Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas.

Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri
dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah
dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling
banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui
morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau
metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel
mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian
gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan
ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan
menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur,
warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies
bakterinya. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan
bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi
bakteri

Pembhasan

Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan

morfologi pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang
dikerjakan

di

laboratorium

mikrobiologi

untuk

kepentingan

identifikasi

mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang

khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi
awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri

sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang
disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus
dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh
mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini
dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan
alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek.
Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri
tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila
kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan
mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api.
Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga
olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan
dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala
api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue)
sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk
mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi
kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium.

Gram B

merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat
warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan
mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan
mordan, zat warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan
selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka
pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue
dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap
mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga

berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan
menyebabkan

pori-pori

sel

membesar

sehingga

meningkatkan

daya

larut

persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama
atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan
pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan
diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna
pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding
sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri
berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur
dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat
pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay,
1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah.
Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna
mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat
primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan
gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi
lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada
bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak
dapat masuk sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Dwidjoseputro, 1994).