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SEROLOGICAS
E.L.I.S.A
Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay
Antecedentes
Eva Engvall
Perimann
Peter
ELISA
Ensayo de Inmuno Absorcin Ligado a
Enzimas.
Se considera ligado a enzima porque una
enzima se une qumicamente a un anticuerpo
en las dos versiones de la prueba (indirecta y
directa)
El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que
los antgenos o anticuerpos son adsorvidos a un
plstico.
ELISA puede investigar la presencia de un
antgeno o de un anticuerpo.
ELISA
DEFINICIN
Antgenos
Los antgenos son, por definicin, generadores
de anticuerpos.
Incluyen protenas, polisacridos y varias
molculas
pequeas,
que
estimulan
la
produccin de anticuerpos.
Los antgenos son, a menudo, molculas que se
definen como <no propias> o extraas, para el
organismo.
Hay <antgenos propios> que actan como
etiquetas de identificacin
Anticuerpo
Son la respuesta del organismo ante la presencia de
un agente infeccioso.
Los anticuerpos son molculas proteicas secretadas
por los plasmocitos, y tienen una altsima afinidad por
sus antgenos correspondientes.
Anticuerpos se caracterizan por:
Ser Defensa natural
Tener Utilidad teraputica
Tener Utilidad Diagnstica
Marcador de Infeccin o exposicin.
Deteccin de antgenos
Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de
origen monoclonal o policlonal.
Controles
Se utilizan para asegurar que la prueba
esta funcionando correctamente
Control POSITIVO
Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando
as, un patrn sobre el cual basar los
resultados.
Control NEGATIVO
Incluyen sustancias que no deben
reaccionar .
Fundamento del
ELISA
Ag o Ac
fijado a
una fase
Slida
Ag o Ac
en la
Muestra
Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA
SUSTRATO
CAMBIO
DE
COLOR
Elementos del
ELISA
FASE SLIDA
Antgeno o
Anticuerpo
Conjugado: ENZIMA
SUBSTRATO
Fase Slida
SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
Las que favorecen la adsorcin fsica (por fuerzas
electroestticas) de las molculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
silicona.
Las que permiten la fijacin covalente
reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato
de
esos
Conjugado: Enzima
La enzima escogida como marcador debe:
Unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos,
Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
Tener un substrato cromognico o fluorognico
conveniente y de fcil preparacin.
Substrato
La eleccin del substrato es de gran
importancia para la estandarizacin del
mtodo ELISA y hay que tener varios
factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de
lectura, as como estabilidad despus de la
reaccin.
Requerimientos del sustrato
Solubles en agua
Fcil de manipular
No txicos, no mutagnicos
Bajo costo
Tipos de ELISA
Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimtica se dividen en dos tipos:
Competitivos
No competitivos
ELISA COMPETITIVO:
En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a
competir con el conjugado por un nmero limitado de
sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
Tipos de ELISA
ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o
anticuerpo que est en la fase slida. Si una
muestra es positiva se formar el complejo
antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado
reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando
color
Tipos de ELISA
Si la prueba se disea para
detectar un antgeno, es un
ELISA DIRECTO porque esta
buscando directamente, como su
nombre lo dice, la sustancia
extraa.
En
cambio,
un
ELISA
INDIRECTO, por su parte, se
disea
para
detectar
los
anticuerpos que el paciente ha
ELISA INDIRECTO
El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el
antgeno y uno secundario marcado
contra el primario. La deteccin
tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de
seal debida a la unin de dos o
ms anticuerpos secundarios por
cada primario.
Materiales
Materiales Orgnicos
Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre,
etc.)
Antgenos
Anticuerpos
Enzimas
Materiales No Orgnicos
Microplacas de 96 pocillos de plstico con fondos de pocillo
pticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100.
Espectrofotmetros de lectura de placas (lectores ELISA).
Prueba ELISA
Indirecta
LEYENDA
Antgeno
Anticuerpo
Primario
Anticuerpo
Ligado a Enzima
Sustrato
Deteccin de autoanticuerpos:
IgG(Factor reumatoideo)
DNA
Protena del ncleo
Medicin de Hormonas:
Progesterona, estrgenos, cortisol, insulina,
testosterona, gonadotropina corinica
humana, TSH.
Deteccin de antgenos tumorales:
Antgeno prostticoAlfa-fetoprotena
Antgeno del ovario
Antgeno carcinoembrionario
Importancia
En estudios serolgicos, hematolgicos,
endocrinolgicos, oncolgicos, en los
trasplantes.
Con propsitos mdicos se han aplicado
en la determinacin de hormonas y
protenas
plasmticas,
antgenos
tumorales,
drogas,
Ag
y
Ac
de
microorganismos
(parsitos,
hongos,
bacterias, virus)
Los
resultados
aportan
elementos
diagnsticos,
informacin
de
una
enfermedad
y
coadyuvan
en
la
planificacin del tratamiento
Inmunodifusin
Creada
Jacques Oudin,
rjan Ouchterlony,
(Estocolmo 1914-2004)
mdico sueco Ouchterlony desarrollado en su tesis
un nuevo mtodo analtico para la inmunodifusin .
INMUNODIFUSIN
RADIAL
Tcnica que cuantifica de manera sencilla y econmica
inmunoglobulinas
de isotipo G, M y A antgenos
solubles (C3, C4, transferrina,
protena C reactiva) presentes
en muestras biolgicas.
