BITACORA Cuantificaci6n de proteinas: una revisi6n Humberto Garefa Arellano y Rafael Vazquez Duhalt Instituto de Biotecnologia UNAM Apartado postal 510-8, 62250, Cuernavaca, Morelos. México Introduccién in duda alguna una de las determinaciones S més usadas en biotecnologia es la cuantificacién de proteinas. Estimar la concentracién de proteina es necesario no solo en los laboratorios de investigacién, sino también en la industria alimenticia, farmacéutica y biotecnolégica en general. Existen muchos métodos para la determinacién de protefnas (Tabla 1). El antiguo método de Kjeldahl se basa en la determinacién del nitrogeno total de la muestra. Las proteinas son digeridas en un medio écido y el nitrégeno total determinado portitulacién. Existen otros métodos ‘muy sencillos y poco especificos, como la ab- sorbancia de las soluciones de proteina en laregién de laradiaci6n ultravioleta. Los enlaces peptidicos absorben a205-210 nm, mientras que los triptofanos y tirosinas Io hacen a 280 nm. Los coeficientes de extincién varian de acuerdo a la proteina, asf, para Ja albtimina de suero bovino el coeficiente de extincién a 280 nm es "*é;45 = 6.3, mientras que para la inmunoglobulina de ratn ™é,,. = 13.8. Aunado a este problema, muchas sustancias no proteicas absorben fuertemente en a region del ultra- violeta, produciendo grandes interferencias. Este es el caso de los Acidos nucleicos. El uso del método adecuado depende de cinco critetios: 1) la cantidad total de protefna presente en lamuestra, 2) la concentracién de la proteina, 3) la especificidad del método, 4) la presencia de otras sustancias que pudieran interferir y 5)la facilidad y reproducibilidad del método. En el presente trabajo se describen detalladamente algunos métodos para la cuantificacién de proteinas. Cuantificacién de proteina por el método de Lowry? ‘Laccuantificacién de proteina con cobre y elreactivo Folinesun método sensible que no requiere digestion previa. Es mucho mis sensible y especifica que laTabla 1. Comparacién de reactivos para detectar y ewantificar proteinas en solucién! ‘Mecanismo de accién Notas de aplicacion ‘Se une a deiergentes en Ta | Alla Sensibilidad. Varia- Ensayo 485/590 | 10ngimla10 | superficie de las proteinas y a | cién proteina a proteina Nano g/ml regiones hidrofobieas de las | minima. Bnsayo rapido y Orange proteinas; el colorante no | preciso con un tnico Feaccionante no presenta | ensayo. Compatible con fluorescencia. agentes reduetores Ensayo de Reacciona directamente con | Gran variacién protein a Bradford 59s tugimi ats | aminodcidos especificos y | proteina. No compatible (Azal mgmt estucturas terciarias de ia | con detergentes. Ensayo brillante de proteins: el colorante cambia | répido. Util cuando la Coomasie) decafé a azul precision noes. muy importante = — EY Cu" es reducido a Cu en | Compatible con deters Método presencia de proteinas a pH | gentes, cabtrofos BCA 362 05 ug/miai.2 | clevado; el acido bieinco; | solventes orginicos. No (Acido mel 0 quela a iones de Cu’ | compatible con agentes Bicinconinie formando complejos color | reductores. Las muestras co) parpura, eben ser ieidas dentro de lun intervato de 10 min. Ensayo de EY Cu" es reducido a Cu en Lowry 750 1ugimiat.s | presencia de proteinas a pl! | Procedimiento lento. No (Reactivos, mela levado; el reactivo Biuret | compatible con deter- Biuret y quela s jones de Cu” y el | gentes o agentes reducto- Folin reactive Folin-Ciocaltew po- | res. ocalteu) tencia el color azul. Reacciona con grupos amino | La sensibilidad depende Ensayo 