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PRCTICA 5: ACCIN DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y

NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA


I. REACTIVOS A UTILIZAR
-

Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2

Succinato de sodio 0.1 M

Succinato de sodio 0.5 M

2 6 Diclorofenolindofenol

Malonato de sodio 0.1 M

Cloruro de mercurio

Homogenizado heptico 10 %

II. PROCEDIMIENTO
TUBOS
COMPONENTES (ml)
Buffer fosfato 0.1M pH 7.2
Succinato de sodio 0.1 M
Succinato de sodio 0.5 M
Cloruro de mercurio 0.1 M
Malonato de sodio 0.1 M
2 6 diclorofenolindofenol
Homogenizado 10 %

I
2.0
1.0
1.0

II
1.8
0.2
1.0
1.0

III
1.3
0.2
0.5
1.0
1.0

IV
1.3
0.2
0.5
1.0
1.0

V
1.0
0.5
0.5
1.0
1.0

Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.


Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).
COMPONENTES
Succinato de sodio 0.5 M
Buffer fosfato 0.1M pH 7.2

II
0.5

III
0.5
-

IV
0.5
-

Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados.

III. RESULTADOS
a) TUBO DE ENSAYO 01:
En este primer tubo encontramos buffer fosfato, el indicador (2,6diclorofenolindofenol) y la enzima, no llegamos a encontrar sustrato; por tanto no
se realiza la reaccin al no haber aporte de electrones. Por consiguiente obtenemos
el color azul.

b) TUBO DE

ENSAYO 02:

En el tubo II tenemos

buffer fosfato, sustrato, enzima

(deshidrogenasa

succnica) y el indicador. Por tanto si se

logra una reaccin cataltica ya que hay productos, hay liberacin de electrones y
esto lleva a que el indicador vare de color, haciendo que el color azul se decolore.

c) TUBO DE

ENSAYO 03:

En el tubo III adems

del buffer fosfato, sustrato, enzima e

indicador tambin

presenciamos un inhibidor

competitivo (malonato

de sodio). Por tanto este inhibidor

ocupara el lugar del sustrato y no se producira reaccin y quedara de color azul.

d) TUBO DE ENSAYO 04:


En el tubo IV tenemos buffer fosfato, sustrato, enzima e indicador, adems
presenciamos un inhibidor no competitivo (cloruro de mercurio). Por consiguiente
la presencia de este inhibidor no permitir que se lleve a cabo la reaccin quedando
de un color azul dicho tubo.

e) TUBO DE ENSAYO 05:

Se coloc succinato y malonato, ambos compitieron por unirse al sitio activo de la


deshidrogenasa succnica; sin embargo debido a que la concentracin de
succinato(sustrato) fue un poco mayor que la del malonato (inhibidor), la reaccin
cataltica pudo llevarse a cabo pero no de forma completa. Esto pudo evidenciarse
en la coloracin azulada que an posea la parte superior de la muestra.

Utilizamos los tubos II, III y IV para ver lo que ocurre luego de agregarle ciertas sustancias:
a) TUBO DE ENSAYO 02:
Este tubo se mantiene igual que en el sistema anterior, y nos va a servir como tubo
control para poder compararlo con las dems reacciones.

b) TUBO DE ENSAYO 03:


En el siguiente tubo en un inici se detuvo la reaccin por medio de un inhibidor
(malonato de sodio) que va a actuar de manera reversible, ya que al agregarle ms
sustrato al sistema, este inhibidor fue desplazado y la reaccin continu su ritmo.
Por tanto nos indica que el inhibidor usado vendra a ser competitivo.
Nos damos cuenta de esto ya que el indicador nos demuestra una variacin en el
color, hacindose ms claro.

c) TUBO DE ENSAYO 04:


En el tubo IV se hizo uso de un inhibidor (cloruro de mercurio), en este tubo a
pesar de que se le agreg mayor cantidad de sustrato no pudimos hacer que la
reaccin contine, por lo que concluimos que se tratara de un inhibidor no
competitivo al ser irreversible dicha paso.

