os materiais necessrios realizao da colorao de Gram incluem:


o Ala de platina;
o Bico de Bunsen;
o Lmina;
o gua estril;
o Cultura bacteriana slida;
o Corantes e fixadores: cristal violeta, lugol, lcool-cetona e fucsina;

11.3 METODOLOGIA___________________________________________

Esfregao da cultura bacteriana slida:

Flambar a ala, deixar esfriar, mantendo-a prximo a chama e em seguida


retirar uma gota da gua estril e depositar sobre a lmina. Flambar novamente a
ala, esperar esfriar, e retirar uma amostra da cultura slida, e leva-la at a gota
de gua depositada sobre a lmina, e homogeneizar com movimentos circulares,
para obter um esfregao uniforme e fino. Por fim fixar o esfregao, passando a
lmina algumas vezes na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama.

Adio de corantes:

Colocar a lmina com o esfregao sobre o suporte e cubrr com cristal


violeta e deixar agir por um minuto, depois retirar o excesso. Em seguida cobrir a
lmina com lugol, deixar agir por um minuto e depois lavar novamente. Cobrir a
lmina com a soluo de lcool-cetona rapidamente e em seguida lavar a lmina.
Por fim cobrir a lmina com fucsina, deixar agir por trinta minutos, e

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novamente lavar, deixar secar por alguns instantes e depois passar no bico de
Bunsen para retirar o resto da gua. Ao trmino da adio dos corantes observar
a lmina no microscpico com a objetiva de 100x colocando o leo de imerso.

Figura 57 Metodologia da colorao de Gram

11.4 LEITURA ________________________________________________

A identificao das bactrias, aps o processo de colorao de Gram,


possvel em conseqncia da colorao que adquirem de acordo com a presena ou
no da parede celular. As bactrias Gram-positivas possuem parede celular e
apresentam colorao roxa, entretanto, as bactrias Gram-negativas no
possuem parede celular e aparecem com uma colorao vermelha quando as
lminas so observadas no microscpio tico.

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(1)
(2)
Figura 58 (1) Cocos Gam-positivos, (2) Bacilos Gram-negativos

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EXERCCIOS
Exerccio n0 _____
1

Assunto: __________________

Porque a presena ou ausncia da parede celular interfere na colorao

apresentada pelas bactrias aps a colorao de Gram?

2 Qual o corante ou fixador que tem ligao direta com o resultado final da
colorao das bactrias?

3 Quais microrganismos importantes em alimentos so gram-positivos e quais


so gram-negativos?

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BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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