logia estrutural Cristalografia de Proteinas: metodologias e aplicagdes em Bioquimica Maria Joio Romio 1.1. Introdugaio Instituto de Tecnologia Quimica e Biolégica Apartado 127 Os prineipais passos envolvides 2780 OEIRAS ¢ na resolugdo da estrutura_ de Instituto Superior Téenico proteinas por anise cristalogritica Departamento de Quimica fneontramse esquematizados no 1096 LISBOA CODEX Giagrama da Figura 1. © primeiro asso envolve 0 isotamenio a 1. Principios da rincipios bisicos da cristalografia Purificagio da protefna de wm Cristalogratia de {le proteinase dos prncipais passos a determinado orgonismo, ea sue seguir numa anélise estrujural, mas °tstalizaglo numa forma adequada 2 tambim explicar donde surgem os cola des dados de difracgio de los. ific raios:X Uma vez obtidos ‘A ditracgto de raios-X aplicada a ™odelos cristalogréficas, 0 que : andes HOS fplicais sipnificam, e como a sua qualidade Tonoctstis da proteina purieada ode ser avaiada a parir de medemse as dieesies Proteinas macromoléculas biol6gicas é técnica que mais tem influenciado a iNformagio complementar descrita tntensidades dos rios-X difeciades Cea et rural, tendo 05ttabalhospublcados,embora nfo Por sus czas Os dacs i nete io aidy parse connecimenta da explictamente represeniada no abalhades e, por wei ds melodes Se eee tied de eéleulo automético, produz-se uma "imagem do contetdo do proteinas, dcidos nucleicos, virus © Exemplifica-se a aplicagio da cristal" em termos de um mapa de outras macromoléculas A primeira cristalografia de raios-X com a densidade elecirénica (cf. Figura 2- estrutura de uma proteina foi descrigfo. suméria dos métedes © 4) Esta “imagem” tem entGo que ser descrita nos anos 60 pot Kenérew et resultados para trés diferentes ©2805 interpretada com a ajuda de variados al [1], para 2 mioglobina Desde — coneretos. métodos de célculo e 0 uso de ‘entio, e em especial desde a década iogtes grificen, que permiindo sete ten eee uma visualizago tridimensional, cerescente expansfio do mimero de a ‘ 7 facilitam a construgio de um modelo struturas resolvidas Estes exudes ‘molecular consistente com a imagem tém permitide compreender melhor 6 principios bisicos da arquitectura ——_*M#mrsvevar nests das proteinas, bem como estudar, spats rum detalke a nivel at6mico, os centros catalticos de enzimas © compreender a especificidade das reacgées que estas catalisam O conhecimento. da._—estrutura ee tridimensional permite investigae as =r] “| relagdes entre sequéncia priméria, ee i F a estiutura e funcio, com uma pectiaes | ea an indiscutivel importdncia no desenvolvimento especifico de drogas (arug design), bem patente no crescente interesse ¢ actividade demonstrados pot __companhins eee a quimicas e — farmacéuticas no. dominio da determinagio de = cestruturas de protesnas cnr 1 Com este artigo, pretende-se dar uma breve pespectiva nfo. s6 doe Figo: Resear pit po noid numa deen esuutural de protetaas 1B. Boletim de BiotecnologiaBiologia Estrutural a) b) ura 2») Seego de densidde elesice, como repesnada numa eas gfe pata um wogo de cadsia Pb) Intapreagio da mesma dnsdade cet respondent modelo meer sobepos A rong epesenla a xidoreduae do aleido (MOP de Die e65-A871 (1) inicialmente obtida (Figura 2-b). O 1.2. Cristais de proteinas modelo resullante é, portanto, cconsequéncia de todo um processo de andl cristalogritien, do se UM cristal é a sua estrutua interna, overdo. no eniant, encarilo coma Widimensionalmente ordenadae fb entidade real que foi “de facto” — Petiédica, na qual as moléculas esto cobseivada A qualidade do modelo empteotadas ¢ unidas por meio de final é resultante e dependente no 36 intetegbes nfo covalentes Cada dos dados experimentais iniciais, Wma das menores unidades do tal como também de pardmetroy QUE S¢ Fepete infinitamente nas tes ‘optimizados durante os processos de ‘iensbes do espaco & designada por cdleulo Torna-se assim essencial élula_unitéria ou célula elementar, compreender 0 modo como os caractetizada por 3 vectores a, bce cristaldgrafos obtém os modelos 5 Angulos @, 8, y, definidos na atémicos de proteinas a partir de Figura 3. Em sistemas relatvamente dados de diltaego de raios-X Nos simples, ais como ies ou compostos pavégrafos que se seguem de Baixo peso molecular, as energias Gescrevem-se sumariamente ag de ligagfo ¢ 0 niimeto de ligagoes principais fases, problemas e _potenciais no estado solido sfio bem Timitagbesassociados & determinagoconhecidas, podendo 0 crestimento da estrurna de protefnas. dos ciistis ser tralado como qualquer processo fisico. No entanto, no cas das macromoléculas, as imteracgées so muito mais complexas menos bem compreendidas, apesar da respectiva A caracteristica fundamental de cristalizagio obedecer aos mesmos prineipios gerais das _moléculas, equenas AS principais forgas que ‘mantém a integridade dos cristais de proteinas so ponies de hidrogénio entre os tomas A superficie da molécula, muitas vezes mediadas por moléculas de gua. Assim, as moléculas de protefna formam uma estrutura pouco compacta com cavidades e canais preenchidos por solvente, 0 qual ocupa cerca de 40- 60% do volume do cristal Isto pode constituir uma vantagem para a reacgio de cristais de proteinas com pequenas moléculas, que se podem difundir através dos canais mas &, por ‘outro lado, a causa da extrema Fragilidade dos cristais de proteinas A. estratégin empregue para induzir a cristalizagdo de macromoléculas consiste em atingir lentamente um —esiada de solubilidade minima, alcangando-se assim um certo. grau de sobressaturagio Se 0 processo de agtega¢io resultante ocorrer muito rapidamente, pode formar-se um precipitado amorfo mas, caso haja tempo suficiente © uma barreira energética pequena, —_podem-se formar cistais a partir do precipitado = Em = geral, aconselhével atingit 0 pono de saluragiio muito lentameate de modo a faciliiar © ordenamenio das, moléculas numa sede cristalina Os métodes empregues na cristalizagio de protefnas envolvem, em geral, a variagio de um grande niimero de condiges experimentais, nomeadamente o