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VALIDAO DE MTODOS FSICOQUMICOS.

Prof. Dr. Rodrigo Scherer


UVV Universidade Vila Velha
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rodrigo.scherer@uvv.br

GESTO DA QUALIDADE
PARA ATENDER:
Normas:

ISO 9001, ISO


17025...
INMETRO
ANVISA
MAPA
Internacionais (NIST....)
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Prof. Dr. Rodrigo

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VALIDAO DE MTODOS CONCEITOS

Validao (ABNT NBR ISO/IEC 9000).

Comprovao, atravs do fornecimento de evidncia objetiva,


de que os requisitos para uma aplicao ou uso especficos
pretendidos foram atendidos.

Certificao ou verificao da eficincia:

Comprovao, atravs do fornecimento de evidncia objetiva,


de que os requisitos para uma aplicao ou uso especficos
pretendidos foram atendidos. Porm no so realizados
todos os parmetros de desempenho do mtodo. a
comprovao de que o laboratrio tem competncia para
executar o mtodo j validado!!!

Qualificao:

Realizada em equipamentos uma evidncia documentada


de que o equipamento est operando em condies
adequadas.

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PORQUE VALIDAR UM MTODO?

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MTODOS OFICIAIS X NO OFICIAIS

Mtodo Normalizado: aquele desenvolvido por


um
organismo
de
normalizao
ou
outras
organizaes (por exemplo, AOAC, ABNT, ASTM, ANSI
ou APHA/AWWA/WEF), cujos mtodos so aceitos pelo
setor tcnico em questo.

Mtodo No Normalizado: aquele desenvolvido


pelo prprio laboratrio ou outras partes, ou adaptado
a partir de mtodos normalizados e validados. Por
exemplo, mtodos publicados em revistas tcnicas,
mtodos de fabricantes de equipamentos, mtodos
utilizando conjuntos (kits) de ensaio e instrumentos
portteis.

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QUANDO VALIDAR UM MTODO EM


NOSSO LABORATRIO?
Mtodos

no normalizados;

Mtodos

criados/desenvolvidos pelo
prprio laboratrio;

Mtodos

normalizados usados fora dos


escopos para os quais foram concebidos;

Ampliaes

e modificaes de mtodos
normalizados.
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E OS MTODOS NORMALIZADOS?

Mtodos normalizados j so validados, porm


em outros laboratrios, por isso devemos
comprovar a eficincia das condies do nosso
laboratrio para a reproduo do mtodo.
de responsabilidade de do laboratrio
verificar se as caractersticas de desempenho do
mtodo podem ser reproduzidas. (EURACHEM,
1998)
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COMO REALIZAR NA PRTICA E


QUEM REALIZA???

A validao realizada aps o desenvolvimento do mtodo


para uma aplicao desejada. Depois de todas as exigncias
serem atendidas o processo de validao comprovar a
eficincia do mtodo, e esse dever ser documentado e
adequado ao uso pretendido (normas, limites, legislaes...).

A validao deve ser planejada e realizada por algum que


possua

conhecimentos

procedimento

interno

de
de

validao
validao,

que

que

domine

nortear

o
os

experimentos.
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REQUISITOS DA NORMA ISO 17025


5.4 MTODOS DE ENSAIO E CALIBRAO E
VALIDAO DE MTODOS

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REQUISITOS DA NORMA ISO 17025


5.4.2 Seleo de mtodos
Quando o cliente no especificar o mtodo a ser utilizado, o
laboratrio

deve

selecionar

mtodos

apropriados

que

tenham sido publicados em normas internacionais, regionais


ou nacionais, por organizaes tcnicas respeitveis, em
textos ou jornais cientficos relevantes ou especificados pelo
fabricante do equipamento. Podem tambm ser usados
mtodos desenvolvidos ou adotados pelo laboratrio, se
forem apropriados para o uso e se estiverem validados.
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5.4.2 Seleo de mtodos
O cliente deve ser informado sobre o mtodo escolhido. O
laboratrio deve confirmar que tem condio de
operar adequadamente mtodos normalizados, antes
de implantar os ensaios ou as calibraes. Se o mtodo
normalizado mudar, a confirmao deve ser repetida. O
laboratrio deve informar ao cliente quando o mtodo por
ele proposto for considerado imprprio ou desatualizado.
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5.4.3 Mtodos desenvolvidos pelo laboratrio
A introduo de mtodos de ensaio e calibrao
desenvolvidos pelo laboratrio para uso prprio deve ser
uma atividade planejada e deve ser designada a pessoal
qualificado e equipado com recursos adequados. Os
planos devem ser atualizados medida que prossegue o
desenvolvimento do mtodo e deve ser assegurada a
comunicao efetiva entre todo o pessoal envolvido.

