articulos PRODUCCION DE ENZIMAS POR Aspergillus Gustavo Viniegra Gonzalez Universidad Autonoma Metropolitana-Iztapalapa, Departamento de Biotecnologia, C.P. 09340, Apdo. Postal 55-535, México, D.F. Fax: (55) 5804 6407 Email: vini@xanum.uam.mx Resumen Se presenta una revision del avance y potencial que tiene el uso de los hongos microscépicos del género Aspergillus para la produccién industrial de muy diversas enzimas. Con un volumen de ventas superior a los mil millones de délares anuales, principalmente como materias primas para la industria de la alimentacién. Los Aspergilli pueden producit una gran variedad de enzimas, tanto propias de este género, como de enzimas heterdiogas generadas por técnicas de Ingenieria genética, Se comparan las diferencias de rendimiento y fisiologia de la produccién de las enzimas entre la técnica usual de cultivos sumergidos y la técnica alternativa con substratos sélidos y para ello se discuten y analizan los conceptos basicos de evaluacién del rendimiento celular y de los productos microbianos. Finalmente, se comenta que las grandes empresas de fermentacion han logrado obtener titulos enzimétticos alrededor de los 10 g/L, los cuales, son muy superiores a los niveles usuales de las cepas encontradas en le Neturaleza (10 @ 100 mgiL). Estos titulos requieren de importantes esfuerzos para mejorar las cepas silvestres, ya sea mediante procedimientos automatizados con robots, 0 mediante provesos intensivos en mano de obra ealificada, Abstract This review deals with recent advances and the potential of using microscopic fungi such as those belonging to the genus Aspergillus for the industrial production of enzymes. The global enzyme merket has the dimensions of more then a billion dollars per year, mostly in terms of enzymes used in bulk in food industries. Aspegilli are able to produce a great variety of industrial enzymes, both in a natural way and also by means of genetic engineering, as heterologous proteins. A comparison is made between the conventional technique of submerged fermentation and the alternative technique of solid substrate fermentation. In order to do such a ‘comparison, a review Is made of the current concepts of enzyme yield and physiology of enzyme production Finally, @ comment is made on the fact that large fermentation enterprises are able to produce enzyme titers of the order of 10 g/L, which are many times higher than natural titers found in Nature (10 to 100 mg/L}. To reach such high titers of enzymes it is necessary to have Important investments in the automation of strain screening or the intensive use of qualified labor. Introduccién. La produccion anual de enzimas tuvo, en 1998, ventas mundiales estimadas en 1,300 millones de dolares y se ha estimado que se duplicara para 2009 (vease hitip-iveww.biocatalysts.com). Este mercado esta compuesto de enzimas de bajo precio, y gran volumen, para ser usado en industrias que producen: Detergentes, textiles, azicares de malz, y queses (Véase Tablas | y Il). Y los organismos més utllizados para la produccién de enzimas son los hongos filamentosos pertenecientes a los géneros: Aspergillus, Penicillium y Fusarium porque tienen la capacidad de crecer con rapidez, excretar gran nimero de enzimas y, su biomasa en forma de micelio, puede separarse con facilidad de los caldos de cultivo. 