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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIENCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO NORTE CAMPUS CURRAIS NOVOS CURSO TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE ALIMENTOS PROFESSOR: JONAS ALMADA

ESTUDO DIRIGIDO

1-

Explique o funcionamento da autoclave

2-

O que você esterilizaria:

a) Na autoclave Meios de cultura, soluções aquosas e vidrarias e materiais termoresistentes.

b) Na estufa Vidrarias e objetos metálicos.

c) Por filtração Soluções termolábeis.

d) Por incineração Alças e agulhas de inoculação.

3-

Marque verdadeiro (V) ou falso (F)

a) A esterilização pelo calor seco ou pelo ar quente não é recomendada quando

o contato direto do vapor d’água sob pressão é indesejado (F )

b) Meios de cultura sintéticos (quimicamente definidos) são aqueles que não posuem a composição química definida (F )

c) Quando um microrganismo cresce na superfície de um ágar camada alta é caracterizado como anaeróbio aeróbio (F )

d) A proporção do ágar em meio semi-sólido é de 1,5% 0,075-0,5% (F )

4-

Como você poderia ter certeza que um caldo nutritivo está realmente estéril? Incubando uma fração do caldo à 35°C na estufa por cerca de 24h. Assim, se houver crescimento microbiano é um indicador da mà qualidade no processo de esterelização.

5-

Justifique o que for falso:

a) A esterilização por autoclave pode ser empregada sem limitações, isto é, para qualquer solução. Falso, as soluções termolábeis (enzimática, por exemplo) não podem ser autoclavadas.

b) Meios complexos são aqueles que possuem composição química definida. Falso, os meios complexos são aqueles os quais não se sabe quantidades nem a composição química de algum(ns) elemento(s).

c) O ágar é usado como agente solidificante em meios de cultura na proporção de 0,5%. Falso, para meios sólidos a proporção de àgar é em torno de 1 a 2%.

d) Numa estufa (forno Pasteur), os microrganismos são eliminados pela

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desnaturação das proteínas. Falso, não só pela desnaturação, mas também pela oxidação. Com relação aos métodos de esterilização pelo calor seco e úmido cite:

equipamento, agente esterilizante, fundamento, temperatura e tempo.

Seco: estufa; ar quente; oxidação e desnaturação das proteínas e combustão da matéria orgânica; entre 160 e 180°C de 1 a 2h.

Úmido: autoclave; vapor de água sob pressão; coagulação das proteínas, destruição das células vegetativas e esporos; 121°C de 15 a 30min.

7-

Descreva detalhadamente as etapas de preparo de uma vidraria até sua utilização no laboratório. O processo difere caso a vidraria seja volumétrica? Em caso afirmativo, justifique.

Preparo de vidraria para utilização:

Lavagem (enxague na torneira, aplicação de solução detergente, enxague na torneira e por último na água destilada);

Esterelização (15min a 121°C na autoclave);

Identificação; e

Utilização. 8- Um laboratorista do laboratório de microbiologia do IFRN deve iniciar uma análise de coliformes em água, para tanto ele reservou 9 tubos de ensaio, 1 vidro (200mL) com tampa, pipetas de 1 mL. Qual deve ser o seu procedimento quanto à montagem e esterilização de cada vidraria?

Tubos de ensaio: caso não tenham tampa, colocar algodão hidrófobo (boneca) na abertura para tampar, juntar os nove numa lata, embrulhar com papel adequado (kraft, jornal, alumínio);

Vidro com tampa: tampar o frasco;

Pipetas: enrolar no papel adequado (kraft, jornal, alumínio); Autoclavar as vidrarias a 121°C por 15 min. Qual o objetivo do uso de técnicas assépticas no trabalho em laboratório de

9-

Microbiologia? Prevenir contaminação do meio, do manipulador e do ambiente ao máximo possível. 10- Qual técnica você utilizaria para o isolamento de bactérias? Justifique. Esgotamento por estriagem em quadrante; pois, com a diminuição da concentração de microorganismos que vai ocorrendo nas mudanças de quadrante, os microorganismos começam a formar colônias as quais é possível fazer uma contagem. 11- Quais os cuidados a serem tomados durante uma inoculação por estrias em placas de ágar?

