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Capitulo 15 Espectrometria de Luminescéncia Molecular abordados neste capi, a saber: fuareseéncia molecular fosforescéncia cquimiluminescéneta. Em todaseles aléculs do analito séo excitadas para resultar ein sana espécte cui es- peciro de emissto fornece informagdo para andlise quaitariva ‘1 quanaitativa. Esses procedinentos sdo canhecidos coletiva- mente como métodos de luminescéncia molecular. A fuorescencia ea fosfresctvia sto simitares, no rocame cm que a excitagao ¢ feia por absorso de forons. Conseqente- ‘mente, os dois enémenas sto fregitentemente mencionados pelo teeria amis ence fototwminescéneia. Coma sent mostrado a Sequin a fluorescéncia difere da fasforescéncia pelo fara de que 45 transigées elerénicas responsdveis pela fluorescéncia no emotvem uma mudanca de spin eletdnico. Consegiientemene, 4 fluorescéncia apresente tempo de vida curto, com a fumines- céncia cessando quase imediaamente (< 10s), Em contraste, «uma mudanca no spin eletrinico acampantha a emisdo por fos. forescéncia 0 que fe: coo) que a radio se mantenha por um tempo facilmente dereciivel apis o termina da iradiag to fre- attentemente vévios segundos ou ainda mais. Na mator parte dos ‘casos, a emissdo de fotoluminescéncia, seja fluorescéncia ow Fesforesceneia, tem comprimento de anda maior que a radiagao susada para a sua excitagdo, A quimituninescéncia estd baseada no espectro de emissio dle una espécie exciiade que €fornada no decorrer de ura rea- &o gulmic, Ein algumas cireunstncas.o especie exctada 0 produto de wna reagio entre o anata e um recente aprmpriae dla (normatmente um axidasne farte con osinta perso de hidrngénio o resulado & um spectro caracteristco do produ: 40 de oxidagao do anutito ow do reagente, em vez daiguete do préprio atalita, Em owrascireunsnctas, oanalito noes de retamente eivolvido ne reagdo de quimiluminescéncia: @ efeito de inibigao ou cavalitice do anativo sobre una reagto quimiturai= hescente serve como parametno analiico. A medida da iniensidade de forotumineseéncta ou quimilioni- neseéncia permue a determinaga quaunitariva de wna varieda- de de espécies orgitnicas e inorgdnteas importaines « niveis de rage. Atualmente, o nimero de métodos fluarimétricns & signif cantemiente maior que o nimero de aplicas es de procedinentos de fosforescéucta e quimiluninescéncia, Um dos aspecios mais arvaemes dos métodos de huminess céneia &a sua sensibilidade insetnseee, com limites de detecgao Sregiiememente de uina a trés ardens de grandeza menores gue os encontradlos em espeeiroscopia de absorciia, Os limites de de tecgdo tipicas esto na fava de pares por bite. Qutia vunagen dos méiedos foroluminescentes é a sua er senso faixa de conceniracdo linear: gue, com fregiléncia, € signi Aicativamente maior que as encontradas em métodos de absor- $80. Devido & sua alia sensibitidade, os mérados de luminesen= cia quantitatives esto sujeltos a efeitos de inserferéncie sérins das matrices das anvostras. Por essa razita, as medigbes de tum snescéncia sia fregiientemenze combinadlas com técnica espe das de separagio da cromatografia e da eletraforese. Detect ves de fluorescéncia sia valiosos coma detectores pra cvomater gra liquide (Capitulo 28) e elerroforese eapilar (Capistlo 30) devido d sua sensibifidade incomeun. Geralmence os agindos de luminescéncia apresertan apt cago menos ample para anise quantiativa que ox metudas de _ absorgdo, porque wn mimero muito maior de espécies abvorve radicgito wlaraviotetah iste! da que exibe forolumineseneite sob bsoicde de radiacao nessa regido do espectro," 15A TEORIA DA FLUORESCENCIA E POSFORESCENCIA A fluorescéneia ocorre em sistemas quimicos gasosos, liquids e slides simples, bem como em sistemas complexes. A especie ‘ais simples de fuorescéncia € aquela apresenta por vapores at6micos diluids, descrita no Capitulo 9. Por exemplo, os elé= lwons 3s de éiomos de vapor de sédia podem ser excitados 20 es- ado 3p por absorgio de radiagio de comprimentos de onda de 5.89 e 5.890 A, Apds 10° a 10" 5, os elétrons voltam