BIOMEMBRANAS PROTOCOLO PARA ISOLAMENTO DE FRACCOES MEMBRANARES A. OBTENCAO DAS FRACGOES MITOCONDRIAL E MICROSOMICA A PARTIR DE CELULAS DE FiGADO DE RATO Procedimento: 1. Matar um rato e decapité-lo. 2. Remover rapidamente o figado e mergulhé-lo numa solugo de sacarose 0,25 M+ TRIS 10 mM, pH 7,4 (ST), conservada a 4 °C. Todas as operagoes devem ser conduzidas a frio (0-4 °C). 3: Cortar o figado em pedagos pequenos, lavar 2 ou 3 vezes com a solugdo ST e obter uma suspensdo final num volume de 80 ml de ST. 4, Transferir a suspenso para um homogeneizador de vidro (tipo Potter- Elvehjam) ¢ homogeneizar o tecido com 5 cursos do pistdo de teflon a 250 r.p.m. 5. Repartir 0 homogeneizado por dois tubos de centrifuga (50 ml) e centrifugar a 800xg, durante 10 min, numa centrifuga B-20 refrigerada. Desprezar os sedimentos. 6. Decantar os sobrenadantes para novos tubos de centrifuga e centrifugé-los a 7000xg, durante 15 min, na centrifuga B-20. 7. Ressuspender os sedimentos em 40 ml de ST e decantar os sobrenadantes para tubos de ultracentrifuga (B-60). 8) Centrifugar a suspensdo dos sedimentos (colectada num nico tubo de centrifuga B-20) novamente a 7000xg (lavagem), durante15 min, e ressuspender 0 sedimento desta centrifugagao em cerca de 10 ml de ST (1* fraccao). b) Centrifugar os sobrenadantes da primeira centrifugagzo a 7000xg (passo 6), recolhidos em tubos de ultracentrifuga, na ultracentrifuga B-60, a 100000xg, durante 40 min, e ressuspender os respectivos sedimentos em cerca de 10 ml de ST (2*fracgio).adie Mg Rem ai will vary depending upon the distance 3.39 Relative centrifugal foree. R.Av. 77.1 mm R.Max, 107.3 mmQuestdes que devem ser abordadas na discussio deste protocolo: 1, Porque deve ter a preocupagao de utilizar temperaturas proximas de zero no processo de isolamento? 2. Aque se destina a lavagem do figado antes da homogeneizacao? ‘A que se destina 0 passo 4? Porque utiliza um homogeneizador de “Potter Elvehjam"? Se a sua intengdo fosse obter fracgdes membranares de células musculares de coelho, usaria 0 mesmo sistema de homogeneizagéo? 4. A que correspondem os sedimentos obtidos no passo 5? A que se destina 0 passo 7a? A que corresponde estal* fracgio? 6. Porque tem de utilizar uma ultracentrifuga no passo 7b? A que corresponde a 2° fracgao? O que pensa conter maioritariamente o sobrenadante apés a ultracentrifugagao? 7. Se assua intengao fosse s6 obter a segunda fracctio, procederia da mesma maneira ou pouparia alguma(s) centrifugag&o(6es)?