450/550 | 10ng/mla150 | primarios en presencia de | del mimero de amines cuanticativo ng/ml sianuro 0 tioles; el colorante | presentes. Reacciona con CBQA ‘no Feaccionente no presenta | otras aminas primarias. No Auorescencia compatible ‘con buffers que ‘contenganaminas 0 tioles. Reaceiona con grupos amino | La sensibilidad depends Fluoresca- | 390/475 | 0.3 ng/mtat3 | primarios; el colorante no re- | del nimero de aminas mina elm! accionante no presenta flu- | presentes. No compatible orescencia con buffers que contengan Tris o glicina. El reactivo 3 inestable. Reaceiona con grupos amino Opa 340/835 | 0.2 ye/mta25 | primarios en presencia de B- © g/m! mercaptoctanol; el colorante | presentes. No compatible ftaldehido) no reaecionante no presenta | con buffers que contengan fuorescencia Tris 0 glicina. Su costo es bajo. 205 T0ugimias0 | Absoreién del enlace | La sensibilidad depends Absorcién 280 g/ml eptidico.Absorcién de tirosi- | del niimero de ami- uv so ng/mi a2 — | nasy triptofeno noscidos. arométicos pre- mg/ml sentes. No es destructivo. Su costo es bajo "Maxima longitud de onda de emisién/exitacién de onda de de absorbancia en nm. 78 BioTecnologia 1998/Vel. 3determinacién porabsorcién en el ultravioletaa 280 nm, as{comorelativamente sencilla y ficil de adaptar aandlisis en pequefia escala, Sinembargo, la cantidad de color producido varia con diferentes proteinas y en algunos casos el color no es estrictamente proporcional ala concentracién. Principio Existen dos pasos que llevan al desarrollo de color en las proteinas, la reaccién con cobre en filcali y la reduccién del reactivo fosfomolibdico-fosfotingstico por el complejo proteina-cobre. Elcolor natural de las proteinas en ausencia de cobre puede ser enteramente atribuido al contenido de tirosinas y triptofano.* Sin embargo, en presencia de cobre, el tratamiento alcalino de las proteinas resulta en un incremento de 3 a 15 veces en el desarrollo del color. Lareaccién con cobre toma de 5a 10 minutos temperatura ambiente, pero el calentamiento a 100°C o el aumento en la concentracién de dlcali acelera la reaccién con cobre en soluci6nalcalina. Se requiere muy poco cobre para obtener un color final completo. Cuando el reactivo Folin es adicionado a la protefna tratada con buffer a pH 10 se obtiene un color maximo debido alla reduccién del mismo por el complejo proteina-cobre. El cambio en la _absorbancia Tabla 2. Reactivos compatibles con el ensayo de Lowry? producido por la reduccién del reactivo Folin es, monitoreadoa 750 nm. Interferencias Reactivos como el dcido tirico, guanina y xantina reaccionan con el reactivo Folin, produciendo interferencias. La guanina produce 50% més color, eso por peso, que la proteina a ser probada. La mayoria de los fenoles, excepto los nitrofenoles reducen al reactivo, debido a esto, el timol y el écido sulfosalicflico interfieren, mientras que el dcido picrico arriba de 0.1% es permisible. La glicina al 0.5% disminuye el color con la proteina enun 50%, mientras que la hidrazina a més de 0.5% incrementa 1 blanco. El sulfato de amonioa una concentracién final arriba de 0.15% retarda la aparicién de color, esto es debido en parte a la disminucién en alealinidad, pero puede ser tolerado a concentraciones superiores a 0.25% si se adiciona una cantidad equivalente de Alcali ala muestra? Procedit ito Reactivos. ReactivoA: Na,CO, al 2% en NaOH 0.1N. ReactivoB: CuSO, 5H, en tartrato de sodio -y potasio al 1%. Urea 0.5% ‘Guaniaina 0.5% ‘Tunstanato de sodio 0.5 Sulfato de sodio 1% ‘Nitrato de sodio 1% Acido