a0 estado fundamental ¢, ao fazer isso. emivem radiao des mesmos dois comprimentos de onda em todas as diregdes. Esse tipo de uo. rescéncia, em que a mdiagZo absorvida € reemitida sem mudan- (Gade frequigncia, ¢ conhecida como radiagda de ressondncia ou Mluorescéncia de ressondneia. Muitas especies moleculares também exibem flioreseéncia die ressonincia. Muito mais frequentemente, a9 entanto, as ban das de Nuorescéncia molecular (ou fosCorescéncia) sto encontra {das cestradas em comprimentas de onda que sto maiores que a Finha de ressondncia, Esse deslocarnenta para comprimentos de onda maiores ¢ denominado desiacomento Stokes. ISA-1 Estados Exeitados que Produzem Fluorescéncia e Fosfarescéncia As caracteristicas dos espaetros de fluorescéncia e fasforescén- cia podem ser racionalizadas pelas consideragdes simples de or- bitais moleculares descritas na Segio 14B-l, No entanto, um en tendimento da diferenca entre os dois fendmenos fotolumines centes requer uma revisdo sobre spit eletbnico e estados excita dos sigietestripletes. Spin Eletrinico O principio de exelusdo de Pauli diz que quaisquer dois elgirons mm um tomo nJo podem ter os mesmos valores dos quatro nii- eros quinticos. Essa restrigdo exige que nfo mais de dois elé {rons possam ocupar um orbital e, mais ainda, os dois devem ter estados de spin opesios. Nessa ciscunstincia, diz-se que os spins estio emparelhiados. Assim, a maioria das moléculas niio apre- Senta campo magnetica intrinseco sendo denominada diiamagné- tica, isto, no é atraida nem tepelida por campos magnéticos estaticos. Em contraste, 05 radicais livres, que contém eléirons desemparethados. tém momento magnéiico e consequentemente silo atrsidos por um campo magnético: radicais livres sao. entio. Paramagnéticos. "Paro discusio wiplemenar sobre teria apliengbes de Muncecinea, Fen rescdneia © lumineseancia, veia Malecuer Lintnescence Specreeop. S Scholmn, ES. New York: Wiley Par 1985; Pa 2, 1988, Pst 3.1999, E(. ‘ote in Physica Merits of Chemis tod, Volume VII- Chapter 3 W. Rossiter and R, C. Bueteold, E86 New York: Wiley. 199K. akowis, Principles of Forescence Spectoseap: No Yor: lem Pres, 1983: 6-6. Guitbaok, Practica! Freneicenn, 2nd ed. New Yorks Morel Deer. 1990 Capitulo 15 Espectrametria de Luminescéncia Molgevlar 323 Estados Exeitados Singlete/Triptete ‘Um estado eleririca molecular no qual todos os spins eletrani- £08 esto emparelhados € chamado estado siniglete e nenhums Separagio de niveis de energia ocorre quando a molécula é ex posta 2 um campo magnético, O estado fundamental para uin ra ical livre, por outro lado, é um estado dublete. porque o elétron ‘solado pode cer duas orientagies em um campo magnética, 0 ‘que da energias diferentes ao sistema, Quando um elétron de um par em uma molgcula é excitado um nivel mais alto de energia. forma-se umn estado singlets ou lum criplete. No estado excitado singlere, 0 spin do eléiron pro- ‘movido ainda esti emparelhado com @ elétron no estado funda- ‘mental: no estado triplete. entretanto, os spins dos dois elétcons Ficaram desempareihads e so, desta forma, paralelos. Esscs e5- tados podem ser representados como s¢ segue, com as Seias re- preseniando as diregées de spin A nomenelacuta single, dublete¢ triplete vem de consie- sagGes espectosedpicas de mulipcidade, com as quai nde pre- cisamos n9s preocupar aqui. Observe que o estado excitado tri plete sem energia menor que o estado singlete correspondente AS propriedades de uma molécula no estado excitadotriple- te difecem muito daquelas do estado excitado singlete, Por exem- plo, uma molécula€ paramasndtica no estado trpletee diama- tia no singlet. Mais importante €, no entanto, 0 fato que uma transigdo singtereftriplete fou 0 oposto), que também envoive lua mudanga de estado eletrOnico, é um evento significativar mente menos provivel que 4 transigso singletelsinglete comres- pondente, Como conseqiiencia, o rempa de vida médio de um es tada exctuda triplete pode variar de 10~ a virios segundos. em ccomparagdo com o tempa de viéa meédio de 10° a 10s para urn estado excitado