18 BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2ar ticulos Tabla! Estructura del mercado de las enzimas, por ramo industrial Industria Ventas (106 $ US) Detergentes 300 ‘Almidén 125 Lechera 80 Textil 60 Alcohol 45 ‘Olras 110 TOTAL 720 Datos de Novo Nordisk (1980) Tabla Il Consumo anual de las principales enzimas de uso industrial Enzima ‘Consumo (106 Ton) _ Proteasas™ = 309 Cugio (animal y microbiano) 74 Glucosa isomerasa 4a Glucoamilasa A Armilasa (diferente a las glucoamilasas) 112 Colulasa 55 Lipasa "1 Papaina 8 Invertasa 8 Pectinasa 7 Otras 20 “Se excluyen el cuajo y la papaina.Datos de Novo Nordisk (1990) En fechas recientes, se ha demostrado que es posible transformar a los Aspergillus usando {écnicas de biologia molecular para que produzcan enzimas originalmente producidas por organismos muy diversos Ward, 1989). Por ejemplo: investigadores de la empresa Genencor, ha indicado la factibiidad de producir la enzima llamada quimosina (Ward, 1991), que proviene de los becerros y se usa para cusjar la leche en la manufectura del queso, mediante la clonacién de su gen (del becerro) y de su expresién por Aspergillus awamori. De esa forma, se pudo incrementar la oferta de quimosina sin tener en cuenta las BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2 limitaciones de la oferta de becerros en los mataderos, pues ahora esta enzima, se produce en grandes tanques, usando las técnicas de la fermentacién industrial. Este ejemplo ha dado lugar @ otros, como es la produccién de la enzime lacasa termo tolerante, proveniente de Myceliophtera thermophila, transferida @ una cepa industrial de Aspergillus oryzae y propiedad de le empresa Novo Nordisk (Berka et al., 1997), la produccion de amilasa de trigo por Aspergillus niger (Juge; et &l., 1998), la produccién de celulasa de Trichoderma riseii expresada por Aspergillus oryzae. (Takashima ‘et al., 1998), la produccién de lacto ferrtina humana 19por Aspergillus oryzae (Ward et al., 1992) y de lisozima humana por Aspergillus oryzae (Tsuchiys, et al,, 1992). Todo esto, sugiere que pronto habré enzimas muy veriades producidas, en forma transgénica, por Aspergillus, aunque ain quedan humerosos problemas técnicos por resolverse (Weenes et al, 1991; Archer 1904; Archer y Peberdy, 1997). De ahi Ia importancia de entender y aprovechar la capacidad productora de enzimas de estos organismos. Cabe sofialarse que hay dos grandes ‘técnicas 0 procedimientos para producir enzimas de corigen microbiano: ta fermentacion sumergida (FSm) comentada por Finkelstein (1987) y Blain (1975) y la fermentacion sobre sustrato sélido (FSS) comentada por diversos_—_ autores (Shankaranand et al. 1992, Viniegra-Gonzélez, 1998, Pandey et al, 1999). La primera técnica es ta mas utlizeda (Blain, 1975) por las grandes ‘empresas industrials, pero algunas empresas medianas © pequefias utilizan la segunda técnica de fermentacién para producit enzimas (Viniegra- Gonzélez y Favola-Torres, 2002). Aspectos generales del género Aspergillus y su ciclo de vida. Los Aspergillus son hongos pertenecientes 2 la division Deuteromycota, que corresponde a los hhongos filamentosos a los cuales no se les conoce una forma sexuada para su reproducoién. Por ejemplo: Aspergillus nidulans pas6 a ser Emericella nidulans cuando se le conocié su forma sexuada. Los Aspergillus pertenecen a la clase, Hyphomycetes, que son los hongos que forman micelios pero carecen de esporocarpio. Y en particular, el género Aspergillus se caracteriza por tener conididforos con las esporas organizadas en rosarios largos que tienen un arreglo similar a una regadera o aspersor, de ali su nombre. Aspergillus niger, es la especie mas abundante en la naturaleza, Se encuentra destruyendo los alimentos y materiales vegetales articulos de facil fermentacién, es decir, los que contionen cantidades apreciables de azicares, almidones 0 gomas. Su micalio produce esporas negras que le dan su nombre. Y es muy usado en la industria de fermentaci6n para producir amilasas 0 acido citrico. Aspergillus oryzae, fue aislado sobre el erroz y ha sido muy empleado, junto