perelérico 0.5% neutralizado Acido tricloroacético 0.5% neutralizado ‘Alcohol etilico 59% Bier 5% Acetona 0.5% Sulfato de zinc 0.1% HidrOxido de bario 0.1% 79 BioTecnologia 1988/Vel. 3ReactivoC: solucién alcalina de cobre, mezclar 50 ml de reaetivo A con 1 ml dereactivo B; estasolucién debe ser preparada al momento de uso. Reactivo D: solucién de carbonato de cobre, es la misma que el reactive C pero omitiendo al NaOH; es uti- lizada para cuantificar proteinas insolubles. Reactivo Folin diluido a INen Acido? Reactivo E: Cuantificacién de proteinas en solucién. 1. Pipetear en tubos de ensayo muestras que contengan de 5 a 100 yg de proteinaen 0.2mlo menos. 2. Adicionar 1 ml deractivo C,mezclar bien y dejar 10mino més atemperatura ambiente. Figura 1. Curva sténdar de citrocromo (corazén de caballo) por el método Lowry. 1 12 1 og. 0s. oa, Absorbancia a 750 nm 02. 9, 024 6 8 oR Proteina (amol/ml) 16 18 20 80 . Adicionar répidamente 0.1 ml de reactivo E, mezelar en vortex durante 2 segundos y dejar durante 30 mina temperatura ambiente. Leer absorbancia, Para concentraciones finales de proteina de 5 a 25 jig/ml, la lectura puede hacerse a 750 nm. Para soluciones mas concentradas la absorbancia puede leerse a 500 om. Cuantificacién de proteinas insolubles. Esta metodologiano es general, pero puede ser titilen algunos casos de precipitados dicidos de proteinas. 1, Adicionar 0.1 ml de NaOH IN a 5-100 pg de proteina precipitada. Para muestras mis grandes puede ser necesario calentar por 10min. omésa 100 °C en dlleali IN. Esto puede disminuir las lecturas, pero éstas son muy reproducibles. . Después de 30 minutos o mis, adicionar 1 mide reactivo D y dejar 10 minutos a temperatura ambiente, Adicionar0.1 ml de reactivo E, mezelar en vortex durante 2 segundos y dejar durante 30 min a temperatura ambiente. . Leer absorbanciaa 750 nm para concentraciones finales de protefna de 5 a25 yg/mloa500nm para solucionesmis concentradas. Cuantificacién de proteina por el método de Bradford® Este método involucra la unién del colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 a las proteinas, pro- vocando un cambio en el maximo de absorcién de 465 a.595 nm y se monitorea midiendo el inere- ‘mento en la absorciéna 595 nm. Elensayo es muy reproducible y ripido, puede ser empleado para procesar un gran néimero de muestras y es adapta- blealaautomatizacién. BieTecnologia 1998/Vol. 3Tabla 3. Efecto de varios reactivos en la formacién del complejo Azul Brillante de Coomasie G-250-proteina*, Reactive? ‘Cambio en OD 595 nm (2) Equivalentes de BSA IMKcl 0.000 0.00 5M NaCl 0.000 0.00 : 1M MgCl, = 0.000 7 0.00 2M Tris 0.026 234 = 0.1 MEDTA 0.004 036 1M (NH),S0, 0.000 0.00 99% Glicerol 0012 1.08 = 11M 2-Mercapioetanol 0.004 036 1M Sacarosa 0.013 17 95% Fianol 0.000 000 ‘Acstona, 0.068 621 5% Fenol 0.046 414 0.196 Triton X-100 0.013 = 1.17 196 Triton X-100 0.590 53:10 0.1% SDS oon 099) 19D 0.495 4455 0.19% Flemosol 0.004 036 19% Hemosol 0.108 9.72 “Los valores anteriores fueron obtenides cuando se agreg6 0.1 mi de cada sustancia al ensayo. Principio Elmétodo est basado en la observacién de que el colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 pre- senta dos formas coloreadas, azul y rojo.” El color rojo pasa a azul cuando el colorante se une a la proteina.’ La formacién del complejo colorante- proteina toma aproximadamente 2 minutos y per- manece estable por I hora, por lo que el procedi- miento es muy répido y el tiempo parael ensayo noes limitante, Elcomplejo colorante-protefna tiene un alto coefi- 81 ciente de extincién, lo que hace al ensayo aproxi- madamente cuatro veces mas sensible que el ensa- yode Lowry. Interferencias Buffers altamente alcalinos presentan interferencia, pero puede ser contrarrestada corriendo blancos apropiados, Reactivos como cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, etanol y sulfato de amonio no tienen efecto sobre el ensa- Yo. Otros reactivos como Tris, acido acético, 2- mercaptoctanol, sacarosa, glicerol, EDTA y trazas BloTecnologia 1998/V0l. 3de los detergentes Triton X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y Hemosol tienen ligetos efectos que pueden ser ficilmente eliminados preparando buffers adecuados. La presencia de grandes canti- dades de detergentes presenta una gran interferen- cia. Procedimiento Blensayo esmuy reproducible y ripido,conel desa- rrollo completo de coloren un intervalo de2 minutos, yuna estabilidad de aproximadamente I hora. Microensayo 1, Preparacién de reactivo. Disolver 100 mg del Colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 en 50 ml de etanol al 95%, Adicionar a esta solucién 100 ml de écido fosfirico al 85% (ww/ ¥), Diluir la soluci6n resultante a 1 litro. Las con- centraciones finales en el reactivo son: Azul Bri- ante de Coomasie G-250 0.01% (w/v), etanol 09, os. 07, 06: os, oa 03, 02 ou Absorbancia a 595 nm ee Proteina ne 100125 Figura 2. Curva estiindar de Albumina de suero bovi- 1no (BSA) por el método de Bradford. 82 4.7% (wiv), Acido fosférico 8.5% (wiv).? 2. Pipetear en tubos de ensayo soluciones de pro- teina que contengan de 102 100 mg de protei- na, 3. Ajustarel volumen.a0.1 ml conel butfer apro- piado. 4, Agregar un mililitro del reactivo Azul Brillante de Coomasie G-250 preparado como se des- cribe anteriormente. 5. Mezclaren vortex y leer absorbancia a 595.nm después de 2 minutos de agregar el colorante y antes de I hora de iniciada la reaccién. Cuantificacién de proteina por el método BCA® Ladeterminacién de proteina por BCA es un mé- todo altamente sensible.* Este método combina la reaccién de las proteinas con Cu"? en un medio alealino (produciendo Cu*) con un reactivo para la deteccién de Cut altamente selectivo y sensitivo denominado Acido bicinconinico. Este ensayo muestra menos variacién de una pro- tefna.a otra. La variabilidad es similar a aquella obtenida con el método de Lowry, pero puede ser reducida efectuando el ensayo a 60°C por 30 mi- nutos (procedimiento mejorado). Principio El dcido bicinconinico (BCA), en la forma desu sal de sodio soluble en agua, es un reactivo alta- mente sensible y especifico para el ién Cu’. Se ha reportado que la estructura macromolecular de la proteina y cuatro péptidos especificos (cisteina, cistina, triptofano y tirosina) son los responsables de la formacién de color en muestras de proteina cuando son ensayadas con BCA? BioTecnoiogia 1998/Vol. 3Tabla 4. Reactivos compatibles con el ensayo BCA. Detergentes Butfers/sales Otros reactivos Triton X-100 1% O.1M Tris! 0.1NHCI SDS 1% 0.1M Fosfato de sodio 0.1 NNaOH Brij35 1% 0.1M Biearbonato de sodio 10 mM EDTA® Lubrol PX 1% 1.0M Cloruro de sodio 3.0M Urea CHAPS 1% LOM Glicina pH 11° 40% Sacarosat CHAPSO 1% 0.2 M Acetato de sodio pH 5.5 0.2% Azida de sod Octil glucésido 1% 0.1M Asparagina pH 7.25 10 mM Glucosat ‘Triton X-114 1% 0.1M Bicarbonato de cesio 1 mM DTT" Nonidet NP-40 1% O.IMHEPES pH7.25 1 mM DTE* ee “Buffers de Tris a concentraciones superiores de 0.1 M pueden usarse fectivamente si se ajusta el pH a 11.0. ‘licina deben ajustase a pH 11.0~ 11.25 paraevitar erores serio en Ia determinacién. “EDTA (a