pH, tipo concentragio de precipitante, e a temperatura Entre os precipitantes mais vulgarmente empregues, © origem Figura 3. Uma ella unkéris da ede crisaling Boletim de Biotecnologia 19Biologia Estrutural destacam-se 05 sais, tais como sulfatos (de NH4* ou Li*), citrates & fisfatos (de Na* ou K*), 0s sleoois de baixo peso. molecular ¢ © 0 polietilenoglicol (PEG) de pesos moleculares médios ene 400 20000 Um ensaio tipico de varrimento inicial (sereening) de condig6es experimentais includ a variagéo de uma vasta gama de concentragées de piecipitantes ¢ de pH, de diferentes tipos de precipitantes, de diferentes “aditivos” (pequenas _moléculas ¢ ies), em geral, de duas tempeiaturas (#7 © 200) E Trequente comegar-se por mais de 100 variagdes, cada uma das quais requer 2-441 de solugdo de proteina {com uma concentiagio de ~5-15 mg/ml, ede elevado grau de purcza) ‘A escolha das experiéncias mais adequadas 6, de cetto modo, guinda pelo conhecimento prévio de varios factores, tis como © protocolo de puificagio e comportamento da protefna durante a mesma, as Condighes de estabilidade © © ponto isoeléetrico da protefna, entre outros Para os ensaios de cristalizacao, podem-se empregar varias técnicas, das quais, uma das mais usuais € 0 chamado método_da_difusio_de apot, no qual se deixa equilibrar uma gota contend solugio. de protefna e solugio precipitante, num teservatério contendo a solucio precipitante (Figura 4). Neste sistema fechado, a difusio de vapor provoca uma transferéncia de gua da solugio de pioteina para o reservatério, até que a concentragdo de precipitante seja a mesma em ambas as solugdes Uma vez atingido ‘este equilibrio pode-se formar um precipitado = amafo. ou micioctistalino ou, nalgumas 4 Exquema exemplifcaiva do rmStoda de aiusso de vapor 20 Boletim de Biotecnologia condigbes mais felizes, material cristalino Em eral, apés um primeito conjunto de ensaios torna-se necessirio refinar determinados pardmetros de modo a optimizar as condighes. preliminares até que se obtenham cristais de boa qualidade © de dimensoes aprecidveis (2 0,2mm) ‘Apés uma primeira observagao dos cristais numa lupa, © criério chave que decide da sua utilidade na andlise estrutural € 0 modo como difractam 0s raios-X. 1.3. A difracgao dos raios-X Qualquer objecto iluminado com uum tipo apropriado de feixe (luz visivel, neutries, elecrGes ou raios- X), provoca um efeito de disperstio ‘A interferéncia das ondas difvactadas pelos pontos individuais que eonstituem 0 objecto produz um padiio caracteristico conhecido como padtio_de_diftaccio Por exemplo, na Figura 5, esté representado © padtdo originado por Figura 5. Padrio de diracgso (hela) obtdo com um retivlnds de exferas cordenedas(esqucda) (adptado de Rhodes 1993 um reticulado de esferas ordenadas Trata-se, na realidade, do padrao de iftaegdo éptico produzido pela luz laser visivel, difundida por fiadas de orificios numa mascara opaca, observando-se que 0 espagamento das manchas do padrdo de diftacgio (eflexdes) varia inversamente com 0 cespagamento das esferas No caso da Figura 6, esta representado 0 padrio de difracgao de um cristal de uma protefna —Analogamente, existe também aqui uma rélagdo_ inverse simples entre © espacamento das células elementares (Figura 3) de um cristal - chamada cede real -, © 2 distincia enue as reflextes no reticulado registado no filme (Figura Figura 6 Cristal a oxidrettase de aldedo (MOP) de D_ gigas (hipiimide ‘exagonal -0 6min e respective padkto de iingto 6) - rede reciproca Uma vez que 0 espagamento da rede real é inversamente proporcional 20 das, reflexes, podem-se caleular as dimensOes da céluia elementar do cristal, a partir do espagamento cobservado na rede reciproca do filme obtido por difracgto de raios-X © Fendmeno da difraogio de raios-X foi explicado por Sir Lawrence L. Bragg da Universidade de Cambridge (2). que demonstiou {que os Aingulas com que emergem os feixes difiactados por _cristas, poderiam ser colculados uatando 0 fendmeno da difracgio como uma “rellexdio" por conjuntos de planos, paralelos ¢ equivalentes, definidos pelos dtomos de um cristal E por esta taro, que cada mancha do padio de diftacgio se designa potBiologia Estrutural feixe difizciado feixe incideme sen 8 dien® Figura 7. Difisesdo de ries porum eral eLe de Brags reflex. Os aios-X, “reflectidos” Na Figura 8, exemplifics-se como se por planos adjacentes, percorrem pode calcular @ (€ portanto a diferentes distincias Bragg resolugio d) a partir das posigbes demonstrou que a diftacgio sé relativas das manchas de difracgio core quando a diferenga da registadas por exemplo num filme distineia peicorrida igual a um Exemplificando para o caso da tmiliplo do comprimentos de onda Figura 6: sendo (A) a distincia do do feixe de raios-X Esta distincia é filme ao cristal de 100mm © a por sua vez, dependente do angulo distincia méxima r (medida entre as de reflexdo (8) (Figura 7) A relagio manchas mais exteriores ¢ 0 centro ‘entre este Angulo 8 e 0 comprimento do filme } de ~55mm => @ = 144° de onda 2, € dada pela chamada “lei (29 = tan"! 55/100) resultando que a de Bragg", 2dsenB=n), a partir da resolugiio do padrio de diftacgtio qual se pode definir 0 termo correspondente € de dine 3.1 AA resolugio d@ de um padrio de ifracgo como dpyig=A2SCMB ma simbolizagao dos planos de difracgao ‘num cristal & feita por meio de 3 filme fixe difractado feixe incidente feixe incidente Figura 8. 0 ingulo de eflexdo 6 para um rio directed. pole ser enlculado a parti ds 90%) (completeness), redundlncia, isto 6 rnimero de observagdes por teflexao 2+ Qualidade dis fies experimeniais: Quanio melhoves forem as fases inicialmente calculadas, melhores sero 0s primeiros mapas de densidade electénica © portanto menos provaveis sero, em prinefpio, ceiros sigoifieativos no modelo Final 3+ © factor R final e informaco acerca do refinamento: 0 factor R (vd 1.6) mede o grau de acordo entre as amplitudes observadas caleuladas: se R for maior do que 0.25, poderio existir_—_ertos importantes no modelo; se R for menor do que 0,20, apenas existirio alguns errs locais Para estruturas de alta resolugio (2 A ou melhor), é geralmente considerado que R<0,20 indica uma precisio média nas coordenadas atémicas de =0,2 A Note-se contudo, que nalgumas partes do modelo, esta precisto seré Imelhor © nouttas piot, 0 que é feflectido pelo factor de temperatura ou de vibroct térmica By para tomes com fsctores Bj muito maiores do que a média, as Tespectvas coordenagss terf0" uma menor piecisio e vice-versa Além disso deve-seatendet ainda & ra2i0 entre © mimero. de reflextes pardmetros refinados, a qual deve ser © maior possivel. 