con A. awamori, pare producir amilasas y proteasas en las fermentaciones tradicionales del Asia Oriental (China, Corea, Japén). EI cultivo de estos hongos sobre arroz cocide al vapor, se llama koji (Hesseltine y Wang, 1979). Y es la materia prima para la transformacion del arroz cocido en azicares para producir el vino de arroz, llamado en Japén, ‘sake. © para producir los hidrolizados de pasta de soya cocida, llamados miso, que son muy utlizados para producir sopas vegotarianas con sabor a caldo de pollo, Estas tres especies son las mas empleadas para producir enzimas porque no producen toxinas como las aflatoxinas, que son caracteristicas de los cultivos de A. parasiticus, o de A. flavus (Hara et al., 1974; Yu et al, 1995). Las affatoxinas son compuestos cancerigenos muy potentes cuya tolerancia en los granos alimentarios debe ser menor a 10 mg por tonelada (ppb) Afortunadamente, estas especies patogenicas pueden distinguirse de las no toxicogénicas, debido ‘a que tlenen un color verduzeo muy caracteristico y porque es relativamente facil medir la presencia de aflatoxinas, usando técnicas_inmunolégicas disponibles en los laboratorios especializados para 61 control de los alimentos. El ciclo biolégica de Aspergillus comprende la germinacién, a partir de esporas, el crecimiento miceliar, es decir como Arboles microscépicos ramiiicados, y, la esporulacién, que incluye la formacion de micelio aérea que son la base de las estructuras llemadas conidiéforos, de las cuales se desprenden las fialides 0 racimos de esporas. Muchas de las enzimas industriales producidas por Aspergillus estén asociadas a la produccién del migelio, durante la fase llamada, vegetativa 20 BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2Cinética del crecimiento miceliar de Aspergillus La fase vegetativa, se caractoriza por un crecimiento exponencial de la biomasa, pues, al ramificarse el micelio, se dobla la cantidad de las untas del micelio que es por donde se produce et crecimiento de la biomasa. La relacion entre la Guplicacién del nimero de puntas y la velocidad det crecimiento vegelativo ha sido descrita en detalle por Trine! (1971, 1974), Carlsen et al., (1996), Viniegra-Gonzalez et al., (1993) y Larralde-Corona et al, (1997). Durante esta fase, la cinélica del crecimiento puede ser representada por la ecuacion logistica a x x1 de em ( #5) a Dende, X, es la concentracion de la biomasa (gIL si es en tiquido, y gicm?, si es en superficie), Xrme €8 J@ maxima concentracién de blomasa posible, en las condiciones patticulares de cada Cultivo. Y, Umm €8 la maxima velocidad especttica de crecimiento, cuando el cultivo no esté limitado por algin nutriente, y cuando, 0 < X << Xm Larralde-Corona et al., (1997) demostraron que, para cultivos de A. niger, en superficie, el valor de, nex puede calcularse a partir de la siguiente ‘ecuacion: In2 2) w(%,) En la cual, Up @s la velocidad de crecimiento apical medida por la extensién de! micelio en placa; Law @8 la longitud media de las hifas medida, en el borde de las colonias; Dy, es el dimetro de tas hifas. Carisen et al., (1996) encontraron que la frecuencia de ramificaci6n,®, proporcional a la articulos velocidad, & < Hos, €8 8 Su vez, inversamente proporcional a ta longitud (© <« ‘1/Lgss), 10 cual equivaldria a la relacién, Hote % UWdLay, (ecuacion 6) previamente descrita por Trinci (1971, 1974). Una posible interpretacion de estas diferencias se podria, hacer en funcién de una expresién general para la frecuencia de ramificacién, calculada a partir del inverso del tiempo, t, que tarda una hifa en alcanzar la distancia critica, Lo, después de la cual se ramifica. Esta funci6n se deriva de la ecuacién empirica de ta elongacion de