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ADN en
lentejas
Objetivos
1. Indicar las funciones biolgicas del ADN.
2. Demostrar la presencia de AN en tejidos biolgicos.
3. Explicar los principios fsico-qumicos en que se basa la extraccin y
purificacin del ADN.
4. Indicar los usos del ADN genmico humano en el diagnstico molecular,
en gentica forense e ingeniera gentica.
Introduccin
La aplicacin de tcnicas moleculares inicia con la extraccin de ADN y la
obtencin exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran
medida, de la extraccin de ADN ntegro y puro.
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN
y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. El ADN est
constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble
hlice.
Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga
negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una
capa hidratante alrededor de la molcula. Pero, en presencia de etanol, se
rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas
condiciones se favorece la unin con cationes como Na+ que reducen las
fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y permiten que el ADN
precipite.
A lo largo del tiempo se han diseado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la
eliminacin de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior
de la molcula. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco
etapas principales: homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de
protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del ADN
EXTRACCIN DE ADN
Cuestionario de Revisin
1. Describa los principios generales de Extraccin de ADN.
El ADN se encuentra en el ncleo celular, muy replegado y unido a protenas formando la
cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido, romper las clulas para
separar el ncleo, romper el ncleo y liberar el ADN, separar las protenas y precipitarlo
para extraerlo de la solucin. El ADN aparecer como un agregado de fibras blanquecinas
que se adhiere.
1
Fragmentacin del
tejido
Anlisis
Lisis celular
Purificacin del
ADN
4
Purificacin
3
Clarificacin
EXTRACCIN DE ADN
1. Fragmentacin del tejido (Homogenizacin del tejido): La homogeneizacin,
mecnica o qumica, consiste en romper las uniones entre las clulas para facilitar la
interaccin con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material gentico, es
decir no es ms que la disociacin de las clulas para que pierdan contacto entre ellas y
as volverse ms vulnerables a la lisis celular.
2. Lisis celular: Rotura de las membranas celulares y nucleares para liberar el ADN.
Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecnica
(trituracin, lisis hipotnica, etc.); tratamiento qumico (detergentes, agentes
caotrpicos, reduccin con tioles) y digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
EXTRACCIN DE ADN
Cabezas
Colas
Lpidos de la Membrana
Detergente
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
Tiene papana, que es una enzima proteoltica (proteasa), la cual es una protena especializada
Contiene
ABLANDADOR DE CARNE
F ab ricac
i n d e
f rm a cos
con
gen tica
reco m b i
na n te
Tera p ia
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E studi
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n
g entic
a
P ru eba s
de
P atern id
ad
5. Diga usted cuntos usos se les puede dar al ADN una vez extrado.
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
Codificacin
de protenas
Permite la
capacidad de
mutacin
(Cambios
evolutivos)
Funciones
Biolgicas del ADN
Almacena
informacin
gentica
Su replicacin
asegura la
transmisin a
las clulas
hijas
Controla la
actividad de
las clulas
EXTRACCIN
8.
ADN
El ADN es muy estable y slo se requiere
mantener las muestras congeladas antes de
su extraccin.
Inicialmente es necesario llevar a cabo una
lisis para liberar al ADN del interior celular.
Algunos paquetes comerciales de alto
rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN,
MILIPORE, GENTRA y MoBio.
ARN
ARN total o Sub-celular (citoslico y nuclear)
Primero es necesario agregarle una solucin
que estabilice al ARN lo antes posible
Se minimiza la actividad de ARNasa liberadas
de las clulas lisadas
Extraccin con fenol cido (pH 4.5 )
Paquetes comerciales de compaas como
QIAGEN, Ambion y RNA-works
Diga usted cules son las diferencias en cuanto a la extraccin de ADN y ARN.