4 Modelo final : Na andlise do modelo final dever-se considerar desvios dos Angulos Gistincias de ligagio em telagio a valores padido. Valores lpicamente ‘encontrados sfo por exemplo 0,01- 0.025 A, para distancas, € 1,53.0° para angulos (vd Tabela 1), Em termes esecoquimices, devemse anal, entre ovirs, 0: angulos de torso y (definido pelos dtomos N- Ca-C-N da cadeia principal) ¢ > (definido pelos atomos C-N-Ca-C) (Fig 17-2), em termes de um dliagrama de Ramachandran, no qual se representam os angulos ye @ para cada residuo Os Angulos y e @ nio podem assumir qualquer valor ene Tabela 1. Estatistica do refinamento Flavodoxina CSHase = MOP [11] (oxidada)[3} 4) Limite de resolugao (A) 220 1020 1020 NP total de reflexes 10649 56644 58791 beceeratied ino a 1096 7853 7367 N® de motéculas de = He ae agua Factor R (%) 178 186 168 Factor B médio (A?) lomos de proteina 23.5 19.0 30.9 moiéculas de équa 42.8 373 288 Desvios estereoquimicos em relagdo a valores padréo de distancias de ligagao (A) tn is tae angulos de ligagéo @) 29 ar 18 180° © +180", devido aos contactos entre stomos de residuos adjacentes, © as zonas “permitidas” (helices-c,, folhas-f) centram-se em regides cujas fronteiras dependem das distincias de van der Waals permitidas A localizasio, na Figura 17, das letras & € B, corresponde aos Angulos conformacionais de residuos em —élices-c ou folhas-B respectivamente, Para estruturas altamente refinadas, praticamente todos os dngulos ye @ deverdo estar localizados nas regises energeticamente mais favordveis, com excepgao da glicina, devido a Ago possuir uma cadeia lateral em co 2. Exemplos da aplicagao da Cristalografia de Raios-X a determinagao estrutural de proteinas Os exemplos que a seguir se apresentam pretendem ilustar a aplicasdo da cristalografia de raios~ X para dois casos de estruwuras novas (22 € 23) € para 0 caso mais simples de uma esteutura pertencente a uma dada familia, para a qual era conhecido um modelo estrutural (21), Em 2.2 ¢ 23 abordar-se-d a andlise estrutural de duas proteinas novas - uma amido-hidrotase [4] (2.2) e uma metaloproteina contendo molibdénio associado a um co-factor plerinico © centros de FeS (11] (23), enquanto que em 21 se natard da andlise. de uma flavodoxina (3}, para a qual existem esiruturas homélogas conhecidas Para os ues casos, tentar-se-d dar uma visio sumdria que incida sobre ‘0s aspectos mais relevantes no sé dda parte experimental, como também do modelo refinado © implicagses bioquimicas mais importantes Boletim de Biotecnologia 27Biologia Estrutural (mononucledtido de flavina) inserido numa cadeia polipeptidica, 0 qual pode assumirtrés diferentes estados de oxidagio : oxidado, semireduzido (semiquinona) ¢ totalmente reduzido ‘A flavodoxina pertence a um bem (hidroquinona). A flavodoxina que conhecido grupo de proteinas de ** analisou foi isolada de D tuansferéneia electrénica, que 2stffuricans ATCC 27774, possui possuem um grupo FMN_ wma massa molecular de 15 kDa, © foi analisada por cristalografia de 2.4, Flavodoxina de Desulfovibrio(D.) desulfuricans ATCC 27774 em dois estados de oxidacao diferentes a b 180 PSI Ww gore LEU ast ta 0 0 9 7 0 180 l od) 180) ° PHI 180 Figura 17. a) Definigio dos Angules eoafermacionis ye § em sepresemorie cenercostpica 6) Diggrama de Ramschandran para a protina MOP AS Gli so representadas como *e podem ocorrer fora das znas energlcamentefavordvels Dus 907 sminodeidos, of que possuein Sngulos conformacionss W e@ fora das segibespexmitdae ‘ao (com una excep) em contacto eéximno com ox eafectors 2B Boletim de Biotecnologia taios-X, estudando cristas natives da proteina oxidadae crisis preparados na forma semireduzida © potencial redox E2 para o pat oxidadorsemiquinona (E2=-40mV; pH 7.0), & substancialmente mais positive que o valor E! para o par Semiquinona/bidioquinona (B= 387mY), sendo sabido que a modulagdo dos potenciais redox resulta ‘de diferentes energias de ligago da grupo FMIN nos dilerontes estados de oxidagio da proteina A dterminagio da esuutura 3D. da flavodoxina foi realizada para dois Aifeyentes estados redox Prepararam-se cristas nativos de flavodoxina, usando sulfato de aménio como precipitante ¢ pH 5.3, que se catacterizaram como possuindo uma simetria trigonal (grupo espacial P3221) e constanies da célula a=b=95,94 A, c=33,74 A, R120" Os cristais semireduzidos (de cor violeta) foram —obtidos tratando os cristais oxidados (de cor amarela) com ditionito de sédio a pH 7.0, tendo sido mantidos numa atmosfera de a1gon para a recolha dos dados de difracgio. Sto cconhecidas esiruturas 3D de diversas flavodoxinas homélogas tratando-se, portanto, de um problema cristalogrético de Substtuicfo Molecula: Como modelo usou-se a flavodoxina de D wulgaris (que possui uma hiomologia em termos de sequéncin primérin de 49%) cencontrou-se com facilidade uma solugio para © posicionamento eoueeto na eélula unitéria da Aavodoxina de D desulfuricans. Nos pasos seguinies da andlise estrutural, iniciou-se 9 refinamento do modelo com o qual se calcularam mapas de densidade electrénica. Foi- se progressivamente introduzindo a sequéncia de aminodcidas correcta € corrigindo —manualmente alguns residues menos bem detinidos Finalmente, inoduziram-se moléculas de agua em posigdes razodveis (analisando a estereaquimica © interacgdes por pontes de hidrogénio), num total de 93 © o factor R final convergiu até 17.9% (8,0-2.0 A) (vd. Tabela 1)Biologia Estrutural Nas. fases