las hifas individusles (ecuacion 3) demostrada por Trinci (1974) y corroborada por Carlsen et al., (1996) y Larralde- Corona et al., (1997) aK, +E @) AA integrarse la ecuacién 3, por separacion de variables, y haciendo relacién Sfeli/ Do ‘2, se obliene la siguiente Por lo tanto, la expresin para la frecuencia de ramificacién resulta en la ecuacion § ©) Cuando, L, >> 10K, >> Le, ¥ recordando que, InflcfLe] < 10, porque Lo =-4 um y Le = 10° um, se puede aproximar el valor de, 4, por la funcion propuesta por Trinci (1973) y comoborada por Carisen et al. (1996) y Spohr et al. (1998) en ta ecuacion 6 BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2 a©) Por Io tanto, la aproximacion que se utllice en cada cultive dependeré del valor relative entre ta constante de saturacién, Ki; y la longitud critica, Le, lo cual, @ su vez, dependera de las condiciones de cultivo y de la ceps utilizada. Este razonamiento sugiere que la expresion mas general, derivads por Larralde-Corona et al., (1997), debe ajustarse a las condiciones patticulares de cada cultivo de Aspergillus, si se quiere obtener un modelo que relacione la velocidad de crecimiento, [sys con la morfometria del micetio. Este anélisis puede ser de interés cuando se quiere evaluar la fisiologia del crecimiento de colonias de Aspergillus, crecidas en caja. Por ejemplo, Loera y Viniegra-Gonzalez (1998) utlizaron este metodo para evaluar, en cajas Petr la potencia de mutantes de A. niger productoras de pectinasas. Carisen, ot al., (1996) y Bocking et al. (1998) también han utiizado esta metodologia para evaluar la produccién de amilasas heterdlogas, producidas por cepas transformadas de A. oryzae, ‘en cultivos sumergidos. Cinética de la produccién de enzimas por Aspergillus La cinética del crecimiento de los micelios se puede ligar a la cinética de produccién de las enzimas, vistas como producto P, por la ecuacién de Luedeking y Piret (1959) que se muestra a continuacion ary, a pp aX 7 Et a a) 22. articulos Esta ecuacion tiene dos términos del lado deracho: uno ligado al crecimiento con ol coeficiente, Yrx (QE/GX), y otro, no ligado al crecimiento, sino a la presencia de la biomasa, X, ‘con un coeficiente que aqui se denomina, k (aE/aX h) y que puede ser positive (produccién secundaria do la enzima), cero (cuando la enzima sélo se produce cuando el micolio crece) 0 negativo (cuando la enzima se destruye durante su Produccién). La solucién de la ecuacin de Luedeking y Piret combinads con Ia logistica, se puede obtener dividiendo una entre la otra y permite expresar la formacion del producto, P; en funcion de fa biomasa, X, como sigue PO =P, yy AX-X) Mi { Monte) ® Las condiciones iniciales del problema (t = 0) corresponden a, Xa y Po, Esta ecuacion permite interprotar al grafico de fases, P vs. X, segin se iustra en fa Fig. 1. Cuando, k = 0, se-obtiene una recta. Cuando, -1 < v= k/Ypxttnac < 0, se obtiene una curva con méximo cuando X = Xen(t *¥) y cuando k > 0, se obtiene una curva céncava. Los resultados mostrados en la Fig. 1, corresponden a le produccién de la enzima inverlasa por una cepa silvestre, lsmade C28625, de A. niger segiin datos de Romero-Gomez et al. (2000) y muestran ol efecto det nivel de azticar sobre la producsién de festa enzima en cultivos sumergidos (FSm) 0 sobre substrato sdlido (FSS). El analsis de es0s datos con tres cepas de A. niger mostré que el cultivo FSS tuvo mas produccién de invertasa, que el de FSm, principaimente porque se produjo mas biomiasa en el primer caso que en et segundo. BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2articulos 1500 4000 P(uil) 500 0 oo = 02 o4 06 os 1.0 B=XK y b 6000 Puig 2000 4 EEX yy 06 08 10 Figura 1. Correlaciones entre la formacién