Universidad de Antioquia

Instituto de Biologa
Gentica de la Conservacin
Consulta
2015-1

Por:

Alejandra Mara Moreno Sierra - 1.020.393.841

Frecuentemente en las muestras fecales el ADN existente est a menudo muy
degradado o contaminado con material gentico exgeno e inhibidores de la
PCR como sales biliares, polisacridos y bilirrubina presentes en las heces, esto
requiere que se lleven a cabo protocolos que garanticen la exactitud de los
resultados de las muestras. Es recomendable que las muestras sean frescas y
se almacenen de manera adecuada. Muchos autores recomiendan el
almacenamiento con slice o con etanol al 95% y 96%, para obtener buenos
resultados.
A continuacin se describe un mtodo estudiado para varias muestras fecales
de diferentes mamferos con la cual se comprob la efectividad de los
resultados, al encontrar una alta calidad en el ADN extrado.
El DNA fecal fue extrado comenzando con 1-1.5 g de heces depositadas en un
tubo de centrifuga de 15 mL.
Las heces fueron llevadas a vrtex y lavadas utilizando 5 mL de etanol,
despus centrifugada (4000xg, 2min) el sobrenadante fue descartado, el paso
de lavado fue repetido un vez ms utilizando 5 mL de TE (10 mM Tris, 1mM
EDTA, pH8).
Se adicionaron al tubo de centrifuga 3 mL de TNE (10 mmol/L Tris-Cl, 0.5% SDS,
1 mmol/L CaCl2) y 50 L de proteinasa K (20mg/mL) para la digestin
enzimtica y fue llevada a incubacin a 55C por 1-2 h.
Subsecuentemente, el lisado fue centrifugado (4000xg, 1 min) el sobrenadante
fue transferido a un nuevo tubo de centrifuga que contena 3g de almidn de
papa. El tubo fue llevado a vrtex por un minuto para suspender el almidn
completamente, y la suspensin fue incubada por un minuto a temperatura
ambiente. El tubo con el almidn fue centrifugado (8000xg, 3 min) para
precipitar el almidn.
Despus 600L de sobrenadante fue pipeteado en un nuevo tubo de centrifuga
de 2mL, al cual se adicionaron 150 L de solucin de NaCl (3.5 mol/L) y 250 L
de solucin de CTAB (0.7 M NaCl, 10% cetil trimetil- bromuro de amonio CTAB)
seguido de incubacin a 70C por 10 min.

La mezcla fue extrada utilizando dos veces un volumen igual de fenol:

cloroformo: alcohol isoamlico (25:24:1), despus el sobrenadante fue
transferido a un nuevo tubo. Un volumen igual de buffer (4M hidroclorato de
guanidina, 1M de acetato de potasio, pH 5.5) fue adicionado al tubo, se mezcl
y se aplic a una columna de centrifugacin (de EZNA Cycle-pure kit, Omega;
loading Ultrafree-MC 30000 filter membrane, Millipore), despus fue llevado a
un tubo de microcentrfuga de 2mL y fue centrifugado a 6000xg por 30 s.
Finalmente, el filtrado fue lavado dos veces por centrifugacin (8000 xg, 1 min)
usando 750L de etanol al 75%. El DNA fue eludo con 200 L TE y 50 L/mL de
RNasa.
JUSTIFICACIN
Para una gran porcin de heces, es mejor almacenarlas en etanol y llevarlas a
un fuerte vrtex para remover desechos pequeos, los cuales pueden ser
fcilmente transferidos por la pipeta.
En el paso del lavado usando agua y etanol, sustancia solubles como algunos
inhibidores son removidos. En el siguiente paso, una rpida lisis realizada con
una solucin de SDS, solo las clulas del intestino se lisan.
En el paso de adsorcin, el almidn de papa absorbe sales biliares, bilirrubinas
y otros inhibidores al mismo tiempo, reduce el volumen del lisado y facilita la
extraccin siguiente.
En el lisado salinizado, el NaCl suprime la coprecipitacin de polisacridos y
ADN. Los polisacridos fueron tomados por el CTAB en lugar del ADN y se retir
en la extraccin con fenol: cloroformo: alcohol isoamlico (25: 24: 1). Se utiliz
CTAB-fenol/cloroformo/ alcohol isoamlico para remover polisacridos, la adicin
del buffer CTAB puede ser menos efectivo en muestras que contienen menos
polisacridos. Reduciendo el tiempo de lisis tambin puede decrecer el
contenido de polisacridos.
En los pasos siguientes de aislamiento de ADN, usamos la columna de
centrifugado (basada en una membrana de gel de slice) para purificar y
recuperar el ADN rpidamente.
Combinando varios pasos de purificacin, este nuevo mtodo funciona
eficiente con muestras fecales de animales con varias dietas, como herbvoros,
carnvoros y omnvoros. Para muestras de algunos animales carpfagos, una
extraccin adicional despus del paso de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico,
con cloroformo puede ser efectivo para remover contaminantes fenlicos.
Porque los polisacridos proveen una fuerte inhibicin en la PCR.

BIBLIOGRAFA

ZHANG. Bao-Wei, LI. Ming, MA. Li-Chao, WEI. Fu-Wen. (2006). A Widely
Applicable Protocol for DNA Isolation from Fecal Samples. Biochemical Genetics,
Vol. 44, 11-12. [Internet]. Consultado el 11 de julio de 2015. Disponible en:
http://download.bioon.com/view/upload/month_0808/20080803_b522fd297332
87cdd0d12UxVmnKRNZ9k.attach.pdf