La tcnica se basa en la difusin de la muestra conteniendo el
antgeno a medir (inmunoglobulinas
antgenos solubles) en una
matriz semislida de agar en
la que se encuentra disuelto
el Ac especfico.
si la concentracin de Ag.yAc.estnen
relaciones ptimas (equivalentes) la banda se
formar en un punto intermedio del tubo,
mientras que silacantidad de Ag.
2. No Identidad:
3. Identidad Parcial:
Mediante la tcnica de
Ouchterlony podemos determinar
la existencia o no de
determinantes comunes entre
Ag.segnlas caractersticas de
las bandas formadas.
IDENTIFICACION BACTERIANA
MEDIANTE SECUENCIACION
DEL ARNr 16s
Coeficiente
de sedimentacin: se define como la razn entre la
METODOLOGIA
1 Amplificacin del gen a partir de una muestra
adecuada.
2 Determinacin de la secuencia de nucletidos del
amplicn .
3 Anlisis de la secuencia.
Aplicaciones de secuenciacin de
ARNr 16S en el diagnostico
microbiolgico:
TECNICAS DE
TRANSFERENCIA
BLOTTING
WESTERN BLOT
Mtodo en el cual las protenas son separadas en primer
lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
en condiciones desnaturalizantes y posteriormente se
transfieren a una membrana, mediante la aplicacin de
un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting).
una vez completada esta operacin la protenas de
inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo
especfico.
FRACCION CELULAR
Dot blot
Representa una simplificacin de los mtodosnorthern
blot,southern blotowestern blot. En un dot blot las biomolculas
para ser detectadas no son separadas porcromatografa . En
cambio, una gota que contiene la molcula para ser detectada se
aplica directamente sobre una membrana. esto es seguido por la
deteccin porsondasdenucletidos(northern blot y southern
blot) oanticuerpos(para un western blot).
http://www.youtube.com/watch?v=VmCTsmhx2_w
http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8
PCR
Reaccin en
Cadena de la Polimerasa
Un poco de historia
Tcnica desarrollada en
1983 por el Bioqumico
estadounidense Kary B.
Mulls, quien en 1993
recibi el premio nobel de
qumica.
Replicacin de ADN
En la procesos diferentes encargados de la transmisin
de la informacin gentica:
Replicacin: un cido nucleico bicatenario se duplica
para formar copias idnticas.
Transcripcin: un segmento de ADN que constituye un
gen se lee y se transcribe en una secuencia
monocatenaria de ARN (ncleo - citoplasma)
Traduccin: la secuencia de ARN se traduce a una
secuencia de aminocidos que forman una protena.
Extraccin de ADN
Lisis de las clulas o virus.
Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.
Purificacin. Consta de 3 fases:
1. Precipitacin del ADN.
2. Lavado del pellet.
3. Recuperacin.
. La confirmacin de la presencia de ADN
Ingredient
es
Tag polimerasa /
Polimerasa (Thermus
aquaticus)
ADN del organismo a
estudiar (Muestra)
Oligonucleotidos
(primers, iniciadores o
cebaores)
Dinucleotidos (dNTPs)
Muestra de ADN
Condiciones
Temperatura
pH
MgCl2
KCl
Muestras
viables.
Primers.
Taq
polimerasa.
Tecnica
Ciclo 1 :
desnaturalizac
in
Ciclo 2 :
Alineamiento
Ciclo 3 :
Extensin
Evaluar la
presencia
del gen.
Ciclo 1: Desnaturalizacin.
Deteccin de resultados
Electroforesis en gel de
Agarosa, revelado con rayos
UV gracias a la utilizacin
de Bromuro de etidio
(colorante)
Tipos de PCR
PCR Anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada.
PCR Multiplex
Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin, (hasta 8 primer)
PCR in situ
Es una PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, consiste en una reaccin de PCR en secciones
histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin.
RT-PCR
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una enzima denominada transcriptasa inversa , para realizar la
conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario). Es especialmente til cuando solo se
dispone de pequeas cantidades de ARN, esta tcnica se utiliza para amplificar genes especficos
PCR tiempo real
Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento. Para la deteccin de la cantidad de ADN
especfico se emplea una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse).
Aplicacin
Las tcnicas de PCR se han
hecho indispensables para
muchos procedimientos
comunes, como la clonacin
de fragmentos especficos de
ADN, la deteccin e
identificacin de genes para
diagnstico, y en la
investigacin de modelos de
expresin de los genes
DNA
RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
La tecnologa de DNA recombinante depende, en parte
de la capacidad de cortar y unir segmentos de DNA a
virus o a bacterias para amplificarlos, aislarlos e
identificarlos.
Fuente:
II
DNA RECOMBINANTE
VECTORES: Son
molculas de DNA
transportadoras.
Plsmidos: Son
pequeas molculas de
DNA circulares
presentes en muchas
bacterias y poseen un
nmero de sitios para
poder hacer la
restriccin.
DNA RECOMBINANTE
Bacterifagos: Son virus que infectan exclusivamente
bacterias. Lambda y M13
Fuente:
http://www.thebacteriophages.org/
DNA RECOMBINANTE
Csmidos: son vectores hbridos
construidos utilizando partes del
cromosoma del fango lambda y del
DNA plasmdico
Vectores transbordadores: Son
hbridos
que
provienen
de
diferentes
fuentes
(ejemplo,
plsmidos y virus de animales
como SV40)que pueden replicarse
en mas de un tipo de clula
husped.
Fuente:
http://www2.uah.es
F. Heterodplex recombinantes
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
Fuente:
http://es.slideshare.net/