singlete. Mais ainda, aexcitagio induzida por re diagio de uma molécula no estado fundamental a um estado ex estado triplete tent poven probabilidade de ocorrere os picos de absorgio decorrentes dese procesto sa0 ordens de magnitude imenores que as transigdes singletesinglete andlogas, Veremos ‘no entanto, que um estado excitado triplete pode ser povoado partir de um estado exctado singlete em certas maléculas; a con- Seqiéncia final desse processo¢,frequentemente, a fosforescen- cia Diagrama de Niveis de Energia de Moléculas Fotoluminescentes 4 Figura 15-1 mostra um diagrama parcial de niveis de energia de uma molécuts foxoluminesconte tipica. A linha hosizontal rossa mais inferior representa a energia do estado fundamental {a molécula, que & normalniente um estado singlete e & de 324. Prineipios de Analise Instrumental Estados exctados singlete Estado excitado plete T= cont Relaagto oft t IE Cruzamenio He te imersisema 4 } —s STrrte é Conversa ‘Aborgta Fuoresctcis imerna { { Relaragio. 1 Taco . i r " Enid a fandamentat aK ky Figura 18-1 do So, A temperatura ambient, esse estado representa as ener- gins de essencialmente todas as moléculas em uma solugdo, As lina grossas supriores soos niveis de enersia para os estados furdarenais vibracionais de trés estados eletronicos ex. citados, As duas lnhas a esquerde rpresentam o primeira (S) € segundo (S2) estados eletrnicosexeitados singlees.A da dite ta (T) representa a energia do primero estado eletricorrple- ‘e, Como é normalmente 0 caso, a energia do primeiro estado ex- citado triplet € menor que a energia do estado singlete cores. pondente Numerososniveis de energiavibracionais esto associados a ada um dos quatro estadoseletnicos,conforme sugerio pelas linkashorizontais mais fnas CConforme mostrado na Figura 15-1, excita dessa molé cula pode ser consesuida pela absorgo de duas bandas de radia- 650, uma cenirada no comprimento de onda iy (Sp > Si) a se- _zunda no comprimento de onda menor Ag (Sy —» Ss). Observe aque oprocesso de excita resulta na conversio da molécula em qualquer dos estados excitados vibracionas, Note ainda que a excitagto dre 20 estado triplet nfo esté mostrada porque essa transigio no ocorre de modo significativo, uma ver que esse process0 envolve mudanga de multiplicidade, um evento que. conforie mencionamos, tem probabilidade de ocorténcia baixa (uma transigao de baixa probabilidade desse tipo 6 chamada proibida, 15A-2 Velocidades de Absorgio e Emissio ‘A velocidade com a qual um féton ¢ absorvi Simao pro- racer eranier de 10-9 11FS Sy ‘mositado na Figura 15-| no sta hem campreendidos. Os niscis vibracionais do estado fundamental podem se superpce aos g difeilmen. te €observada; em vez diss, essa emissdo fica restria aos pro- ‘88808 menos energticos R* > re Re +n ver Figura 14-3 pa 1 observarasenersias relaivas associadas a essstrasigGes), Como ji notams, normatmente uma moléculaexciada ele- tronicamente volta ao seu estado exciindo mais Baixo por uma série de reloxagoes vibracionaisrpidas e conversdesinternas {que nea produzem emissio de radiagto. Assim, auorescéncia comumente se origina de uma transigfo do nivel vibracional snsisbsino do primeizo estado eletrnicoexcitado para um dos nivels vibraciomas do estado eletrinico fundamental. Para a ‘aior parte dos compostos fhuorescentes entéo, a radiagha € praclida por uma iansigfo n — w* ou n> w”, dependendo.de ‘al da Cuas ¢a menos energetic. Eficiéncia Quamica ¢ Tipo de Transicao dserva-se empirieamente que a fuocescénciaé mais comumen #2 encontrada em compostos nos quais as transigBes de menor energis sho do tipo x + x* que em compostos nos quais a tan- sigGo de menor energia € do tipo m —» n°, isto €, a eficiéneia quinoa € maior para transigbes n* +r, A eficiéneia quintica maior associada ao processo m -> x* pode ser racionalizada de dois modos. Em primeiro lugar, a ab- Sontvidade molar de uma transigo m+ x* é notmalmente 100 1.000 vezes maior que para um processo + eessa grande: 24 representa uma medida da probabilidade de wansigao em qualquer ditesio. Assim, © tempo