Determinacin por espectrofotometra del

contenido de Clorofila en la Espinaca

(Spinacia oleracea)
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Mnica Mara Lpez Paz, Maria Camila Alvarado Martnez.

Universidad de La Sabana, Facultad de Ingeniera, Ingeniera Qumica, Laboratorio de
Bioqumica. Campus Puente del Comn. Cha, Cundinamarca, Colombia.
Abstract. Se llev a cabo el anlisis del contenido de clorofila en un extracto de muestra de
espinaca mediante espectrofotometra. La metodologa de normalizacin se lleva a cabo bajo
un lmite de absorbancia correspondiente a 0.8, con un coeficiente molar normalizado de
21,59. La concentracin (mg/mL) de clorofila se obtiene mediante la curva de calibracin
establecida previamente. Se encuentra que la cantidad de clorofila en 9,1 mg de extracto de
acelga es de 0,243 mg.
Introduccin.
Las plantas siempre han estado presentes en el desarrollo de la especie humana, inicialmente
cobraron importancia en la agricultura para las primeras civilizaciones y fueron un factor
detonante de la sedentarizacin. Estas se han aprovechado de mltiples maneras desde
cuestiones nutricionales hasta esttica. El desarrollo de las ciencias en etapas posteriores,
permiti conocer ms a fondo las utilidades de las plantas en donde destac uno de sus
componentes, la clorofila, su capacidad de absorcin de luz solar que hace posible uno de los
procesos naturales ms eficientes que existe la fotosntesis . La clorofila fue descubierta por
un par de qumicos franceses gracias a la accin de los disolventes que permiten su
aislamiento. A nivel de laboratorio es posible cuantificarla y mediante extraccin aislarla de
hojas y tallos de plantas. Sus usos industriales abarcan la farmacologa por sus efectos
antioxidantes y beneficiosos para algunos sistemas funcionales del cuerpo humano.
Metodologa. La metodologa desarrollada en esta prctica se divide en tres componentes
principales: la normalizacin del mtodo espectrofotomtrico, la extraccin de muestras de
espinaca, y la determinacin de la absorbancia de la solucin problema. Los tres son descritos
en detalle a continuacin:
Normalizacin del mtodo espectrofotomtrico. Se prepara una solucin patrn de
concentracin 0,2 mg/mL disolviendo una pastilla de clorofila (10 mg de clorofila por
pastilla) en un volumen de 50 mL. Una vez preparada, se procede a realizar la medicin de la
absorbancia de la solucin patrn en el espectrofotmetro UV-vis. El valor de la absorbancia
para la solucin patrn resulta ser de 2.53.
Puesto que el presente estudio se desarrolla bajo un lmite de absorbancia correspondiente a
0.8, resulta necesario realizar cinco diluciones de la solucin patrn con el fin de generar

muestras con concentraciones inferiores, para as obtener absorbancias en el intervalo de 0 a

0,8.
Se realiza la primera disolucin llevando un volumen de 3 mL de solucin patrn hasta 10
mL en un baln aforado. Las siguientes disoluciones se llevan a cabo bajo el mismo proceso,
tomando como concentracin inicial la concentracin obtenida con la disolucin previa. La
tabla 1 muestra las concentraciones empleadas y sus respectivas absorbancias:

Al graficar los datos presentados en la tabla 1, se obtiene la curva de calibracin. Esta curva
debe presentar una relacin lineal entre concentracin y absorbancia, pues esto simplifica
los clculos y asegura que se han establecido las condiciones ptimas para el procedimiento
analitico. (Daz, 2002)

La curva de calibracin se grafica con el fin de determinar el coeficiente de extincin molar;

el cual, es equivalente a la pendiente de la recta. No obstante, el comportamiento de la curva
en la grfica 1 no es completamente lineal, por lo que resulta necesario hacer un ajuste lineal
con ayuda de un software computacional. Dicho ajuste permite conocer la siguiente
informacin:

Regresin Lineal ajuste del conjunto de datos: Grfica 1.