concentraciones superiores @ 10 mM) y otros agentes quelantes fuertes pueden disminuir los iones disponibles de cobre -nocesarios para el ensayo reduciendo la sensbilidad del mismo. “Los aztearesreductores pueden causar eror silos tiempos de incubacién y latemperatura son elevados. La sacarosay la glucosa,siendo reductoresdébiles, resultan en una ligeraabsorbanci, pero los resultados Hineales pueden ser mantenidos aunque la sensibilidad del ensayo puede verse reducida. “Los agentes eductores como DTT y DTE, resultan en altas iterferencias que reducen la Sensibilidad del ensayo, Se ha encontrado que los siguientes compuestos interfienen en el método estandar resultando en blancos excesivamente altos: 0.01% Thimerosdl, 1.0 % ‘Mereaptoetanol y Acido ascérbico 0.1 M. 1.25. Los bulfers de Lacuantificacién por BCA combina lareaccién de 11.25, Cualquier reactivo en la muestra que dismi- Biuret (reaceién de la proteina con Cu"? enun me- nuya el pH de la formulacién a menos de 11 0 lo dio alcalino para producir Cu’). El producto de la eleve amés de 11.5 puede afectarla sensibilidad 0 reaccién presenta un color piirpura, formado por reproducibilidad del ensayo. Enmuchos casos, ajus- lainteraccién de dos moléculas de BCA con el ién tar el pH de la muestra a 11 antes de realizar la Cur, es soluble en agua y exhibe una fuerte determinacién puede evitar variaciones. absorbancia a 562 nm. Esto permite la cuantificacién espectrofotométrica de proteinas en El reactive BCA tiene gran tolerancia a compues- soluciénacuosa, tos que se encuentran rutinariamente en soluciones de protefna. Un caso particulares la ausencia de Interferencias interferenciasen concentraciones relativamente al- tas (1%) de detergentes iénicos y no iénicos. Los Este ensayo esta tamponado a un pH éptimo de reactivos listados en la tabla 4, han sido probados 83 BioTecnologia 1998/Vol. 3con una soluciénde proteina de 500 mg/ml de BSA con el método esténdar (37 °C/30 min). Las con- centraciones listadas para cada reactivo no inter- fieren con el ensayo (error relativo menor al 3%). Protocolos El ensayo de proteina por el método de BCA es fiexibley permite elegirel mejor procedimiento para tuna situacién dada. Es posible incrementar la sen sibilidad del ensayo aumentando el tiempo de incubacién, aumentando 1a temperatura de incubacién, o ambos. La estabilidad del color des- pués deenfriara temperatura ambiente es suficien- te para permitir las lecturas de absorbancia de miltiples muestra. Procedimiento esténdar. Rango aplicable de con- centraci6n de proteina = 20 - 1200 jig/ml. Este protocolo proporciona excelente sensibilidad de cerca de 0.012 Unidades de Absorbancia (UA) 12. 0. 06. oa. Absorbancia a 562 nm 02. 0 20 «40 6080100120 Proteina (mg/ml) Figura 3, Curva esténdar de BSA por el método del ci do bicinconinico (BCA). 84 por microgramo (j1g) de proteina combinado con un répido andlisis. Temperatura =37 °C; Tiempo =30 min. Procedimiento a temperatura ambiente, Ran- {g0 aplicable de concentracién de proteina=20- 1200 mg/ml. El desarrollo del color procederd nor- ‘malmente a temperatura ambiente. Después de 2 horas aesta temperatura, la sensibilidad es de 0.010 (UA)/ug de'proteina. Después de 21 horas, la sen- sibilidad se duplica. Temperatura ambiente; Tiem- po=2 horas. Procedimiento mejorado. Rango aplicable de concentracién de protefna = 5 - 250 ug/ml. Este protocolo es aplicable para aquellas situaciones, donde se espera que la concentracién de las mues- tras sea baja o si se desea emplear solo una pe- ‘quefia cantidad de muestra. La sensibilidad es ex- celente cerca de 0.032 (UAY/ug de proteina. Tem- peratura = 60°C; Tiempo = 30 minutos. Procedimiento Debido a que la relacién de colorante a volumen, de la muestra es la misma, todas las técnicas son, idénticas excepto por los tiempos y temperaturas, deincubacién. 