finals do. refinamento, verificou-se que 0 C-terminal possuia dois residuos adicionais em Felagio A sequéncia publicada, os quais foram identificados como Vall47-Leul48, com base na densidade —electrdnica eos ccontactos estabelecidos com residuos ptSximos, nomeadamente de cardcter hidrotdbico 0 modelo refindo foi ento usado para anolisar a forma —semireduzida, tendo-se calculado um mapa de siferenga de Fourier (Fay(semiteduzida)-Fey(Oxidada)) Como esperado, as _principais diferengas entre ambas as estruturas surgiram na vizinhanga do grupo prostético — FMN, —sugerindo nomeadamente uma inversio da conformagio (peptide flip) do peptides Gli6|-Met62. Esta importante alteragio contormacional foi modelada na densidade electronica e refinada, tendo 0 modelo final da forma semireduzida sido tefinado até um factor R=19.4% (dados de resolugo 8-215 A; 83 moléculas de gua) © enrolamento da cadeia polipeptidica (Figura 18), € muito semelhante a0 da flavodoxina de D. vulgaris, com uma topologia 0.8, Uipica desta classe de protefias Com se teferiu de inicio, um dos objectivos desta andlise era a comparagio de diferentes estados de Figura 18. Represontglo esquermdies da ‘opologie ds Flavodoxina com 0 cosfector YN evidelado como esferas unidas ent 0) igura19.Represemagioestreoscpies do grupo FMN « inversio da conforma da igago epfdica GUGI-Me62 que acorte ae se passur da forma exidada da Navodoxina (inkas mais lars) 8 expetiva forma stieeduzd (inhas mais esewas) [3] coxidagdo em termos estruturais, No centanto, ttatando-se de mais um membro da classe das flavadoxinas, permitiu também uma —andlise comparativa em —fetmos das esiruturas 3D cohecidas Esta ‘comparacio foi feita, por um lado, por sobreposigio dos tespectivos tomos da. cadeia principal e, por outro, considerando uma anilise detalhada do tipo e mimero de pontes de hidrogénio estabelecidas nna vizinhanga do co-factor FMN, © mediadas ou no por moléculas de gua, Este tipo de imeracgdes © estrutura do solvente, taduzem-se num diferente grau de estabilizagao do grupo Mlavinico, 0 que se reflecte nomeadamente em diferencas dos potenciais redox. Dado © Ambito eral deste artigo, no se discutiré em —pormenor este —_aspecto, considerando-se antes as diferengas observadas nos dois estados redox estudados Como jé se toferiu, a incipal diferenca entre os estados oxidado ¢ semifeduzido, € a ccorréncia da_—inversio. da cconfiguragiio da Tigagtio peptidica GIi61-Met62 (Figura 19), resultante da redugo por um electifo do grupo FMN: Enquanto que na forma oxidada (linhas mais claras na Figura 19) 0 grupo carbonilo da Gli61 aponta para o lado oposto a0 do. anet flavinico, na forma de semiquinona (linhas mais escuras na Figura 19), ocome a alteragio conformacional que permite que 0 grupo carbonilo da Gli61 estabeleca uma ponte de hidrogénio (assinalada na Figura) com 0 dtomo de azoto NS da flavina, © qual se encontra protonado neste estado redox 2.2- Amido-hidrolase da carbamoilsarcosina (CSHase) de Arthrobacter sp A CSHase 6 uma enzima envolvida num percurso metabélico de degradagao da creatinina_em microorganismos ("via da N-meti- hhidantoina”), sendo a creatinina degradada a glicina, e envolvendo como — inermedirios, N-metil- hidantoina, N-carbamoflsarcosina © sarcosina, A CSHase catalisa uma dessas reacgdes, a reacgio de hhid’6lise da N-carbamoflsarcosina a sarcosina, com libertagio de didxido de carbono ¢ aménia: Boletim de Biotecnologia 29Biologia Estrutural MOR ean «6 ‘As enzimas envolvidas _nestes processos degtadativos (incluindo a CSHase) tem sido utlizadas na determinagao da crestinina no soro ¢ luna para 0 diagnéstico de distungoes renais, A andlise cristalogrifiea desta enzima [4] teve por objectivo estudo da sua fungio © andlise de possiveis semelhancas mecanisticas com outras amido-hidrolases ja conhecidas. Por cxemplo, a ‘reatinase (que esti envolvida noutro processo alternative de degradagio dda cieatinina a ereatina) apesar do realizar uma reacglo muito semelhante i catalisada pela CSHase, nfo possui em comum com esta ttima qualquer analogin em termos de estrutura priméria ou tercidsia gene da CSHase de Anthrobacter sp toi clonado Sequencindo e expresso em E.coli (patente DEAO29844) A enzime apresentase como. um homotetrimero na sua forma activa, possuinéo 264 aminoscidos por subunidade Numa primeira fess, obiiveramse cristais de CSHcso, usando. sulfate de aménio como precipitante, a pH 5, criss estes «que difraciam para além de 2,0 A, ¢ que pettencem a0 giupo espacial monoclinico C2, com constantes da eélulaunitéria 22,29 A, c=70,87 A, Bo 91.82 Tratandose de wma estrotra desconhecida, foi necessario prepatarderivados de stomo pes Método da Substiwwicio Isom Milipla Apés um elevado nimero de tentatives, conseguiram-se otter quatro derivados titeis na resolugio do problema da fase : um de urinio (rescgio dos cristais com UO7AC9), outro de_mereirio (reaegio com C(HigAc)4INHCH2CH2SH) © dois de qualidade inferior (com baixa ocupagio do metal) ; um de r6dio (veaegio com NagRhCig) ¢ outto de 30 Boletim de Biotecnologia Ssmio (reaegio vom Ky0s04) A interpretagdo destes derivados em termos da andlise das posigdes de substituigio dos dtomos pesados toi dificil (vd [4)), mas dada a indole este artigo, no. nos. alongaremos mais aqui nesse aspecto Uma vez imterpretados estes derivados, um primeiro célculo do mapa de densidade electr6nica permitiu-nos, apés aplicagio do método do “nivelamento’ do.