EXTRACCIN DE ADN
ARN
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
9. Diga usted cules son las diferencias entre los procedimientos de extraccin de
Extraccion de ADN
Vegetal
Extraccion de ADN
Animal
Diferencias
Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se encuentran en la secuencia de
bases en la hlice. Los compuestos que se encuentran en las clulas vegetales estn
ausentes en las clulas animales y las secuencias de bases de ADN reflejan esto, puesto que
el ADN genmico de la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales. Estas
EXTRACCIN DE ADN
EXTRACCIN DE ADN
Biologic
os
Quimicos
13. Explique usted por qu la medicin de una muestra de ADN a 260/280 nos da
informacin sobre la pureza de la muestra.
La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y
comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse
calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el
cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes
respectivos del ADN y el ARN puro son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de
carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.
La absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y
la de las soluciones de protenas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y
ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo
propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm
(A260/A280) proporciona una estimacin del grado de pureza de los cidos
EXTRACCIN DE ADN
nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de
onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml
de ADN bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30
g/ml de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente
A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr
determinarse con exactitud la cantidad de cidos nucleicos.
14. Diga para qu fines se puede utilizar el ADN genmico humano.
15.
Medicina
Forense
Bioinformtica
Ingeniera
gentica
y
Criminalstica
Nanotecnologa
del ADN
EXTRACCIN DE ADN
Pureza
Cantidad
Calidad
Concentracin
EXTRACCIN DE ADN
Reporte de Laboratorio
PROCEDIMIENTOS:
MATERIALES:
Arvejas
3
4
2
Balanza de 1
compensacin
NaCl
Agua destilada
Licuadora
Beaker de 250 ml
Beaker colar la sopa resultante
Licuar
15un
seg.
Pesar 100g de lentejas
Agregar 1g NaCl y 200 mL de
H2O todo porEn
Colador plstico, o
Filtro para cafetera
Jabn lquido
7
Reloj
6
5
Tubos de ensayo 13
8
9
x 100 mm
Gradillas
Ablandador para
carne
Alcohol al 70%
Agregar 1g gramo de ablandador, mezclarlo 5 min.
Agregar alcohol y dejar reposar 10 min.
Reloj Con un pincho limpio
Distribuir la solucin
en30
tubos
de jabn
ensayo
extraer el ADN
Agregar
mL de
lquido, esperar 10 min.
Pinchos de madera
para carne
EXTRACCIN DE ADN
Luego de ciertas dificultades con los filtros, la innovacin de utilizar papel toalla fue la
EXTRACCIN DE ADN
En esta imagen observamos los cinco tubos de ensayo, cada uno ya con ablandador d
Finalmente logramos apreciar un poco la precipitacin del ADN, a pesar que no se prec
Conclusiones
1. La extraccin de ADN, es un mtodo esencial y multidisciplinario, ya que
sus aplicaciones abarcan la Medicina clnica, Biotecnologa, Ingeniera
Gentica, Medicina Forense entre muchas ms disciplinas cientficas en las
cuales se ha abierto campo con los avances tecnolgicos de la ltima
dcada.
2. La extraccin de ARN difiere de la extraccin de ADN, ya que los
reactivos empleados son diferentes por las caractersticas fsico-qumicas
de las molculas, en la extraccin de ARN el pH debe ser cido mientras
que en el de ADN debe ser neutro.
3. Entre los buffer de extraccin de ADN tenemos el buffer CTAB, el buffer
CTAB 2x, el buffer STE. Los cuales contienen Tris-HCL, EDTA, CTAB,
NaCl, b-Mercaptoetanol entre otros reactivos.
4. En la extraccin de ARN se utiliza mayormente el mtodo GIPS, porque el
mtodo BOOM no es recomendable para ARN que ser sometido a la
tcnica de transcripcin reversa. El reactivo en comn de ambos mtodos
es el cido Tiosanato de Guanidina.
5. Los parmetros de la calidad de la extraccin de cidos nucleicos incluyen
la concentracin, la pureza, la integridad, el alto rendimiento de la muestra,
la exactitud y su fiabilidad para reproducir los datos.
Webgrafa
1.
2.
3.
4.
5.
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7.
8.
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http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdf
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http://www.microbialsystems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
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http://www.bteduc.bio.br/guias_es/70_Extraccion_de_ADN_de_diversa
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