Usando funcin: A*x+B
Y: Desconocido
Desde x = 0,0079 a x = 0,06
B (y-interseccin) = -0,0837285239503073 +/- 0,0331328324580413
A (pendiente) = 21,5923967519516 +/- 0,990382079705063
De tal manera, el coeficiente de extincin molar es de 21,5923 para el cromforo en
cuestin.

Extraccin de la muestra de espinaca. Utilizando un montaje Soxhlet se lleva a cabo la

extraccin de una muestra de espinaca. Se obtienen en total 9.1 mg de extracto de espinaca.
Enseguida, se diluyen los 9.1 mg de muestra en 10 mL de solvente, compuesto en un 90% por
etanol y 10% agua. Posteriormente se efecta la medicin de la absorbancia para la solucin
problema en el espectrofotmetro. El resultado es de 0,441.
Resultados y Discusin.
Cuando se toma como objeto de estudio la clorofila que ha sido aislada de los tallos y hojas
de espinaca, se encuentra que la clorofila es una molcula fotorreceptora. La espinaca
pertenece a un grupo bastante amplio de plantas verdes que presentan clorofila a, un
tetrapirrol sustituido (Stryer, Berg, Tymoczko, 2008). De igual manera se toma en
consideracin su no pertenencia a otros tipos de clorofila como puede serlo la b, c1 y c2 que
se encuentran en otros tipos de plantas como las algas y en muchos protistas. A continuacin
se adjunta la estructura en la figura 1.

Figura 1. Estructura de la clorofila a. Es un tetrapirrol cclico. Imagen tomada de ChemSpider search and share
Chemistry. Disponible en: http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.16736115.html?rid=fd385eec-fdbe-4c3b-b611a634bdb2aab6

Una vez dicho esto, se procede a la determinacin y anlisis de la cantidad de clorofila a

presente en la planta de espinaca.
La solucin de extracto de espinaca [0,91 mg/mL] presenta una absorbancia de 0,441.
Asumiendo que el nico compuesto de carcter cromforo en el extracto de espinaca es la

clorofila, y con base a la absorbancia obtenida, es posible determinar la cantidad de clorofila

en el extracto de la planta.
Se llega al resultado de manera analtica utilizando la ecuacin de la curva de calibracin o
bien utilizando la grfica.
Determinacin de la cantidad de clorofila mediante la curva de calibracin. Mediante el
ajuste lineal de la curva, se obtiene la ecuacin de la recta y = 21,5923 x - 0,08372 . De ah
que el valor en x correspondiente a y = 0,441 es x = 0,0243, lo cual representa 0,0243 mg
Clorofila/mL.
La concentracin de la solucin problema es de 9,1 mg extracto de espinaca/ 10 mL y las
concentraciones empleadas para la construccin de la curva de calibracin se trabajan en mg
Clorofila/10 mL. Bajo esta lgica, es vlido afirmar que de los 9,1 mg de extracto de espinaca
presentes en 10 mL de solvente, 0,243 gramos son de clorofila, lo que equivale al 2,67% p/p.
De manera convencional, la composicin qumica de las plantas se expresa en g/100g;
realizando las operaciones aritmticas pertinentes se obtiene que la composicin de clorofila
en la espinaca es de 2,67 g/100 g.
Ahora bien, es posible determinar el error presente en el proceso matemtico descrito
anteriormente. Para esto, se determina el valor del coeficiente de extincin molar utilizando
la ecuacin de Lambert-Beer. (Harris, 2003) Dicha ecuacin relaciona la absorbancia de la
luz monocromtica a una longitud de onda fija y la concentracin del cromforo bajo la
siguiente expresin:
A= CI
donde A es la absorbancia, el coeficiente de extincin molar, C la concentracin
del cromforo e I , el ancho de la celda que contiene la muestra al momento de realizar la
medicin en el espectrofotmetro. Partiendo de que el ancho de la celda utilizada en el
laboratorio es de 1.00 cm y de la concentracin del cromforo obtenida en el anterior anlisis
(0,0243) junto con la absorbancia de 0,441, se tiene que el coeficiente molar es de 18.1481.
Por tanto, el error es del 15,97% .
Rendimiento de la extraccin
Es posible calcular el rendimiento por peso hmedo por peso seco de lo obtenido de clorofila
a continuacin se establecen ambas relaciones.
de clorofila
100=
( g demgespinaca
hmeda )