__solvente", reconhecet as zonas que delimitam a proteina (1 molécula de tetrimero por unidade assimétriea- vd Figura 15-b, em que estio individvalizadas 2 das 4° unidades assimétricas) Nesta tase, a densidade electronica cra ainda de — muito dificil imterpretagio, apresentando poucos trogos continuos (Vd Figura 16-3) que sugerissem o eniolamento da cadeia polipeptidica Na medida em que se tratava de uma proteina tetramética, pode-se conseguir uma relhoria substancial da densidnde electrénica por aplicagio do método do ciloulo da densidade electeénica “média® das 4 subunidades equivalentes (Figura 16-5) Dada a ma qualidade do mapa de densidade lectiénica de que inicialmente se ispunha, este procedimento foi particularmente crucial no bom prosseguimento da determinagio estrututal © tragado € ajuste da cadeia polipeptidica foi muito guadual, tendo-se sempre altemnado ciclos de ajuste manual do modelo & densidade electrénica, com ciclos de refinamento € eéleulos da densidade “média” efectuados. iterativamente Nas fases fincis do. refinamento (factor R<25%) _ introduziram-se ‘adualmente moléculas de agua em posigées razoaveis, num total de 431 Além disso, foi identiticado um iio sulfate (proveniente da solugio de cristalizago) cuja localizagio foi particularmente importante para 2 idemtificagio do centro catalitico desta enzima (vd abaiso). O modelo final apresenta a estatistica de tefinamento resumida na Tabela 1, € corresponde 20 ——tetrdmero (subunidades ABCD) representado na Figura 20 Na Figua 21 evidencia-se 0 enrolamento de cada as posigbes Cade uma snokoala tetra de CSHase (obunidades A 8.C.D). vista a0 longo de um os 3 eivosbinstos adap de 1) subunidade individual, reconhecendo-se uma topotogia do tipo cep (semethante & topologia das Navodoxinas). Devido as diferengas de contactos entre subunidades, 0 telrdmero pode ser considerado como um dimero de dimeros: enquanto que centre as duas subunidades Ae B (‘epresentadas na metade superior da Figua 20) (ou C e D) existe uma ‘extensa frea de contacto (3527 A2) devida a cerca de 40 contacts por ponies de hidrogénio, 0 contacto entre os dimeros A-B e CD é mediado por apenas 6 pontes de hidrogénio (érens de contacto A-C € AD de 878 A? ¢ 718 A2 respectivamente) A molécula de CSHase_possui quatro centros activos situndos nas Figura 21. Representagio esquemstise da topologia de uma subanitide de CSHiase (adspindo de 4)interfaces dos dimeros compactos A- Boe CD Na Figura 22-3) representam-se as subunidades A-B com superticies sobrepostas, onde se podem evidenciar dois dos centros cataliticos da CSHase como cavidades internas, enquanto que na Figura 22-b) é feito um close-up de uma das cavidades (subunidade A), em que se ifustram os aspectos estruturais mais relevantes. Esta identificago do centro catalitico foi um resultado importante, eonsequéncia directa da andlise da estrutura (@ suportada por dados biogufmicos conhecidos) para o que se consideraram vitios aspectos: I- 0 centro activo foi identiticado numa cavidade interior onde se Jocalizaram uma molécula de io sulfato, bem como uma moléeula de igua; 2- Nessa mesma cavidade existe uma ligagio peptidica cis (Alal72-Trel73), 0 que é extiemamente raro (embora também pouco frequente, € mais comum a ocorréneia de ligagées peptiicas cis que envolvam prolinas) © est em eral associado a algum papel dessa zona no mecanismo eatalitico; 3- Uma das duas cistefnas da sequéncia primdria de aminoscidos, a Cis177, encontra-se também presente na mesma cavidade © perience a uma hélice-o envolvida em contactos da duns subunidades (A-B ou C-D) 0 io sulfatoestabelece —numerosas pontes de hidrogénio com cadeias laterais de residuos de amino-écidos, ais como ArgA202, LisB2I7 € TrpAS6, além de estabelecer alguns contactes com étomos da cadeia principal (vd Figura 22-b) © centro catalfico, assim presumivelmente identificado, possui {odas as caracteristicas para a ligagio especifien do substrato, Ne carbamoflsarcosina OQ nuclesfilo necessitio no processo catalitica & provavelmente a Cist77 (sabe-se que a enzima possui uma actividade maxima em condigdes bisicas, © que 6 inibida por reagentes que se unem cistefnas). Além disso, outros residues também —provavelmente envolvides na expecificidade catalitica desta enzima so a Arg202 17 de uma subunidade Figura 22. a) Repesentasdo de todos os stoma de um dinero (subenidages AB) de CSHase om superfices sobreposts. evdeaciande or dois cenlras asivor Tealizados na interlace Aimatien ) Close up da ewidade do cento sei estan repreentades 0s eotacos por Ponies de hdropénio ebelecidoe pelo io selito Biologia Estrutural vizinha, que deverio interactuar com © grupo carboxilato do substrato (por analogia com a molécula de igo sulfato, a qual substitutia, na estrutura analisada, a molécula de substtaio), orientando-o favoravelmente Os residuos AAlal72 e TrelT3 (ligagdo peptidica cis), devem também de algum modo paricipar no processo. cataltico sta tentativa de atribuigo de um rmecanismo eta contudo apenas. uma proposta, que foi tecentemente Confirmada auavés da andlise cristalogrifica de complexos da CSHase com inibidores [5], que permititam no 6 confirmar a identificagio do centro activo: mas também 0s aminodcidos essenciais envolvidos no mecanismo catalftico Os inibidores analisadas (écido HCOCOOH «, e suecinico- HCOCH2CH)COOH), _inactivam fnreversivelmente a enzima por ligagio covalente ao grupo tiolato da Cisi77Ambos 0s inibidores. formam ligagdes covalentes com a Cisi77 resultando em hemitioacetais Na Figura 23 esti representada a densidade electrénica © 0 modelo para o complexo resultante da reaegio de inibigao com 0 semialdeido succinico, estando evidenciadas as ponies de hidiogénio que o estabilizam (para © slioxalato, observe uma eoordenagio anéloga). De facto, a molécula de inibidor preenche a cavidade do centro activo, adoptando uma conformagio. —fortemente dobrada e, como fora proposto, 0 grupo carboxitato sponta para a “enirada” da cavidade, interactuando com a ArgA202 ¢ LisB217, bem como com a TreAI73 (da ligagdo peptidica cis) € 0 TrpAS6 O grupo hidroxilo do hemitioacetal faz uma ponte de hidrogénio com 0 AspAS! € ainda com o oxigénio do carbonito da AlnA172 (da ligagio peptiica cis). Além do papel dos diversos residuos do centio cataliico na ligagio especifica do substiato © portanto na catdlise, também a ligagio peptidica cis é importante © orienta 05 inibidores analisados: ‘enguanto a Trei73 coordena o grupo Boletim de Biotecnologia 31Biologia Estrutural Figura 23. a) Mapa de diferenga de Fourier do inibidor semvldefd suecinico (repressed ‘om itomos de H) ligado covalentemente & Cist77 do centro soive da ds subunidads A da CSHase (representa estereascpica) [5] b) Ligaydes por pontes de bidrogéaio do semialdeo suetnico no ceric cataitic (representa estereusedpen)5] carboxilato, 0 oxigénio do carbonito da AlnI72.