1, Preparacién del reactivo de trabajo. Mezelar 50 partes del “reactivo A” con una parte del “reactivo B” (Pierce BCA catdlogo No. 23225).. Reactivo A: contiene carbonato de sodio, bi- carbonato de sodio, reactivo BCA para detec- cién y tartrato de sodio en una solucién de NaOH 0.2 N. Reactivo B: solucién de sulfato de cobre 4%. 2. Preparar un grupo de estindares de proteinas de concentracién conocida, diluyendo la pro- BioTacnologia 1998/Vol. 3teina a ensayar en el mismo diluyente de las muestras desconocidas. El grupo de estandares de proteina debe cubrir el rango de concentra- ciones indicadas en el protocolo a seguir. 3. Pipetear 0.1 ml de cada esténdar o muestra de concentracién desconocida en tubos previamen- te marcados. Para blancos, utilizar 0.1 ml de diluyente, 4, Adicionar 2.0 ml de reactivo de trabajo acada ‘tubo y mezclar en vortex. 5. Incubar todos los tubos a la temperatura y tiem- po seleccionados. Procedimiento estindar: 37 °C; 30 minutos. Procedimiento a temperatura ambiente: tempe- ratura ambiente; 2 hors. Procedimiento mejorado: 60°C; 30 minutos. 6. Después de la incubacién, enftiartodos los tu- bos temperatura ambiente. 7. Medir la absorbancia a 562.nm, o7. 06. os. oa. 03: 02. Absorbancia a 595 nm o1 o 24 6 8 WDM 16 Proteina (mg/ml) 18 20 Figura 4. Curva estéindar de BSA por el método de Bio- Rad (mieroensayo). 85 Determinacién de proteina por Bio-Rad Este ensayo, basado en el método de Bradford, es un procedimiento simple y preciso parala determi- nacién de la concentracién de proteinas solubles. Involuera la adicién de un colorante écido a una solucién de proteina y la subsecuente medicién a 595 nm.con un espectrofotémetro o un lector de microplatos. La comparacién con una curva esténdar proporciona una medida relativa de la ‘concentracién de proteina, Princij Lacuantificacién de proteina por Bio-Rad consis- teenun cambio diferencial de coloren respuesta a varias concentraciones de proteina’. Elmaximo de absorbancia para una soluci6n écida del colorante azul brillante de Coomassie G-250 cambia de 465 nm a 595 nm cuando se une a la proteina!®", E] colorante azul de Coomasie reacciona principal- ‘mente con residuos de amino écidos basicos y aro- miticos, especialmente arginina"®. Spector" en- contré que el coeficiente de extincién molar de una solucién de complejo albimmina-colorante era cons- tante sobre un amplio rango de concentraciones. De esta forma, la Ley de Lambert y Beer puede aplicarse para la cuantificacién precisa de proteina seleccionando una relacién apropiada de volumen de colorante a concentracién de la muestra. Interferencias Las interferencias con este ensayo pueden ser oca- sionadas por interacciones quimicas con la protef- nao por interacciones quimicas con el colorante (condiciones alcalinas o detergentes interfierencon ‘este ensayo). A continuacién se enlistan reactivos BloTecnologia T9987Vol. 3Tabla 5. Reactives compatibles con el ensayo Bio-Rad (procedimiento estindar). ‘Acetona Fenol 5% Mereaptoetanol 1M | rRNA 0,25 mg/ml ‘Aminoscidos Fosfatos 1 M Metanol IRNA 0,4 mg/ml Ditiotreitol 1M _| Glicerol 99% NaCl 5M SDS 0.1% Btanol Glucosa Peptonas Triton X-100 0.1% Fructose KCIIM pH dcido Urea 6M yagentes quimicos que no interfieren con este en- sayo. Algunos de estos reactivos