de producto (P invertasa) y la formacién de biomasa en unidades relativas (x XIXqox) d& Aspergillus niger. La Fig. 1a coresponde a experimentos realizados por FSm y la Fig. 1b, a los realizados por FSS. Se utlizaron distintos niveles iniciales de sacarosa, So (g/L) = 6.25 (0), 12.50 (4), 25.00 (+), 50.00 (Q), 100.00 (0). Las lineas continuas corresponden a los valores calculados por la ecuacién (8) BioTecnologia 2003 Vol. La Fig. 2, muesira el rendimiento de la biomasa, estimado por la pendiente de la correlacion, Xmax VS. So, donde, So, 5 la concentracién inicial de sacarosa, fen funcién del volumen del caldo de cultivo. En el caso de FSm, la funcién resulté de tipo hiperbélico, y en el caso de FSS fue una recta, para ol intervalo, 0 < Sp < 100 g/L. Esto sugiere que en FSS, no parece haber limitacién por oxigeno, ‘como Io hay en medio liquide, cuando la DBO es mucho mayor a 10 gil. Viniegra- Gonzélez et al. (2002) han interpretado este resultado como debido a que en FSS, ol micelio de A, niger crece como una capa, expuesta al aire por el haz y el envés y de espesor, h < 400 um, En cambio, en medio liquido, crece on pelotitas de diametro d > 1,000 ym. Pirt (1975) y recientemente, Carlsen et al. (1996) han demostrado que el espesor de la capa activa de micelio esta en el intervalo, 200 um < L < 350 um, y como las pelotitas del micelio crecido por FSm tienen didmetros de mas de un milimetro, cerca del 50% de la blomasa esta limitada por oxigeno. Para estimar el grosor de esa capa se requiere considerar que ta concentracién local de oxigeno, dentro del micelio, es la ‘combinacién de su consumo biolégico y de su lenta difusion en el agua, lo cual, produce un gradiente que sigue la siguiente ecuacion. (x) = Colt = HL?CA-XIL) @) Donde, Lb = [2DoColaspl", corresponde a la distancia para la cual se 8 No.2 23agota el oxigeno, calculada en funcion de la constante de difusion del oxigeno en agua, Daz = 5x10 cm’s", la concentracién maxima de! oxigeno fen agua, Cy = 5x10° gl, a la maxime velocidad de consumo especitice de oxigeno, qs = (Hmy/¥xs) =2.2 x 10 gS gX" S41, correspondiente 2 nex = OS" y Yus = 0.4 gXigS, y ala maxima densidad de los sélides de la biomase cultivada sobre superficie, p = 0.01 gom’, (Larraide-Corona et al., 1997). Estos datos permiten estimar que L = 150 um. Lo cual es del mismo orden de magnitud que ol espesor do la capa aerdbica de Aspergillus estimada por Pirt (1975) y por arisen et al, (1996), Por lo tanto, una de as limitaciones importantes de los cultivos de Aspergillus es su tendencia a formar agregados miceliares densos que limitan el acceso al oxigeno. Y para ello se pueden utlizar cuatro enfoques de cultivo: a) Elcultivo agitado convencional de tipo FSm, que permite romper las pelotitas, aunque puede causar dari mecénico a las células, 20 4 Xu (iL 10 o> articulos ») ©) El cultivo de tipo FSm con aditives (pH < 5, espesantes) que dificulten la formacién de pelotitas, pero que dan lugar a suspensiones de micelio con propiedades reolégicas que 100,000 Ullg. Las cepas silvestres, generalmente, tienen valores de, Ypx, cien veces menor al requerido por la industria, Esto muestra que un programa de mojoramiento de copas para uso comercial, debe buscar aumentos de, Ypx, en al menos dos ordenes de magnitud de los niveles encontrados en la Naturaleza. Este objetivo se logra mediante programas de mejoramiento genético por mutaciones al azar. El cual requiere del aistamiento, de cientos de miles © millones de mutantes, evaluadas por medios visuales y microquimicos, Para lograr ese objetivo, las empresas europeas y Nortoamericanas usan técnices automelizadas de siembra y evaluacién fotométrica de mutantes, mediante reacciones coloridas con el