“fixa” a outa extiemidade do inibider por ligagSes por pontes de hidiogénio com o gtupo hidroxilo do hemitioacetal Pode-se, deste modo, propor que a formagao de um hemiacetal entre 0 ‘grupo tiol do centro active € © grupo carbonilo do inibidor serviré de modelo formagio de um intermedidtio covalente durante a hidrélise da N-carbamoflsarcosina, possivelmente estabilizado pelos residuos da ligagio peptidica cis Apesar de uma andlise detathada do mecanismo molecular da reacgfio catalisada pela CSHase necessitar ainda de experiéncias adicionais, tanto cristalogratficas (por ex. de complexos CSHase-substrato), como bioquimicas, este exemplo ilustra 2 identificagio e estudo do centro ‘activo de uma enzima por téenicas ctistalogeaticas 32_Roletim de Biotecnologia 2.8, Oxidoredutase de aldeido (MOP) de D. gigas A oxidoredutase de aldeido isolada de D. gigas (MOP) € um homodimero de duas subunidades (2x907 aminodcidos). Cada subunidade contém um co-factor corginico associado a um stomo de molibéénio -molibdopterina (Moco)-, ‘bem como dois diferentes tipos de centros de (2Fe-25} Esta enzima ‘oxida aldefdos a dcidos carboxilicos (sem especificidade para a cadeia lateral), tendo sido caracterizada espectioscopicamente (EPR [6], Missbauer [7] € EXAFS [8]) ¢ bioquimicamente [9]. Estes estudos alertaram para uma homologia da MOP com a oxidase da xantina (XO) em termos do tipo de co-factores presentes Em 1992 foi iniciada a cristalizagao da MOP com vista & sua elucidagio estrutural em 1993, © respective gene foi clonado sequenciado [10] A comparagio da sequéneia priméria da MOP com as de quatro diferentes oxidases da antina revelou, de facto, uma homologia de 52% (© uma idemtidade de 266) (10}, apesar das XOs passuirem um dominio adicional que incorpora um grupo Aavinico, ausente na MOP Para a determinagio da estexura da MOP comegaram por se preparar monocristais, de inicio de ma Gualidade, mas que se puderam optimizar ¢ estabilizwr Os cristais tem a forma de bipirmides hhexagonais (vd Figura 6) de cor vermetha, ¢ diffactam até 20-18 A de resolugio (dependendo’ respectiva qualidade da optimizagdo de diversos factores experimentais) Pertencem a0 grupo espacial hexagonal P6,22, com constants da ula: acb= 144,5 A; o= 163.2 A: B=120°. A partir do conhecimento do volume da cfluia wnitiria © da massa molecular da proteina (© conhecimento da_—_-densidade experimental dos cristais) deduziu-se due existe um mondmero na unidade assiméuies, sendo 0 homodimero cima mencionado gerado por relagdes de simetsia eistalogréticn Tratando-se de uma estrutura nova, foi necessdrio preparar derivados de metal pesado, tendo sido usados um total de 12 no céleulo das fases que petmitiram cobter mapas de densidade elecuénica razoavelmente interpretiveis Uma ver que, como se viu, no caso destes cristais apenas existe 1 molécula por unidade assimétrica, ndo se pode bbeneficiar dos procedimentos de céleulo da densidade electrénica ‘média” na melhoria dos mapas Esta metodologia pode igualmente set aplicada no caso de se possuirem diversas formas cristalinas, © que também aqui ndo foi possivel- todos os ctistais bem —ordenados apresentavam simettia hexagonal idéntica! Assim sendo, a qualidade dos mapas de densidade electrénica obtidos pelo método MIR. foi melhorada apenas por "nivelamento do solvente". A construgiio doBiologia Estrutural modelo de 907 aminodcidos foi, como se pode compreender, um piocesso moroso e dificil, tanto mais, que 0s detivados de metal pesado eram de fiaen qualidade (pouca porcentagem de substituigiio do tomo pesado, _nfo-isomerfismo, ee) Nas fases inicinis. da determinagio da estrutura, fot possivel localizar os dois centios de (2Fe-25}, 0 que facilitou a imterpretagao dos cerca de 200 Primeitos aminoscidas Quando foi possivel agar cerca de 60% da cadeia polipeptidica (ainda com bastantes descontinuidades), iniciou se 0 cétculo da combinaglio das fases de MIR iniciais com as fases do modelo parcial © tragado completo da cadeia—polipeptidica foi progressivo € mo1oso, ¢ 56 nas fases finais da anilise foi possivel identificar © co-factor molibdopterina (Moco). No modelo completo e refinado, incluiram-se 449 moléculas de égua, além de ues ides magnésio (provenientes da solugtio de cristalizngio), dois dos quais estabelecem —_contactos eristalinos intermoleculares Foi igualmente possivet, nas fases finais do refinamento, identificar moléculas de isopropanol (também da solugio de cristalizagio), uma das quais particularmente importante devido & sua proximidade do centro de Mo (vd abaixoe Figura 28) A estatfstica do refinamento esté inclulda na Tabela 1 e na Figura 17-5, representa-se 0 diagrama de Ramachandran para a MOP, veriticando-se que, dos 907 residuos, apenas 6 esto fora das zonas cenergeticamente favoriveis, 5 dos quais estio prdximo dos co-factores, A. proteing possui uma boa estereoquimica e pequenos desvios dos pardmetros estruturais (vd Tabela 1) A determinagio da estrutura da MOP permitiu uma anilise detathada do auranjo 3D da protefna, bem como dos co-factores presentes, sua insergfo e localizagdo ‘na mattiz proteica Arranjo estrutural da proteina dos centros metalicos ‘A molécula da pioteina MOP globular, com um didmetro de ~75A, sendo uma estruturarica_em elementos de estrutura_ secundivia, ‘com 28% em conformagao helicoidal © 24% em conformagio de folhas-B A estrututa est organizada em 4 dominios (tepresentados em diferentes cores na Figura 24). O primeito dominio (vesiduos 1 a 76) & anélogo, ¢ patcialmente sobreponivel a0 da ferredoxina (2Fe-2S] de tipo planta, enquanto que o segundo dominio (residuos 84 a 157), que eoordena 0 segundo centro de Fe.S constiui um novo tipo de fenrolamento para fettedoxinas de (2Fe-25] - um feixe de 4 hélices com simetia de grav 2A este dominio, segue-se um longo segmeato gular, que o liga 