Rendimiento por peso hmedo

0, 243 mg
= 0,026* 100= 2.6 %
9,1mg espinaca humeda
de clorofila
=
( g mg
de espinaca seca )

Rendimiento por peso seco

0, 243 mg
=0,027100=2,7
8,9mg seca

Conclusiones.
El espectro de absorcin UV-Vis se emplea con bastante frecuencia en qumica analtica, la
interaccin de la radiacin electromagntica con la materia producida en el barrido permite
un anlisis cuantitativo que pudo establecerse para la clorofila extrada de la espinaca, la
concentracin de clorofila en la muestra es de 0,243 mg/ seleccionada de extracto de espinaca
corresponde a un 12% del porcentaje peso.
El modelo matemtico, la ley de Lambert-Beer principalmente apunta a una proporcionalidad
existente entre el espesor del analito, la concentracin y una constante que obedece
determinados parmetros, permiti hallar la concentracin de clorofila en el analito a partir de
los datos medidos en el barrido debido a la intensidad de la luz absorbida, cabe resaltar que
esta ley puede describir muchos fenmenos de este tipo, sin embargo tiene unas limitaciones
que fue necesario tener en cuenta a la hora de llevar a cabo la prctica puesto que describe
bien comportamientos de disoluciones diluidas (<10 mM) porque cuando las molculas se
encuentran muy juntas las interacciones electrostticas empiezan a hacerse evidentes y se
genera un distorsin y no se cumple cuando se presenta una reaccin con el disolvente por lo
que se hace necesario conocer los disolventes apropiados en este caso una mezcla de etanol
90% y ter etlico 10%.
Las constantes de proporcionalidad pueden encontrarse como invarianzas ligadas a
determinados fenmenos, tal es el caso del coeficiente de extincin molar tambin conocido
por otros nombres como constante de absortividad y otros, su presencia en la ley de LambertBeer muestra la relacin que existe entre la concentracin de la disolucin y la cantidad de
radiacin electromagntica absorbida, este valor puede encontrarse de manera terica y con
grficas, tal es el caso que se calculo de las dos maneras, tomando tanto una pendiente al
corregir la grfica construida con una linealizacin gracias al apoyo de un software y
empleando la ecuacin de Lambert-Beer el valor obtenido es 18.1481 Por tanto, el error es
del 15,97% cuando se hace la comparacin con el valor de la grfica construida, no obstante
el porcentaje de error se encuentra dentro de los parmetros permitidos.
El porcentaje de error que se arrastra en la determinacin del coeficiente, tiene como
principales factores la posible prdida de masa en la extraccin de la clorofila puesto que las
muestras son considerablemente pequeas y usualmente se arrastra un error de este tipo,
adicionalmente la medida de la absorbancia puede estar desviada ligeramente debido al pH de
la disolucin pues este no se tom en consideraciones ni fue medido.
Es posible establecer unos ndices de rendimiento en porcentajes peso peso, lo que se obtuvo
fue del 2,7% en el extracto seco.

Bibliografa
Daz, A. C. (2002). Fundamentos de qumica analtica. Equilibrio inico y anlisis
qumico. Bogot: Universidad Nacional de Colombia.
Harris, D. C. (2003). Anlisis qumico cuantitativo. China Lake, California: Revert.

Berg, J., Tymoczko, John L, Stryer, Lubert, & Macarulla, Jos Mara tr. (2008). Bioqumica
(6a ed.). Barcelona: Editorial Revert.