5.4.4 Mtodos no normalizados


Quando for necessrio o emprego de mtodos no
abrangidos por mtodos normalizados, estes devem ser
submetidos a acordo com o cliente e devem incluir uma
especificao clara dos requisitos do cliente e a finalidade do
ensaio e/ou calibrao. O mtodo desenvolvido deve ser
devidamente validado de forma apropriada, antes de
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ser utilizado.
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5.4.5 Validao de mtodos

5.4.5.1
Validao a confirmao por exame e fornecimento de
evidncia objetiva de que os requisitos especficos para um
determinado uso pretendido so atendidos.

5.4.5.2
Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados
para o uso pretendido, o laboratrio deve validar os mtodos
no normalizados, mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio
laboratrio, mtodos normalizados usados fora dos escopos
para os quais foram concebidos, ampliaes e modificaes de
mtodos
normalizados.
A
validao
deve
ser
suficientemente
abrangente
para
atender
s
necessidades de uma determinada aplicao ou rea de
aplicao. O laboratrio deve registrar os resultados
obtidos, o procedimento utilizado para a validao e uma
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declarao de que o mtodo ou no adequado para o uso
pretendido.
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MDULO 2:
PARMETROS DE
VALIDAO
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PARMETROS DE DESEMPENHO INMETRO

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PARMETROS DE DESEMPENHO ANVISA

Analticos

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Europa

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PARMETROS DE DESEMPENHO
Parmetro

Validao

Certificao

Seletividade

Linearidade

Faixa de trabalho e Faixa linear

Preciso

Exatido / tendncia (bias)

Limite de deteco

Limite de quantificao

Robustez

Incerteza de medio

X (17025)

X (17025)
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SELETIVIDADE
A seletividade de um a capacidade de avaliar, de forma
inequvoca,

as

substncias

em

exame

na

presena

de

componentes que podem interferir com a sua determinao em


uma amostra complexa.
Garante que a resposta seja exclusivamente do composto de
interesse;
Um mtodo instrumental que produz resposta para uma nica
substncia de interesse, pode ser chamado de especfico e um
mtodo que produz resposta para vrios compostos qumicos,
pode ser chamado de seletivo.
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SELETIVIDADE
Avaliao da seletividade:
1 - pode verificada a pureza do sinal atravs do espectro de
absoro ou espectro de massa para garantir que nenhum
composto conhecido ou desconhecido seja determinado junto
com o analito de interesse.
2 analisar a resposta de padres de mesma concentrao:
a) Adio de padro no branco;
b) Adio de padro na matriz;
Esse efeito conhecido com efeito matriz.
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Exemplo de efeito
matriz
Concentrao do padro de izoconazol 1 mg/g
Resposta no cromatgrafo em solvente metanol puro (A) em na matriz
pomada (B)
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7

A
0,99
1,09
1,07
0,98
0,93
1,04
1,05

B
0,87
0,78
0,76
0,76
0,79
0,87
0,88

mdia
DP
CV (%)

1,02
0,057
5,55

0,82
0,055
6,75

Diferena de 20%!!!!

Pode ser aplicado um teste de ANOVA, caso a


diferena seja considerada significativa, ideal fazer
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a curva de calibrao na matriz.
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LINEARIDADE, FAIXA LINEAR E


FAIXA LINEAR DE TRABALHO
A linearidade corresponde capacidade do mtodo em fornecer
resultados

diretamente

proporcionais

concentrao

da

substncia em exame, dentro de uma determinada faixa de


aplicao. A linearidade obtida por padronizao interna ou
externa com um mnimo de 5 pontos e formulada como
expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do
analito a ser determinado na amostra real. A equao da reta
que relaciona as duas variveis :
y = ax + b, onde:

y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);

x = concentrao;

a = inclinao da curva de calibrao = sensibilidade;

b = interseo com o eixo y, quando x = 0.