de vida intrinseco associado a ma tansicio x + n* é menor (107? a 10" s ein comparagéo Capitulo 15. Espectrometia de Luminescéncia Moleculse 327 com 10a {0s para uma sransigdo n> m*) ¢ Arma Bquagdo 15+ | é maior. Consideragées termodinamicas sugerem que a velocidade de cruzamento intersistema k; € menor para estados excitados m+ * porque a diferenga de enersia entre os estados singlete et plete € maior; isto é, mais energia € necesséria para desempate tharos elgtrons do estado excitado n+. Como consequéncia, a su Perpesi¢io dos nfveis vibracionais do triplete com os do singlete menor, bem como a probabilidadie de um crazamento intersis- Em resumo, 2 fluorescein esta mais comumente associada a sransigbes +r porque spreseniam tempos de vida médics me. ‘ores (Ar maior) e porque cs processos de desativagdo que com ppetem com a fluorescéncia sio de ocarréncie menos proviivel Fluorescéncia Estrutura A Muorescéncia mais intensa e mais itil € encontrada em com- ostos contendo grupos funcionais aramatieos com niveis de ttansigzo x > n° de baixa energia, Campostos contendo estrutu- ‘a3 aliféticas, alicielicas carboniicas ou estruturas de ligacoes duplas aliomente conjugadas também padem apresentar fluores. céncia, mas em menor nimero se comparado ao dos sistemas aromaticas. A malaria dos hidrocarbonetos aromaticos niio-sebstiuidos fluoresce em solugao e a eficiéncia quintica aumenta corn oni ‘mero de anéis ¢ seu grau de condensagio, Os heteroctclicos sim ples, como piridina, furano, tiofeno e pirral, Voax ‘do apresentam {luorescéncia: por outto lado, estruturas com anéis condensados apreseniam. Acredila-se que, em compostos heterociclicos nitrogenados, a transigao eletrinica de nivel mais Daixo soja um proceso m ~> n° que rapidamente se converte em tum estado tiplete e previne a fluorescéncia, A condensasao de andis benzénicos a nicleos heteroe‘clicas, no entarto, resulta em ‘um aumento da absortividade molar do pico de absorgao. O tem: po de vida de um estado excitado & menor em tais estruturas: a Muorescéncia ¢ entdo observada em compostos como quinolina, isoquinolina e indol, 8 q | N S Sy 1 2 Z ‘inne Isang int ‘A substituigo no anel benizénico causa deslocamentos tos com primentos de onda dos méximes de absorgio e mudangas corres- pondentes nos picos de fuoresc8neia, Adicionalmente, a substi twigdo afeta, com freqiiGncia. a eficiéncia de Muoresedncia: al- guns desses efeitos esto ilustrados nos dados para derivados do benzeno na Tabela 15-1. 228 Prineipios de Andlise Instrumental TABELA 18-1 Eteito da Substituigdo na Fluorescéncia do Benzeno* Comprimento de Onda da Intensidade Relativa — Formula Hunrctnls on Sco sana Cal 70310 a | reteeo catchy 270.329 n | Propilbenzeno (CoHsC3Hy 270-320, 7 Reavis cate 20.320 ‘0 | clorobenzeno CaHgCt 215.445 7 | Bromobenzeno ColsBr 290-380 5 | addon ca : 0 | | Fenol (CsHsOH (285-365. 18 toners catyo 310-400 ‘0 Anil Gxrsoct, 215.345 x0 atin cate Hoos » | fonaivo catenin - 0 Acido benzdico (CgHsCOOH 310-390, 3 Benzonitrila CoHsCN 280-360 20 | CaHeNOy : 0 | | Nitrobenzeno | Niobe “Ei solugaoctandicn A influéncia de substituicZo por halogénios € notivel: 0 de- réscimo na fluorescéncia ao se aumentar o nimezo atSmico do halogénio ¢ atribuido em parte a0 efeito de itomo pesado, que ‘aumenta a probabilidade de cruzamenta intersistema para 0 esta do triplete. Acredita-se que a pré-dissociagio tenha um papel im- Portante em iodobenzeno ¢ nitroderivadas também; esses com Posios tém ligagbes de facil ruptura que podem absorver a ener~ Bit de excitagdo em seguida & conversio interna, AA substituigdo de um grupo carboxilico ou carbonflico em tum anel aromético geralmente inibe a fluorescéncia, Nesses compostos, a enersia da transi¢do n> m* é menor que na tran 80 — *; como ja mencionamos anteriormente, o rendimen- to de fluorescéncia do primeito tipo de sistema é normalmente baixo, Efeito da Rigides Estrutural Sabe-se empiricamente que a fluorescéncia ¢ favorecica em mo- ‘eculas que possuem estruturas rigidas. Por exemplo, as eficién- Cias quanticas de fluoreno e difenil sao