pueden causar interferencias en combinacién con ciertas protei- nas, sin embargo, con respecto a proteinas tales como albimina de suero bovino y globulina, los agentes listados muestra poca onula interferencia. Lasconcentraciones equivalentes de estos reactivos para el microensayo corresponden a 1/40 de las Fluorescencia 5 i é ‘© 100 300 300 500 Proteina (ng/ml) o 2 4 6 8 10 Protefna ( j4g/ml) Figura 5. Determinacién de proteina BSA utilizando el método Nano Orange. El recuadro corresponde al érea mareada en la esquina inferior izquierda de la grafica (© a 500 ng de proteina por mi) e ilustra el limite de deteccién de 10 ng/ml. 86 listadas en la tabla 5, esto se debe a la diferent en arelacién muestra a reactivo entre el procedi- miento estdndar y el microensayo. Procedimiento (microensayo) 1, Preparar 3 0 5 diluciones de una solucién estndar de proteina, las cuales deben ser re- presentativas de la solucién que vaa ser anali- zada. El rango lineal para BSA es 1.2 a 10.0 ug/ml, mientras que para IgG el rango lineal va de 1.2425 pg/ml. 2. Adicionar 800 yl de cada muestra esténdaren tu- bos de ensayo. Las soluciones de protefna son notmalmente ensayadas en duplicado o tiplicado. 3. Adicionar 200 ml del colorante reactivo Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio Rad Ca- télogo No. 500-0006) a cada tubo y agitar en vortex. 4, Incubar a temperatura ambiente por al menos 5 ‘minutos. La absorbancia incrementa con el tiem- po porlo que las muestras deben incubarse a temperatura ambiente por no més de I hora. 5. Medir la absorbancia a 595 nm, Cuantificacién de proteina por el método Nano Orange Losmétodos reportados por Lowry” y Bradford’, asi como el ensayo descrito por Smith, que utiliza Acido bieinconinico (BCA), son pruebas basadas BioTecnoiogia 1998/Vol. 3enmedidas de absoreién, lo que hace a estos mé- todos limitados en sensibilidad y rango efectivo de anélisis. El método Nano Orange permite un en- sayo de alta sensibilidad para la determinacién de proteinas en solucién. Principio Lainteraccién de la proteina con el reactivo diluido produce un gran aumento en la fluorescencia que puede ser empleado para generar una curva estndar para la determinacién de proteinamediante su lectura a 485/590 nm. La fluorescencia del reactivo en ausencia de la proteina es desprecia- ble. Elensayo de Nano Orange puede detectar protei- naaconcentraciones finales de 10 ng/ml cuando se utiliza un espectrofluorémetro estandar o un minifluorémetro equipado con flitro. Un sélo en- sayo es suficiente para cuantificar concentraciones de proteina entre 10 ng/ml y 10 pg/ml, un intervalo de tres 6rdenes de magnitud. Encontraste con los métodos de Bradford y BCA, el ensayo con el reactivo Nano Orange y su com- plejo con la protefna presentan gran estabilidad quimica. De esta forma, la cuantificacién puede efectuarse hasta seis horas después de la prepara- cidn de la muestra sin pérdida de sefial, conside- rando que las muestras se encuentran protegidas dela luz. Otra ventaja que presenta este método ‘es una menor variaci6n de proteina a proteinaen la ‘cuantificacién, Tabla 6. Niveles de tolerancia para contaminantes en el método Nano Orange para cuantifieacién de proteina.! Gii Polietilénglicol (PEG) rol 10% por volumen 1% por volumen Urea 1M Ditiotritol (OTT), B-mercaptoctanol 100 mM = KCI, NaCI, acetato de sodio, fosfato de sodi 20mM Sulfato de amonio, cid ascérbico, butfer | = HEPES, HCl, NaOH, azida de sodio, sacarosa, 10mM EDTA 5mM CCloruro de calcio, cloruro de riagnesio Imm ‘Amino dcidos 100 p/m DNA 100.ng/mi Dodecil-sulfato de sodio (SDS) 0.01% - ‘Tween 20, Triton X-100 1% “Los compuestos presentes en la solucién final aensayar a concentracionesiguales omenores alas indicadas no interfteren gpreciable- ‘mente con la determinacién, Siempre que sea posible, el blanco y estdindares de proteina deberdn ser preparados en soluciones @ condiciones similares a aquellas de las musstras experimentales. 