IV. DISCUSIN:
En esta prctica identificamos que el sustrato vendra a ser el succinato de sodio, la enzima es el
homogenizado deshidrogenasa succnica y los inhibidores lo conformaran el cloruro de mercurio
(inhibidor no competitivo) y el malonato de sodio (inhibidor competitivo). Tambin hacemos uso de
un indicador redox que estara representado por el 2,6-diclorofenolindofenol, que en estado oxidado
es de color azul oscuro.

Cuando el 2,6-diclorofenolindofenol participa en un estado redox se observara un cambio de color


si es que hay reaccin; si es que no, la coloracin azul se mantendra. Estos cambios de color nos
ayuda a determinar cuando una reaccin se realiz y cuando se interrumpi por inhibidores.
V. CONCLUSIONES:
Se demostr que en el sistema enzimtica deshidrogenasa succnica, el malonato de sodio y el
cloruro de mercurio actan como inhibidores para que dicha reaccin se detenga de manera parcial
o total.
El malonato de sodio viene a ser un inhibidor competitivo y el cloruro de mercurio es un inhibidor
no competitivo.

VI. CUESTIONARIO
1. Por qu el malonato es inhibidor competitivo?
El malonato es un inhibidor competitivo porque compite con el succinato por unirse al sitio
cataltico de la deshidrogenasa succnica.Tanto el succinato como el malonato pueden unirse
al sitio activo de la deshidrogenasa succnica por tener estructuras qumicas semejantes,
formando un complejo ES o EI. Sin embargo, dado que el malonato slo contiene un carbono
alfa, no puede deshidrogenarse y por lo tanto impide la formacin de producto.

2. Por qu el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo?


El cloruro de mercurio es un inhibidor no competitivo porque no compite con el sustrato(en
este caso succinato) por unirse a la enzima deshidrogenasa succnica. Este inhibidor presenta
una estructura poco parecida a la del succinato, en consecuencia se une a una parte de la
enzima diferente al sitio cataltico.

3. Cmo podra usted demostrar que la inhibicin producida por el cloruro de


mercurio es o no reversible?
Se podra demostrar que el cloruro de mercurio es un inhibidor reversible si ste se elimina
del medio por dilisis o simple dilucin.

4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibicin


competitiva en el sistema Deshidrogenasa succnica-succinato, adems de
malonato utilizado en el presente experimento.
Existen sustancias parecidas al succinato que pueden combinarse con la deshidrogenasa
succnica como:
Glutamato
Oxalato
Oxalacetato
4-aminobenzoato
4-aminobencenosulfonamida

5. Seale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibicin
no competitiva reversible, sin considerar el cloruro de mercurio.
Cianuro: Inhibe a la citocromo oxidadsa
Fluoruro: Remueve iones Magnesio y Manganeso inhibiendo a la enzima enolasa y
consecuentemente a la gluclisis.
Idoacetato: Inhibe a las enzimas que tengan grupos SH- en sus centros activos.

6. Qu diferencias puede usted establecer entre la inhibicin competitiva y la


inhibicin alostrica?

TIPOS
CRITERIOS

INHIBICIN

INHIBICIN

COMPETITIVA

ALOSTRICA

Sitio

Lugar de unin
Estructura

cataltico

la Sitio

alostrico

de

la

enzima

enzima

Similar a la del sustrato

Poca o ninguna similitud

Provoca cese de la Aumento


inhibicin

de

de

con el sustrato
la Disminucin

concentracin de sustrato

concentracin

de

la
del

producto final

7. D por lo menos dos semejanzas entre la inhibicin no competitiva reversible e


inhibicin alostrica.

Poca o ninguna similitud estructural con el sustrato


Unin a un lugar diferente al sitio cataltico
Unin es reversible y no covalente
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA. Harper Bioqumica

Ilustrada. 29 Edicin. Mxico: Editorial McGraw-Hill; 2012.


Nelson DL, Cox MM. Principios de Bioqumica. 6ta ed. Barcelona: Editorial Omega; 2013.