Assepsia do ambiente (passar álcool na bancada, manipular próximo à chama);

Assepsia dos materiais (uso de vidrarias e meios estéreis, incinerar alça ou agulha e deixar esfriar um pouco antes da utilização);

Deixar a chama entre o manipulador e os materiais para evitar contaminação de ambos;

Inocular o meio estéril com a “mão leve” para não rasgar o meio;

Na mudança de quadrante esterilizar a alça ou agulha e continuar de onde parou na placa. 12- Quais os métodos utilizados para isolamento em placas contendo ágar? No seu ponto de vista qual o mais eficiente? Justifique Meios seletivos(inibe o crescimento de um determinado grupo ou espécie em detrimento de outro) e/ou diferenciais (permite diferenciação entre grupos ou espécies). O seletivo será mais interessante pois ali só vai haver crescimento dos organismos desejados. 13- Por que as placas de Petri devem ser incubadas invertidas na estufa? Não ocorrer troca de tampas e para não ocorrer condensação na tampa e caia na amostra. 14- Ao trabalhar na manutenção de uma bacterioteca, o laboratorista responsável detectou duas culturas, que originalmente estavam puras, contaminadas. Quais devem ser os cuidados a serem tomados, por ele, quando for reisolar as culturas? Usar meios seletivos para retomar a bactéria desejada, utilizar meios de estocagem e ter cuidado para fazer ocorrer contaminação ou troca de tampas com outros microrganismos. 15- O que são meios de cultura seletivos? São meios que inibem o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros. Num meio seletivo para Staphylococcus aureus ali só vai crescer este.

16- Para análise bacteriológica de uma amostra de leite foram preparados 220 mL do meio ágar contegem padrão, com a seguinte composição:

Extrato de carne

3,0

g

Peptona de caseína

5,0

g

Cloreto de sódio

5,0

g

Agar-agar

12,0

g

Depois de pronto constatou-se que os cálculos haviam sido efetuados para 220 mL, mas por engano os ingrediente foram dissolvidos em 240 mL. Como você procederia para ajustar este meio de cultura? Apresente os cálculos.

Componente

Qtd

Adição (g p/ 20 mL)

Cálculo

Resultado

Extrato de carne

3

g/220mL

Extrato de carne

3 x 20/220

0,27 g

Peptona de caseína

5

g/220mL

Peptona de caseína

5 x 20/220

0,45 g

Cloreto de sódio

5

g/220mL

Cloreto de sódio

5 x 20/220

0,45 g

Agar-agar

12

g/220mL

Agar-agar

12 x 20/220

1,09 g

17- Quais as etapas envolvidas na preparação de um meio bacteriológico?

Cálculo das quantidades;

Misturar a solução (se necessário aquecer, como o ágar);

Distribuição nas vidrarias.

18- Por que, quando se prepara um meio de cultura, o pH deve ser ajustado? Caso você desejasse o crescimento de Escherichia coli, que pH você escolheria para o seu controle? Justifique. Deve-se ajustar o pH devido ser este um fator extrinseco importante ao crescimento ótimo microbiano. No caso de bactérias, como a E. coli, o pH ótimo é próximo a neutralidade, ou seja, 7. 19- No preparo de um meio de cultura, o fabricante determina que seja pesado 34 g para 1000 mL de meio, no entanto, ao final do preparo o meio estava com 1250 mL. Que correções devem ser feitas para que o meio fique correto? Determine quantitativamente o erro. 20- Qual a diferença entre meio de cultura natural (complexo) e um meio sintético (quimicamente definido)? Defina-os e exemplifique.

Complexos: composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura);

Quimicamente definidos: composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. 21- Aponte no mínimo cinco fontes de erro no preparo de um meio de cultura. Pesagem de solutos incorreta, não aquecer o suficiente o ágar levando ao endurecimento, aquecer o ágar demais levando a condensasão de água na tampa, dissolução incorreta ou não aferir o pH.

22- Caso esteja trabalhando com uma espécie bacteriana fastidiosa, você pode utilizar o meio ágar nutritivo para o isolamento da mesma? Explique. Sim, ele vai auxiliar no “convencimento” das células a se nutrirem pela grande quantidade de nutrientes e por serem especificamente ideais para a bactéria se desenvolver mais. 23- Quais características culturais podem ser notadas no ágar nutritivo em camada alta? Mobilidade e relação com o oxigênio.