substrate. En los paises en desarrollo como China, se sigue la técnica convencional de siembra y evaluacién manual. Por ejemplo: se tiene noticia de un programa de mejoramiento genético de Giberella fujkuroi, desarrollada por una empresa china que femple6 @ cerca de 50 personas por cinco afos, para obtener un rendimiento superior a 2 g/l. del metabolito secunderio. En cambio, Genencor, ha descrito el uso de aulématas electrénicos para mejorar la produccién de quimosina heteréloga expresada por Aspergillus awamori desarrollada por robots en menos de un af, La gran mayoria de los articulos de interés basico para el mejoramiento de las copas de 26 BioTecnologia 2008 Vol. 8 No. 2Aspergillus, logran aumentos de solamente tun orden de magnitud sobre el nivel de las cepas silvesires. Por tanto, existe una brecha entre los resultados de interés académico y los industriales que debe hacerse notar. Por ejemplo: Kim et al., (1997) indican que obtuvieron una cepa de A. niger ue produjo colulasa recombinante con Yex = 370 Ulig. Bocking et al. (1999) indican para gluco amilasa y alfa-amilasa, heterdlogas producida por Aspergillus oryzae, You = 0.24 GEIGX y Lin et al., (1993) obtuvieron, Ce = 570 mg/L, con Yue = 81 mg/g y X = 7 g/L. En cambio, Mayer et al. (1999) han desarrollado para la empresa Hoffman La Roche, un sistema de produccion de fitasa por la levadura Hansenula polymorpha con niveles Ce = 13.5 gil. que ha llegado hasta el volumen de 2,000 L. Y se tienen noticias de niveles de gluco amilasa| con Ce = 20 gi. Obviamente, los procedimientos desarrollados por las empresas son guardados celosamente para mantener su ventaja comercial Pero, es inevitable que muchos de esos procedimientos se tendran que volver del dominio PUblico, conforme avancen los conocimientos derivados del desciframiento de los gonomas y se conezcan, poco a poco, todos los circuitos de regulacion de la sintesis de las proteinas. Conclusiones Esta breve revision indica el gran potencial que tiene Ia produccién de enzimes de uso industrial por diversas especies del genero Aspergillus. Muestra que la ingenieria genética esté revolucionando el concepto fundamental sobre el uso de la biodiversidad genétics. Cada vez, se buscaran mas genes de enzimas de uso industrial, fen plantas, animales, hongos y toda clase de microorganismos. Y al transferirse a organismos domesticados y mejorados como los dal género Aspergillus se tendran métodos generales para la produccion de gran variedad de catalizadores que articulos modificarén muchos procesos industriales, Como siempre, quien sabe més, gana mas, Y sobre todo, quien se organiza para aprovechar el conocimiento tiene a ventaja en esta etapa del desarrollo. econémico dominada por el conocimiento. Si los pases llamados ‘meg diversos, como México, quieren aprovechar su riqueza potencial de enzimas naturales, tendrén que organizarse en institutes, universidades y ‘empresas que puedan transferir los genes de interés comercial para producirios con organismos domesticados como aqui lo hemos deserito, De otra forma, seguiremos observando impatentes, como otros paises se siguen beneficiando de la enorme: diversidad biolégica de nuestro territorio. Una etapa inicial seria, dejar de vender u ofrecer colectas de corganismos silvestres y empezar a clonar genes, para vender su informacion genética previamente protegida de acuerdo = los _convenios intemacionales vigentos. Mas adelante, se podria intentar el desarrollo de procedimientos de mejoramiento genético para tener cepas de Aspergillus con rendimientos de nivel comercial, Bil gratia Archer DB (1994) Enzyme production by recombinant Aspergillus. Bioprocess. 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