87 BioTecnologia 1998/Vel. 3Interferencias Este método es compatible con la presencia de agentes reductores. Ademés, la alta sensibilidad y estabilidad del ensayo permite la dilucién de los contaminantes potenciales, incluyendo sales y detergentes. Los écidos nucléicos no interfieren con lacuantificacién. Procedimiento Lacuantificacién de proteina es més fécil de desa- rrollar que otros métodos. Las muestras de prot na simplemente son adicionadas al reactivo dil NanoOrange (Molecular Probes Catélogo No. N66) y las mezclas son calentadas a95 °C por 10 min, Después de enfriar las muestras a tempe- ratura ambiente, sus emisiones de fluorescencia se miden directamente. La fluorescencia se mide utili- zando filtros para emisién/exitacién a 485/590 nm. Conclusiones El mejor método para la determinacién de protef- nas dependera de varios factores, unos dependen de la muestra aanalizar y otros de la infraestructu- racon que se cuente. En todos los casos siempre se prefieren los métodos sencillos y répidos. Lasensibilidad del método es muy importante cuan- do lacantidad total de la muestra es limitadao bien, cuando laconcentracién de protefna en ellaseamuy baja. La especificidad del método es importante cuando se analizan muestras de diferente natura- leza, es decir, la respuesta del método no presen- tara grandes variaciones dependiendo del tipo de protefna presente. De otra manera seria necesario larealizacién de varias curvas estndar, una para cada tipo de proteina a cuantificar. Las interferencias, 88 al método son importantes cuando se trata de mues- tras no muy puras, obtenidas de medios comple- jos, conteniendo concentraciones elevadas de otros ‘compuestos 0 condiciones de pH o fuerza iénica especiales, ‘Todos los métodos presentados aqui son reprodu- cibles y varian en la sencillezde la determinaci6n, en la sensibilidad y en el costo. Nosotros reco- mendamos como el mejor método aquel que es lo suficientemente sensible para detectar las concen- traciones que se tienen en las muestras, que es sen cilloy répido, y finalmente el mas econémico. Referencias |. Haugland, R. P,, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes. Sixth Edition. 1996.180-182. 2. Lowry, O. H.;Rosebrough, N. J; Farr, A. L.; Randall, R Juv Biol. Chem, 193,265 (1951). 3. Folin, O. and Denis,W.,.J Biol, Chem. 12,239(1912).. 4, Heriot, R.M.,J: Gen Physiol., 19, 283 (1935). 5. Herriot, R.M,, Proe. Soc. Exp. Biol and Med ,46, 642 asap). 6. Bradford, M..M., Anal. Biochem.,72,248-254 (1976). 7. Reisner, A. H.; Nemes, P. and Bucholtz, C., Anal, Biochem. 64, 509 (1975). & Smith, P. K.; Krohn, RL; Hermanson, G. 1. Mallia, A. K Gartner, FH; Provenzano, M. D.; Fujimoto, E. K.;Gocke, N. M; Olson, B. 1; Klenk, D.C., Anal. Biochem, 150, 76-85 (1985). 9. Wiechelman, K.; Braun, R.; Fitzpatrick, J., Anal Biochem, 175,231-237 (1988). Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R.G.; Daytner, A., Biochim. Biophys. Acta, 71,377 (1963). 11 Sedmack, J.J. and Grossberg, 8. ., Anal Bichem.79, 544 (1977). 10. 12. Compton, S. J. and Jones, C. G., Anal. Bichem. 151, 369 (1985). 13. Spector, T., Anal. Bichem. 86, 142 (1978), BioTecnologia 1998/Vol. 3