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LINEARIDADE, FAIXA LINEAR E


FAIXA LINEAR DE TRABALHO
O coeficiente de determinao (r2) usado para
indicar o quanto pode ser considerada adequada
a reta como modelo matemtico, sendo que a
faixa linear de trabalho ser definida como o
intervalo compreendido entre o limite inferior e o
limite superior da faixa avaliada. No existe um
valor padro para o coeficiente mas geralmente
se trabalha com valores como r2 > 0,98.

Recomendado: 7 pontos, no mnimo em triplicata

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= 21 dados.
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LINEARIDADE, FAIXA LINEAR E


FAIXA LINEAR DE TRABALHO
Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de
concentraes do analito ou valores da propriedade no qual o
mtodo pode ser aplicado. Todo experimento de determinao
da faixa de trabalho iniciado pela escolha de uma faixa
preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de
aplicao para a qual o ensaio vai ser usado e a concentrao
mais esperada da amostra deve, sempre que possvel, se
situar no centro da faixa de trabalho.
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TIPOS DE CURVAS: PE E PI
COMO ELABORAR E COMO
AVALIAR?

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PRECISO

Define-se preciso como o grau de concordncia entre


resultados de ensaios independentes obtidos em condies
(pr-estabelecidas)

especficas.

valor

da

preciso

geralmente expresso em termos de impreciso na forma de


coeficiente de variao (CV) ou desvio padro relativo (RSD),
obtido por estudos de repetitividade, preciso intermediria e
reprodutibilidade, para a validao do mtodo obrigatria a
execuo de repetitividade e preciso intermediria. O CV
calculado pela seguinte frmula:

CV (%) = (desvio padro/mdia) x 100


Quanto maior a preciso menor ser o CV.

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PRECISO TOLERNCIA DO CV (%)


Horwitz et al. (1980): CV = 2(1 0,5 log C)

Tabela 1: Exemplos de CV para mtodos quantitativos


referentes a um intervalo de fraes mssicas da
substncia a analisar.

Frao mssica

CV (%)

1 g/kg

(*)

10 g/kg

(*)

100 g/kg

23

1000 g/kg

16

(*) Para fraces mssicas inferiores a 100 g/kg, a aplicao da equao


de Horwitz resulta em valores inaceitavelmente elevados. Por
conseguinte, os CV relativos a concentraes inferiores a 100 g/kg 28
devem ser o mais baixo possvel.
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PRECISO
REPETITIVIDADE
representa a concordncia entre os resultados de medies
sucessivas de um mesmo mtodo, efetuadas sob as mesmas
condies de medio, chamadas condies de repetitividade:
mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento
usado sob as mesmas condies; mesmo local; repeties em um
curto intervalo de tempo.
Mnimo: 7 repeties de todo procedimento em 3 faixas de
concentrao (faixa linear de trabalho)
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PRECISO
PRECISO INTERMEDIRIA
Indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a
eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou
diferentes equipamentos ou uma combinao destes fatores.
A preciso intermediria reconhecida como a mais
representativa da variabilidade dos resultados em um nico
laboratrio e, como tal, mais aconselhvel de ser adotada.

Mnimo: 15 repeties de todo procedimento


Tambm avaliada com amostras reais on line
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PRECISO
REPRODUTIBILIDADE
o grau de concordncia entre os resultados das medies
de uma mesma amostra, efetuadas sob condies
variadas

(mudana

de

operador,

laboratrio,

equipamentos, etc.). Embora a reprodutibilidade no seja


um componente de validao de mtodo executado por
um nico laboratrio, considerada importante quando
um laboratrio busca a verificao do desempenho dos
seus mtodos em relao aos dados de validao
obtidos por meio de comparao interlaboratorial.
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Prof. Dr. Rodrigo

PRECISO INMETRO DOC-CGCRE-008

Como avaliar os resultados?

Quais so os critrios de aceitao?

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EXATIDO
Exatido do mtodo definida como sendo a
concordncia entre o resultado de um ensaio e o
valor

de

referncia

convencionalmente

aceito

verdadeiro.

Os

como
processos

normalmente utilizados para avaliar a exatido


de um mtodo so, entre outros: uso de materiais
de

referncia,

participao

em

comparaes

interlaboratoriais e realizao de ensaios de


recuperao, para a validao do mtodo pelo
menos um dos itens deve ser executado.

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EXATIDO
MATERIAIS DE REFERNCIA CERTIFICADOS
(MRC)
Sempre que possvel, os materiais de
referncia certificados (MRC) devem ser
utilizados no processo de validao de um
mtodo de ensaio.