20. primeiso grande dominio (Moco.1, residuos Figura 24, Represenigio esquermitica da topoogia da melécula de MOP evidenciando-se em Siferenes wows os 4 dominios Os co-actores metilios eso representadas por esferas unas 196 a 581) tesponsivel por parte da interacgo com 0 co-factor pterinico Este dominio tem uma topologia mista c.f e ,além de contibuir para a coordenagao (apenas por pontes de hidrogenio) do Moco, consitui parte «de um tnel que dé acesso, a pate do exterior, ao diomo de Mo (vd abaixo, Figura 26) O- dominio seguinte (Moco.2, residuos 582 a 907) forma também estruturas do tipo cB, onde se insere toda a parte inucteotidiea do co-factor Moco, bem como pane do sistema pletinico. Além disso, constiui a outta parte do tinel de acesso a0 Mo acima referido Em relagio a estrutua dos co: factores propriamente ditos, a boa qualidade dos mapas finais de densidade electrdnica finais permitiu uma anélise estrutural detathada dos rmesmos: ambos os centros de Fe,S possuem uma geometria tipica de centros [2Fe-2S], sendo 0 plano definido pelo sistema 2Fe-28 perpendicular 20 plano definido pelos 4 enxofres das cisteinas Em relagio A estrutura do co-factor molibdopterina, esta foi pala primeira vez comprovada através da presente anélise cristalogréfica, que demonstrou também tratar-se_neste ‘caso de uma variante dinicleotiica com citosina (os co-factores Moco podem estar associados ou nfo a formas dinucleotidicas, ¢ a diferentes tipos de bases, consoante a protefna e © o1ganismo) Existe uma vasta literatura {12] que tem deserito ‘estudos quimicos e espectroseépicos sobre derivados de molibdopterinas isoladas da XO e da oxidase do sulfito que descrevem uma estrutura do tipo 6-alquilpterina (Figura 25) A anilise cfectuada revela que © co factor molibdopterina possui_ um sistema biefelico _ptesinico condensado a um anel de pirano, resultando num sistema trciclico (0 facto dos derivados isotados terem uma cadeia lateral aberta em C6, pensa-se que pode resultar de teacgio de decomposigio, no process de exirusio do co-factor, enquanto que a ciclizago a pirano poder ocorrer in situ, por adigto nucleéfila do 09'20 carbono C7, Boletim de Biotecnologia 33Biologia Estrutural iz representados algumas _dessas op Figagdes mas, por questbes de claveza, omitiram’se as intracgSes que fixam toda a parte dinucletidica wm As com 05 stomos do dominio Moco_2, a - bem como um grande nimero de ° Sees pontes de hidiogénio do tipo NEE ds fue contibuem para a estabilizagio Cotctor Moco propasta dos centros Fe,$ Como se pode ver, fs centros. metficos. esto pois rellivamente pr6ximos (distancia Mo~Fe: -14 A; menor distinc Fe Fes_i}-FetFes.2y =12 Ay unidos por pontes de hidrozénio, 0 que permite delinear um petcurso pata a wansferénca de electtdes : Os aldefdos so oxidados 2 deidos carboxilicos no centro de Mo e os electiéesenvolvidos podem ser teansferidos staavés do. sistema prerinico parcialmente _conjugado pata © centro de Fe,S mais proximo (Fo,S_1), através de wma ponte de hidrogénio que liga 0 grupo amino N2 da pterina ao enxotre Sy da Cis39 A waasferéncia clectSnica pode entio continuar através de 7 JigagBes covalentes © uma ponte de hidrogénio entre a amida NH da AAlal36.¢ 0 grupo eatbonilo CO da Cis do cento de Fe,S exposto 20 solvente Daqu, os electrbes poderso entio fluir para um aceitador terminal deletes Se on / 2 N / a KV. Rojagopoton& JL Johnson, 1 Blo Chem 2621089 1992) a oxidoreductase de aldefdo de quadrangular (vd abaixo). (Chan, Mauna Kein, Adams & Res Since, 2671063 (1555) Considerando finalmente 0 centro de Mo™', a estrutura refinada O sistema ptetinico do Moco esté 2,25 A (11) e mais tecentemente a inserido no interior da proteina, mas 1.8 A. (resulados 50 publicados), acessivel através de um tunel de -15 permitiu identificar claramente uma Ade comprimento (Figura 26) Este pentacoordenacio do metal: 2 co-factor esti proximo do centro de tomes de eaxofre do ditileno cis e O sistema wicilco,é nfo plan, ferro Fe,S mais interna, também 3 ligandos de oxigénio. Destes 3, com um angulo de 40" entre 0 localizado a ~15 A da supeticie da dots sfo grupos oxo € 0 tereeiro una sistema biciclico plernico e o anel molécula, enquanto qie 0 segundo molécula de dgua coordenada, A de pirano, tendo a andlise da centro de ferro do N-terminal, & idenifieagio desta ultima fo} feta esirutura permitido ainda atribuir a bastante supetical, Todo o co-actor com base nas ineraegBes por pontes configuragio absoluta aos 3 ceatros Moco esid inserido ¢ estabilizado no de hidrogénio com cadeias laterais © Gquirais C6, C7 © C9’ como RLR,R_seio da. proteina por numerosas rmoléculas vizinas (vd. Figura 28) € © grupo ditoleno cis do anel' de inteacgtes por pontes de nas distincias Mo-O deduridas a pirano (posighes 7'e 8), coordena 0 hidrogénio Na Figura 27 estio partir de mapas de densidade 34 Boletim de BiotecnologiaBiologia Estrutural Figura 26 Repesringo das gor C, de mol de MOP com os co‘ ‘udnltns Un seal nentadapar oie! que ces a cen de molbdlo clecuSnica denis alla resolugio (8A) A. mokgcula de agua estabelece de facto numerosas pontes de hidrogénio, nomeadamente com 0 Ghi869 "eo grupo hidioxilo da rvolgeula de isopropancl que por sua ver estabiliza uma cadeia de tes moléculas de agua internas (Figura 28) Na base desta coracterizagio do eno calico podem-se fazer sugesies em relagdo 20 mecanismmo retocional: A dgua de coordenagio de taeto, 0 ligando do. Mo. mals acessivel ao substiato, a partir do ransferéncia electrénies entre of co-foctores nel de acesso do exterior e, portant, seré passivelmente a fonte _Conforme acima _mencionado, do giupo hidioxilo a ser transferido existe uma homologia em termos de no decurso da catilise Por outro comparagio das sequéncias, Jado, pode-se sugerir que a posigio —primsicias da MOP e da XO [10] do isopropanol constitua um modelo Uma vez conhecida a estrutura 3-D do complexo de Michaelis da da MOP verificou-se que essa eacgio com aldeidos, no qual, © homologia era__particularmente oxigénio do carbonilo ocuparia a clevada nos segmentos