aproximadamente 1,0 ¢ 0.2, respectivamente, em condigdes de medida semethantes, A Sp thy Aqui, a radiagZo aparece no azul com picos em 384 e 394 nm. ‘Sua intensidade ¢ proporcional a concentrago do dimero de en xofte excitado. Similarmente, a combustdio de compostos de (6s- foro em chama de hidrogénio dé uma emiss4o devido a HPO* ‘em 526 nm. Curvas de trabalho lincares sobre quatro décadas de cconcentracio foram registradas. Ambas as téenicas de quimilu- ‘minescéncia de chama tém sido usadas para a detecgdo de espé- cies de enxofre e fésforo em efluentes de colunas de cromatogra- fia gasosa Andlises de Espécies Inorganicas em Fase Liquida ‘Mauitas das andlises feitas em fase liquida vullizam substincias organicas quimiluminescentes contendo o grupo funcional oO Il —C—NH—NHR sees reagentes reagem com oxigenio, peréxido de hidrogénio e ‘muitos outros agentes fortemente oxidantes para dar um produto de oxidagio quimiluminescente. O luminol é 0 exemplo mais co- ‘mum desses compostos. Sua reagio com oxidantes fortes. como oxigénio, peréxido de hidrogénio, ion hipoclorito e fon perman- Banato na presenga de base forte ¢ dada abaixo. Freqiientemente, lum catalisador & necessario para que essa reagio ocorra com tuma velocidade itil. A emissao produzida coincide com o espec {10 de emissio fiuorescente do produto, 0 anion 3-aminofialato: ‘a quimiluminescéncia é azul e centrada em 425 nm. ° xn ON y20H-+0 cou 7 Nit i emt © Netto 0 coo- luminol (oa 3aninoalao Dentro de eertos limites, a intensidade de quimiluminescén- ia do luminol é diretamente proporcional & concentragio. seja do oxidante, do catalisador ou do luminol. Consequentemente, a Capitulo 15 Espectrometria de Lumineseéncia Moleevlar 339 eagdo fornece um método sensfvel para se determinar qualquer luma dessas espécies. Por exemplo, usando peréxido de hicrogé. io como oxidante. 0 catalisador Co pode ser estimado em con ccentragto de até 0,01 nmol/L, Cr*até 0,5 nmol/L e Cur" até | AmoV/L. Com alguns cétions, ocorre inibigdo da luminescéncia: fem tais casos, o deeréscimo na intensidade permite a determina. ‘do das concentragoes. Andlises de Espécies Orgdnticas Para aumentar a seletvidade de reagées de quimiluminescéncia e-estender a quimiluminescéncia a analitesnio-envolvidos dice. tamente nas reagbes,€ pica comum se preceder a etapa quim Juminescente por uma reagio enaiméica na qual osubsteat ¢ 0 analito desejado ¢ um dos produtos € detectado por guimilun nescéncia, Isto € feito mais comumente em sistemas em ‘luxe, com colunas de enzima imobilizada. Recentemente, no entanto, ‘atengao tem sido ditigida a0 desenvolvimento de biossensores empregando-se enzimas imobilizadas em fibras 6picas. Enzimas oxidases que geram HzO sfo comumente usadas na etapa de pré-detecgao. Nao apenas HO» pode scr determina: docom diversos sistemas de quimiluminescéncia, mas o oxidan- te necessétio (03) jé est presente na maior parte das amostas, especialmente aquelas em solugo aquosa, Supondo-se uma con: versio quantitativa pela enzima, substrates podem ser determina. «os até entre 102 100 nM, do mesmo modo que H03, Substia- {08 detectados desse modo incluem glicase,colestero, colina, ‘cido rico, aminogcidos,aldefdose lactato, Por exernplo: sido isi + O,""ataninas HO, Esse método pode ser estendido usando-se etapas enzimiti- as seqilenciais para finalmente converter o analito em uma quantidade equivalente de um produto quimiluminescente. D se modo, agicares que nao glicose, glicos{deos, ésteres de coles- terol, creatinina ¢ aceticolina foram determinades."* Por exci plo: sicatose + H,O "aD glicose + frutose @-D-glicose = B- D~ghcose Homer B-D~glicose +0, eid glicinico + HO Lumino! mais um catalisador peroxidase parece sero siste- 'ma ideal para a determinagao de H202. O pico da intensidade quimiluminescente ¢ atingido em cerca de 100 ms; 0 solvente é aquoso, mas compativel com alguns componentes orgtinicos: 0 limite de detecgio & de cerca de 0,1 pM, com linearidade em trés ‘ou quatro décadas de concentragaio. “C.A.K, Swinglehunt ang A, Nieman, An, Chin, Acts, I9RK, 205.195.