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EXATIDO

II. RECUPERAO
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de
amostras adicionadas com quantidades conhecidas do
mesmo (spike). As amostras podem ser adicionadas com o
analito em pelo menos trs diferentes concentraes, por
exemplo, prximo ao limite de deteco, prximo
concentrao mxima permissvel e em uma concentrao
prxima mdia da faixa de uso do mtodo.

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EXATIDO
II. RECUPERAO
Quantos ensaios devem ser realizados? No mnimo 3
replicatas nos 3 nveis de concentrao (baixa, mdia e
alta).
Como avaliado?

Qual o critrio para aprovao: No existe um padro,


o prprio laboratrio deve estipular um critrio.
Valores aceitos: depende das concentraes avaliadas;
geralmente em torno de: 80 120%, 75 120%, depender
da concentrao: quanto menor for a concentrao maior
ser o intervalo.

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EXATIDO
III. ENSAIOS DE PROFICINCIA:
uma atividade obrigatria para obteno e manuteno da
NORMA ABNT ISO/IEC 17025

O processo colaborativo uma forma especial de ensaio


para avaliar o desempenho de um mtodo nas condies
normais de trabalho em vrios laboratrios, por meio de
ensaio de amostras homogneas preparadas
cuidadosamente. Os laboratrios recebem relatrios sobre
seu desempenho nas auditorias de medio, que tem por
base o z score onde o resultado deve ser SATISFATRIO.

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LIMITES DE DETECO E
QUANTIFICAO

Quando so realizadas medidas em amostras com baixos


nveis do analito ou de uma propriedade, como por exemplo,
anlise de traos, importante saber qual o menor valor de
concentrao do analito ou da propriedade que pode ser
detectado pelo mtodo.

importncia

desta

determinao

os

problemas

associados a ela advm do fato de que a probabilidade de


deteco no muda rapidamente de zero para um quando
seu limiar ultrapassado.

Muitas controvrsias so originadas devido ao fato de no


haver

atualmente

uma

concordncia

da

terminologia

aplicvel. O termo limite de deteco no aceito por

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todos, apesar de ser usado em alguns documentos oficiais.


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LIMITES DE DETECO
LIMITE DE DETECO DO EQUIPAMENTO (LDE)

definido como a concentrao do analito que


produz um sinal de amplitude de 3 vezes maior que o
sinal de amplitude do rudo/branco. Pode ser
determinado com soluo padro.

LIMITE DE DETECO DO MTODO (LDM)

definido como a concentrao do analito que


produz um sinal de amplitude de 3 vezes maior que o
sinal de amplitude do rudo. Determinado com a
adio de padro no branco da matriz, dessa forma
considera-se o efeito matriz.

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Prof. Dr. Rodrigo

LIMITE DE QUANTIFICAO (LQ)

O Limite de Quantificao a menor concentrao do


analito que pode ser determinada com um nvel aceitvel
de exatido e preciso. Pode ser considerado como
sendo a concentrao do analito correspondente ao valor
da mdia do branco mais 5, 6 ou 10 desvios-padro.

Tambm pode ser definido como a concentrao do


analito que produz um sinal de amplitude de 5, 6 ou 10
vezes maior que o sinal de amplitude do branco da
matriz no intervalo de tempo onde o composto
analisado.

Parmetro muito avaliado em auditorias, deve ser muito


bem avaliado e documentado !!!!!
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ROBUSTEZ
A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade
que este apresenta em face de pequenas variaes. Um
mtodo diz-se robusto quando se revelar praticamente
insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer
quando o mesmo est sendo executado.
Para determinar a robustez de um mtodo, o INMETRO
recomenda o teste de Youden. Trata-se de um teste que
permite no s avaliar a robustez do mtodo, como
tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes
nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia
de cada uma dessas variaes.
Tambm pode ser utilizado um teste de comparao de
mdias como o Tukey (Anova).

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ROBUSTEZ
Fator

Nominal

Variao

Tempo de agitao

10 min.

2 min.

Concentrao cida
Temperatura de

1M

0,1M

aquecimento
Tempo de aquecimento

40

5 min.

1 min.

Agitao

sim

No

PH

6,0

0,5

Pode ser realizado um planejamento experimental com todas


variveis ao mesmo tempo, ou pode-se avaliar cada varivel de
forma isolada e aplicar ANOVA (P < 0,05).
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