associados posigio do grupo OH do alcool ¢ 0 20s centros de [2Fe-2S], e a0 co- hidrogénio do aldefdo a posigdo de factor Moco, bem como nos residuos um dos grupos metilo (0 mais da cavidade do centio de Mo ¢ ppidximo do Mo) nalguns residuos que constituem 0 tinel Estes resultados vém Figura 28. Repseatagio do modslo no centro cataica da MOP. molfcula de fopropanal ‘Gribidor, moleeuas de gua interns e esiduos de aminedcidos mis impoctantes A densidade leawnica etd sobvepsia ap dslo apenas para o stomo de molibdéio © respestves Tigandos confirmar o facto da estrutura da MOP de D gigas constituir 0 primeiro exemple de uma estrutua de uma enzima pertencente & familfa das enzimas contendo 0 co-factor molibdopterina, do tipo das oxidases dda xantina De modo a poder explicar compreender melhor a coordenagio do metal bem como o seu papel na catdlise, este tabalho esti de momento a set prosseguido, Figura 27. Represenas3o dos co-fatorssinetilies da MOP e de iteacpBes por potes de hidegenio entre si ¢ com resivos prOximos As seias assralam 0 possivel eaminbo de estudando outras formas da enzima, nomeadamente formas reduzidas, sulfuradas e inibidas, numa tentativa de explicar —cristalograficamente dados bioguimicos —(actividade enzimética) e espectroscépicos, (estudos de EPR de espécies de MoV). Como objective ditimo, definir-se-4 9 mecanismo catalitico ddas enzimas de Mo da familia da XO. com base na estrutura 3D que se determinow Agradecimentos: ‘Agradego & Margarida Archer ¢ Jo20 Dias a leitura critica deste trabalho aos colegas do ITQB 0 apoio prestado. A Prof M. Teresa Duarte do IST agradeco sugestdes ¢ correcgSes pertinentes ¢ & Prof. M ‘Ondina Figueiredo da UNL, 0 seu auxilio nomesdamente na terminologia —de——_termos cristalogréficos em portugués Aos Profs. José Moura Isabel Moura da UNL agradego a colaboragio nas proteinas isoladas de Desulfovibrio ‘Ao Alois Zajc e Prot Robert Huber Boletim de Biotecnologia 35Biologia Estrutural agradego terem facultado os dados do complexo CSHasefinibidor antes de publicados Finalmente um. agradecimento 20 Dr Anténio Romero do CSIC e aos cclegas do MPI Biochemie em Mattinstied ¢ muito em especial 20 Prof. Robest Huber que me ensinou Cristalogiafia de Proteinas © me contagiou no seu fascinio por este ramo da Ciéncia Referéncias gerais TL, Blundell ¢ LN. Johnson (1976), “Protein Crystallography", A Press Ine , London J Drenth (1994). "Principles of Protein X-Ray Crystallography", Springer- Verlag, New York A Ducwix, R Giegi (1992) ‘Crystallization of Nucleic Acids and Proteins - A Practical Approach’, TRL Press . Oxford University Press, Oxford, UK UPGlusker e KN Trueblood (1985) ‘Ceystal Structure Analysis A primer Oxford University Press, New York DE MoRee (1993), "Practical Protein Crystallography", Academic Press inc , New York G_ Rhodes (1993), Crystallography Made Crystal Clear A Guide for Users fod Macromolecular Models”, Academic Press Inc, New York GH Sto e L_ Jensen (1989), "X-Ray Structure Determination A practical puide” John Wiley & Sons, Ine GE Schulz © RH Schirmer (1979), Principles of Protein Structure", Springer Verlag New York Inc Referéncias 1} C Kendrew. G Bodo, HM Dintzis, H Parrish, H Wyckoff e DC Phillips Nawre, 181, 662-666 (1958) 2.W L Broge 1915, Phil Trans Roy Soe (Landon) A 215:253-75 B.A. Romero, J Sanz-Aparicio. J Caldeira, I Moura, J LeGall, 3.1 G Moura © MJ Romso Eur J Biochemistry, em ienpressio 4.M.J Romfo. D Turk, FX Gomis- Ruth, R Huber, G Schumacher, H Mollering. L Russmann J Mot Biol , 226, 1411-1130 (1992) 36 Boletim de Biotecnologia 5.A Zajc, M J. Roméo, 8 Turk, R Huber 7 Mol Bio! submetido para publicaydo 6. C Bray.N A Tomer, LeGall, B AS Barala,J JG Moura, Biochem J 280, 817-820 (1991) 7.B AS Barata, J Liang, 1 Moura, J LeGall, 1. G Moura, BH Huynh, Eur J Biochem . 204, 773-778 (1992) 8.P Cramer, J JG Moura, AV: Xavier, J LeGall. J Inorg. Biochem 20,275 (1988) 9.B A S Barat. J LeGall, 156 Moura, Biochemistry 32, | 11559 1993) 10. U Thoenes, OL Flores, A Neves, B Devreese, JUV Beeumen, R Huber, MJ Romo, J LeGall, 33 G Moura eC Rodrigues-Pousada Eur J Biochem , 220, 901-910 (1994), LL.M I Romfo, M Archer, 1 Moura, J JG Moura, J LeGail, R Engh, M Schneider, P Hof, R Huber Science. 270, 1170-1176 (1995) 12, KV. Rajagopalan ACS. Symposia '535, 38 (1993), 13.M.K Chan, $ Mukund, A Klein, MWW Adams, D.C Rees, Science 267, 1483 (1995), Alguns termos usuais: ccélula unitéria ou célula elementar - menor unidade de um cristal que se repete amente em 3 dimensdes. E caracterizada por 3 vectores a,b © ¢, formando os lados de um paralelipipedo, e com anguios 0, Be yar: b%e, B:a%c, y:a%b) Unidade assiméttien - menor parte a estrutura cristalina a partir da qual se pode obter a estrutura completa por aplicagio de operagdes de simetrin A unidade assimétrica pode ser constituida por apenas parte da molécula (apenas no caso de rmoléculas pequenas), ou difetentes rmoléculas (subunidades) nfo felacionadas por simetria cristalogrética (caso -de _proteinas multiméricas) Factor de vibrato tunica B, =s11°{u}= 79{a2} > [u?} = vesvioquadrtico medio do ‘tomo em relagio 2 sua posigio de equilforio (se Bj=79 A¥, significa que 0 desvio médio do tomo j, devido & vibragio é de 1,0 A) elo d - A tesolugto obtida do de diftaccéo ¢ em geral expressa em termos do espagamento interplanar dyyiq = N20 mage comrespondendo 20s valoies de 20 miximos observados (por ex., para ReuKorhS418 A, 2mpax | =36 corresponde a uma resolueSo dyn = 5 Ay Grupo espacial - Grupo de operagbes de simeiria que permitem converter a unidade assimétrica num padrio infinito de repotigo regular Existem 230 grupos espaciais, os quais descrevem 230 modos distintos de empacotar objectos (moléculas) em tres dimensbes, de modo a que 0 contetido de uma célula unitéria seja igual ao das restantes (descritos nas Incernaiional — Tables for Crystallagraphy, Vol A, Theo Hahn ed, D Reidel Publco, 1983) No caso de moléculas biol6gicas, uma vez que sio-—_—moléculas ‘enantiomérficas, 0 nimero de possiveis grupos espaciais reduz-se a 65