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Facultad de Odontología
Lic. Julio Turcios
Bioquímica
Integrantes Carné
Max Alejandro Carrillo200910847
María Fernanda Escobar 200910978
John Stephen Vernon 20092245
Yasmin Susana Orozco 200922263
Mayra Carlota Hernández 200922300
Cromatografía en Papel
Instrumentos y materiales: Papel alto en celulosa, Cámara
cromatográfica, Tijeras, Lápiz, Regla, H20, Tubos capilares, Aminoácidos
(Cis, Gln), Secadora, Ninhidrina, Acido Acético (CH3COOH), N-Butanol,
Pipetas (10 y 5 ml), Engrapadora, Beacker.
Procedimiento:
1. Se recubrieron las paredes internas de la cámara cromatográfica
con papel alto en celulosa y se cortó otro pedazo de papel alto en
celulosa, con unas medidas de 16.1x19 cm. A este papel ya
cortado le trazamos los siguientes márgenes:
Resultados:
Identificación de Proteínas:
Durante la identificación de proteínas con la reacción de
ninhidrina y la reacción biuret se anotaron los distintos cambios que se
observaron respectivamente durante el proceso, los cuales se describen
a continuación en los cuadros:
Reacción Biuret:
Reacción Ninhidrina:
Cromatografía en Papel:
Discusión de Resultados:
Identificación de Proteínas:
REACCIÓN BIURET:
Biuret
Agua:
El agua no cambió en ningún momento del procedimiento porque
no contiene ningún tipo de elemento orgánico y mucho menos
compuestos proteicos, por esta razón da negativo a la reacción de
biuret.
Gelatina
La geltaina es una mezcla coloide, incolora, translúcida,
quebradiza y casi insípida que se obtiene a partir del colágeno
procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con
agua. El colágeno es un compuesto proteico hecho sustancialmente de
prolina, hidroxiprolina y glicina. El reactivo biuret debería dar positivo,
debido a los componente peptídicos del colágeno presente en la
gelatina. El resultado del laboratorio fue un color morado claro, que
concuerda con lo que la teoría requiere, aunque se han hechos estudios
donde la gelatina da un color azul [1]. Por ende podemos decir que si se
hubiera dejado reaccionar por más tiempo o si se hubiera añadido más
gelatina, se hubiera obtenido el color azul.
Caseína:
La caseína es una fosfoproteína presente en la leche y en algunos
de sus derivados. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada
al calcio en un complejo que se ha denominado caseinógeno. El
resultado del laboratorio fue el cambio de coloración de levemente
blanco a un blanco opaco total. El resultado teórico esperado es un
cambio de coloración a un azul lechoso, que en nuestro caso no fue
azul, sólo lechoso. Deducimos que fue el hecho de solamente usar 20
gotas de caseína, el que produjo nuestro resultado: es posible que en la
solución de caseína no se alcanzó el límite mínimo (0.25 mg) de caseína
para que se llevara a cabo la reacción biuret [2].
Concordamos, también, en que posiblemente el factor tiempo
influyó en la manifestación de la reacción.
Albúmina:
La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción
en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su
vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. Lo
esperado en esta reacción es obtener un color violeta translucido. En la
práctica del laboratorio, después de 15 minutos de reacción, no se notó
ningún cambio convincente para afirmar que hay presencia de
proteínas. Sin embargo una observación efectuada 20 minutos después
de la primera observación, demostró un cambio de coloración
amarillento. Según la teoría, la reacción Biuret, un color amarillento
indica presencia de aminoácidos.
[1], [2] s.a. (2007). Prelab3: propiedades químicas de las proteínas. 05/05/2007. s.l.. Consultado el:
21/04/2010. Disponible en: http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.
[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el
23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO
%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.
Solución Problema 1:
Ésta era una solución desconocida en la cual se quería probar la
presencia o no de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración
nulo, lo que nos indica ausencia de proteínas. Esto no quiere decir que
no existiera aminoácidos en la solución, ya que la reacción biuret no
reacciona con aminoácidos sino que con enlaces peptídicos.
Solución Problema 2:
Al igual que en el problema 1, se quería probar la presencia o no
de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración a púrpura
translucido, lo que nos demuestra presencia de proteínas en solución.
Ninhidrina (2,2-Dihidroxindeno-1,3-diona)
Gelatina:
Como ya se mencionó anteriormente la gelatina es un compuesto
proteico, que en la reacción de biuret cambió de color por la presencia
de colágeno; sin embargo, en el procedimiento con ninhidrina la
muestra de gelatina no cambió de color, aunque la teoría dice que por
la presencia de prolina e hidroxiprolina, debería cambiar a una
tonalidad amarillenta o roja. Suponemos que esto sucedió debido a
problemas durante el goteo. Esto lo notamos porque el tubo de ensayo
de la gelatina presentaba un notorio volumen mayor que el de los otros
tubos de ensayo. Al ser una gran cantidad de gelatina y una cantidad
relativamente menor de ninhidrina, ésta última tuvo una saturación más
lenta para su reacción, dejando poco producto visible (lo que proveería
su notorio color positivo).
Caseína:
Como ya se sabe la caseína es un compuesto proteico presente
en la leche y sus derivados. En la práctica del laboratorio, la caseína
actuó tal y como lo dice la teoría; cambio de color a un azul-morado,
debido a la presencia de proteínas; y también cambió de estado
(debido al aumento de termperatura): se coaguló, esto indica presencia
de globulinas [3].
Albúmina:
Al hacerse la reacción con ninhidrina, la albumina cambió de un
color transparente a rojo sangre y además se coaguló. El cambio de
color indica la presencia de prolina e hidroxiprolina. La albúmina se
coagula por el calor, lo que confirma su identidad [3].
[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el
23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO
%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.
Cromatografía
Se recurrió al uso de Cromatografía en papel ya que es más fácil,
y rápido en su aplicación además de observación de las reacciones.
La preferencia en el uso del papel Whatman 1, se debe a su
característica de polaridad, ésta impide el rompimiento del papel.
La línea trazada más importante fue la inferior que media 2cm
(ver resumen), ésta nos daba la pauta de inicio de los aminoácidos.
Todos los trazos se hicieron a lápiz porque si se usaba lapiceros, debido
a su tinta orgánica, se hubiera reaccionado con los aminoácidos,
impidiendo la observación de ellos.
Las paredes internas de la cámara cromatográfica se revistieron
con papel alto en celulosa. Esto previene que la presión externa de la
cámara interviniera en el proceso cromatogáfico.
La fase estacionaria no toca la cámara cromatográfica porque
está saturada de agua (para la adhrencia) en sus paredes; si el papel de
la fase estacionarioa toca las paredes, o el papel que las recubre,
absorbe fácilmente agua y ya no se puede observar con claridad el
avance de los aminoácidos.
Al momento de sembrar la muestra se requirió el uso de capilares
para tener una muestra más exacta, pero su uso no era necesario ya
que podríamos utilizar un gotero.
El orden de las siembras de las muestras no afectaba nuestros
resultados, lo único importante era colocar la misma cantidad de
aminoácidos en cada punto, y no contaminar el papel de la fase
estacionaria.
La fase estacionaria se dobló hacia afuera para que las muestras
de los aminoácidos no entraran en contacto entre ellos (y así fuera más
fácil la absorción de la fase móvil) colocándole grapas en los extremos
para unirlos, porque si hubiéramos utilizado masking tape, se hubiera
despegado, rompiendo la estructura requerida de la fase estacionaria.
Al momento de realizar la fase móvil procuramos que la cámara
estuviera tapada para que no se contamine y no reaccionara con otro
compuesto.
Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase móvil, era
necesario colocarse guantes debido a los componentes químicos que
podrían afectar la mano. Era importante secar la fase estacionaria
porque se tenía que revelar con ninhidrina, disminuyendo así la
cantidad de los eluentes para evitar la reacción de los mismos.
Obteniendo así la coloración de los aminoácidos.
La Cisteína corrió mas debido a su bajo peso molecular, y la
Gluteína corrió menos debido a su alto peso molecular.
En la combinación de los aminoácidos se puede observar que su
recorrido es el promedio de los recorridos de la Cisteína y la Gluteína.
La Cisteína hizo que la mezcla de ambos aminoácidos corriera más pero
al mismo tiempo la Gluteína impidió que siguiera avanzando, esto
debido a las diferencias entre pesos moleculares.
Conclusiones:
• Para que se lleve a cabo una reacción como la de biuret revela
únicamente la presencia de proteínas y péptidos pequeños.
• La reacción de ninhidrina es más genérica que la de biuret.
Identifica aminoácidos y proteínas no por sus enlaces, sino por su
constitución química, lo cual le otorga un mayor poder de
identificación ante el biuret.
• Otros factores como el tiempo, temperatura y cantidad de
sustrato afectan la calidad de la reacción y resultados para la
identificación de proteínas.
• Dependiendo de la estructura primaria de cada proteína, la
manifestación en las reacciones puede tener ciertas variaciones
específicas.
• El tiempo es indispensable en la cromatografía ya que con
tiempos de corrida cortos no se aprecian claramente los cambios
relevantes.
• El método de identificación por cromatografía en papel es efectivo
ya que los elementos utilizados como eluentes eran ideales para
correr en el papel alto en celulosa y disolver los aminoácidos;
además.
• Conforme avanza el tiempo, la corrida del aminoácido variará
dependiendo de su peso; a mayor peso, más lento el corrimiento,
a menor peso, más veloz.
• Las interacciones entre el solvente y soluto dieron a mostrar las
características de cada aminoácido.
Bibliografía: