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TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL- monografia

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UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO ESPECIALIZAÇÃO latu sensu PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL

Marcelo Mendonça Muzeti e Renato Paganelli Jaquetto

Rio de Janeiro, nov. 2007

RENATO PAGANELLI JAQUETTO E MARCELO MENDONÇA MUZETI Alunos do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em Bovinos

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL

Trabalho monográfico de conclusão do curso de Especialização latu sensu

Produção e Reprodução em Bovinos (TCC), apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção do título de Especialista em Produção e Reprodução em Bovinos, sob a orientação do Prof. Msc. Athos de Assumpção Pastore. Rio de Janeiro, NOV. 2007

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL

Elaborado por MARCELO MENDONÇA MUZETI Aluno do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em Bovinos

Foi analisado e aprovado com grau: ...................................

Rio de Janeiro, ____ de _______________ de ______.

___________________________ Membro ___________________________ Membro ___________________________ Professor Orientador Presidente

Rio de Janeiro, nov. 2007

Dedicamos

este

trabalho

de

Revisão

Bibliográfica a minha família que me deu apoio durante a realização desta revisão e aos meus amigos.

“O pior dos defeitos é imaginar-se isento deles”. Bottach

Sumário

1 – Introdução.....................................................................................................................01 2 – Histórico .......................................................................................................................04 3 – Programa de transferência de embrião, seleção de doadoras e receptoras ...................07 3.1 – Programa de transferência de embriões...............................................................07 3.2 – Seleção de Doadoras e Receptoras ......................................................................08 4 – Ciclo Estral ...................................................................................................................09 5 – Sincronização ...............................................................................................................11 6 – Superovulação ..............................................................................................................13 7 – Coleta............................................................................................................................15 8 – Fecundação in vitro ......................................................................................................17 8.1 – Capacitação de espermatozóide...........................................................................17 8.2 – Fertilização de oócitos .........................................................................................18 8.3 – Critérios para a FIV .............................................................................................19 8.4 – Criopreservação ...................................................................................................19 8.5 – Maturação com água de coco ..............................................................................19 9 – Inovulação ....................................................................................................................21 9.1 – Cirúrgica pelo flanco ...........................................................................................21 9.2 – Fundo de saco vaginal .........................................................................................21 10 – Eficiência da técnica...................................................................................................23 11 – Agentes infecciosos na reprodução voltados a inovulações (T.E.) ............................24 11.1 – L.E.B. – Leucose Enzoótica Bovina..................................................................24 11.2 – I.B.R. – Rinotraqueíte infecciosa bovina...........................................................24 11.3 – Diarréia bovina vírus .........................................................................................25

11.4 – Língua Azul (bluetongue)..................................................................................25 11.5 – Brucelose ...........................................................................................................26 11.6 – Leptospirose ......................................................................................................26 12 – Condições sanitárias internacionais básicas para comercialização de embriões........28 12.1 – Normas recomendadas por O.I.E., F.A.O., e O.M.S. (Código, 1982)...............28 13 – Aspectos éticos da biotécnica de reprodução .............................................................30 14 – Planos futuros da reprodução .....................................................................................32 15 – Conclusão ...................................................................................................................34 16 – Referências Bibliográficas..........................................................................................35

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1 - Introdução
Segundo Silva (2000), sob a ótica biológica todo ser vivo nasce, cresce, reproduz e morre. Neste aspecto, a reprodução representa a continuidade das espécies e seus domínios sobre alguma coisa, seja um território, o alimento, conquista passadas, evolução e desenvolvimento. Sem a capacidade para se reproduzir,

dificilmente estas metas seriam alcançadas e transmitidas ás gerações futuras. Esta linha de raciocínio vale para todas as espécies existentes neste planeta Terra, planeta em constante evolução, cujo ser dominante, o homem, busca o seu bem estar como para sua própria

sobrevivência. Ciente do que e importante para si, o homem aproveita-se da natureza e dos conhecimentos acumulados durante gerações para desenvolver ciência, capazes de lhe garantir o domínio completo sobre determinados

fenômenos evolutivos que ele via acontecer e que, em muitos casos, tardou a compreender. A partir da compreensão dos fatos é que se pode partir ao conhecimento e, principalmente, buscar metodologias que possam acelerar certos

fenômenos, que pela evolução natural tardariam milhares de anos para se tornar realidade. Assim aconteceu com os conhecimentos sobre a reprodução, um dos pilares da existência dos seres vivos sobre a Terra. Ate compreender que da união de dois gametas (masculino e feminino)

surgiria um zigoto e a partir das sucessivas divisões celulares este se diferenciava e se tornava um ser vivo completo, igual ao de sua espécie e com características de seus pais, muito tempo se passou. São muitas as razões pelas quais este homem tardou tanto a compreender um fenômeno tão simples. Entre elas, o medo do desconhecido, motivos religiosos ou mesmo a falta de visão do futuro de certos homens que fazem ciência. A partir do momento em que o homem venceu em partes estas barreiras e vieram a luz do conhecimento fatos e fenômenos que tornam hoje a vida mais fácil, é que podemos explicar melhor o mecanismo de nossa existência. Ao desvendarem a estrutura dos ácidos nucléicos e possibilitar o entendimento do código genético, Watson & Crick em 1953 davam impulso para o desenvolvimento de muitas ciências relacionadas com vida, entre elas a reprodução, iniciado em 1856 por Mendel, pai da genética e autor das leis da hereditariedade. Assim constantemente evoluindo e diante de tantos fatos novos que estão acontecendo e desencadeados pelos avanços biotecnológicos, nos perguntamos: quais serão os desafios atuais da reprodução como ciência e como eles podem ser utilizados como instrumento de maximização da produção animal? Como observado por Esper (1998), a necessidade de pesquisa para aumentar a eficiência na produção de bovinos tem sido sentida em todo o mundo e, em alguns paises, adquirida certa prioridade.A atual população mundial excede 5,3 bilhões e cresce 90 milhões por ano (1.8%). Este crescimento exerce profundo efeito sobre a necessidade de produtos de origem animal. Recentemente novas tecnologias tem sido incorporadas objetivando a exploração de animais domésticos.A produção in vitro de embriões bovinos em numero substancial e a baixo custo já é uma realidade. O desenvolvimento efetivo de métodos não cirúrgicos para o recolhimento e transferência de embriões em bovinos constituiu-se num importante estagio na exploração comercial da tecnologia da transferência de embriões. O Brasil inicia o novo milênio como o país com maior potencial de crescimento de carne bovina do mundo. Produzindo ecologicamente carne magra com qualidade a baixo custo, torna-se um vendedor potencial para os países de primeiro mundo, os

quais veêm passando por sérios problemas no setor pecuário (vaca louca e aftosa na europa) (LOBO et al., 2001). A biotecnologia, dentro do contexto das tecnologias de processo ou de produto, utiliza técnicas de biologia molecular e ou celular visando a geração de processos, como os agroindustriais com o fim de obter índices elevados de produtividade de bens e serviços (RODRIGUES & RODRIGUES, 1999). A técnica de transferência de embriões em bovinos ganha, a cada dia, mais espaço dentro da pecuária nacional. Neste contexto, salienta-se o aspecto de que uma fêmea de elevado padrão zootécnico pode ser utilizada de forma mais racional, fornecendo grande número de descendentes em um curto espaço de tempo (COSTA et al., 1999). De acordo com Fernandes (1999), a técnica de transferência de embriões (T.E.) em bovinos vem se desenvolvendo rapidamente e com ela surgem novas perspectivas para reprodução e do melhoramento animal.

2 - Histórico
De acordo com Rodrigues (2001), o primeiro experimento de coleta e transferência de embriões mamíferos (coelhos) foi por Walter Heaper (1855-1929), em Cambridge (UK), quando em 1890 coletou embriões do útero de doadora e os transferiu com sucesso para o útero de uma receptora.O objetivo do seu experimento era examinar, ate que ponto, o ambiente uterino da receptora poderia influenciar ou alterar o fenótipo dos embriões. Anteriormente, a invenção do microscópio pelo holandês Antoni vam Leewenhoek (16321730), propiciou durante os séculos dezessete e dezoito a discussão, nos círculos acadêmicos, sobre a geração dos animais, que tem no livro Exercitationes de geratione animalium de autoria do medico inglês Willian Harvey (1578-1657), o postulado que pode ser considerado a fronteira de uma nova época de idéias: “Tudo que é vivo provem do ovo”. A publicação em 1672 de Reinier de Graaf (1641-1673), DE mulierum organis generationi inserventibus, onde são descritos no ovário, os folículos (que hoje levam seu nome), seguida pela observação e a descrição dos espermatozóides por Leewenhock em 1679, permitiram o florescimento de uma acirrada discussão a cerca da geração dos animais, com a teoria da pré–formação tendo de um lado os ovistas e de outro os espermistas. De acordo com os pré-formistas o indivíduo já existia na sua forma adulta, necessitando para o seu crescimento intra-uterino que a sua forma definitiva fosse sendo aberta ou desdobrada. A localização destes indivíduos pré-formados, transmitidos de geração a geração, se no ovário ou no testículo, foi o moto para acaloradas discussões acadêmicas durante quase dois séculos. A epigenia tal qual a conhecemos hoje, onde a geração de um novo é o produto da fecundação do óvulo pelo espermatozóide, com o posterior crescimento e diferenciação no útero materno é o fruto desta polêmica cientifica. Em 1949 a organização da Unidade de Reprodução Animal no Instituto de Pesquisa Agrícola em Cambridge, com o objetivo de estudar as possibilidades do emprego da transferência de embriões nos programas de seleção animal, permitiu um grande impulso ao desenvolvimento da área. Em 1951 foi reportado nos USA por Willet e colaboradores o nascimento do primeiro bezerro produto da transferência de embriões. Neste período as grandes barreiras eram a ausência de procedimentos adequados de estimulação ovariana, de técnicas eficientes para a coleta, a transferência e a manutenção dos embriões fora do ambiente uterino. Durante as décadas de 60 e 70 o grupo de Cambridge, liderado por E.J.C.

Polge e L.E.A Rowson realizaram os experimento que tornaram os procedimentos com embriões bovinos passiveis de serem realizados nas propriedades rurais. Na metade dos anos 70 teve início no Canadá e nos USA o emprego comercial desta biotécnica de reprodução (Tab.1), sendo a Alberta Liverstock Transplant a primeira companhia a oferecer serviços de transferência de embriões. Neste período, em 1974, foi fundada em Denver, no Colorado, a Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS), que hoje conta com cerca de 900 associados, representando mais de 40 diferentes países.

Tab. 1. Histórico da Transferência de Embriões. Ano 1970 1975 1980 1985 Número de prenhezes 0 4000 20000 50000 a 100000 Causa Somente experimental Introdução de raças exóticas Sincronização do ciclo estral Transferência via cervical; Congelação de embriões

Fonte: (Rodrigues, J. L.) A reunião anual da IETS constituiu-se no fórum das discussões técnicas sobre os mais diferentes aspectos das biotécnicas da reprodução, permitindo a troca de experiências da comunidade acadêmica com os colegas que exercem atividade profissional nas propriedades. No Brasil, os primeiros experimentos com embriões bovinos foram realizados pelo Dr. João Carlos Giudice em 1973 na Cabanha Azul, no município de Quarai, no Rio Grande do Sul. Ao retornar de uma viagem científica à Europa, o Dr. Giudice organizou um programa de coletas cirúrgicas de embriões, onde foram realizadas tentativas de obtenção de embriões viáveis, mas em virtude das dificuldades técnicas encontradas, este objetivo não pôde ser alcançado. Passados 5 anos, o desenvolvimento da técnica permitiu ao Dr. Jorge Nicolau realizar na fazenda experimental São Pedro, em Sorocaba, São Paulo, a primeira coleta cervical e transferência por laparotomia, resultando no nascimento do primeiro bezerro T.E. brasileiro, que recebeu o nome de Eureka. A partir desse momento, multiplicaram-se as equipes envolvidas com a tecnologia de embriões, colocando o Brasil como o primeiro país, fora do eixo Europa/América do Norte em números absolutos de embriões transferidos anualmente, sendo que em 1999 foram transferidos 78 mil embriões. O maior número é realizado nos estados da Região Sudeste com bovinos da raça Limousin, Simental e Holandês. Seguindo-se os estados do Paraná, Mato Grosso do Sul e Goiás, onde estão localizados o

maior número de centros e equipes que desenvolvem e aplicam a tecnologia. Atualmente a raça Limousin é a que mais cresce no número de embriões transferidos, tendo localizado durante o ano de 1999 a transferência de 14000 embriões. Em 1986 fundou-se a Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, hoje contando com cerca de 450 associados, que de maneira similar à congênere internacional, proporciona o ambiente para as discussões sobre os avanços da área de conhecimento e as possibilidades do emprego das biotécnicas de reprodução no Brasil.

3 – Programa de Transferência de Embriões, Seleção de Doadoras e Receptoras 3.1 – Programa de Transferência de Embriões

Segundo Rodrigues (2001), em termos gerais, podemos considerar os seguintes aspectos para a organização de um programa de transferência de embriões: a) Recursos Humanos: Equipe com experiência em transferência de embriões; Pessoal da propriedade treinada.

b) Recursos Materiais: Equipamento; Material permanente; Material de consumo.

c) Propriedade: Alimentação; Manejo; Sanidade; Programa de seleção; Qualidade da receptora.

d) Animais: Doadoras; Sêmen ou reprodutores; Receptoras.

3.2 – Seleção de Doadoras e Receptoras

De acordo com Rodrigues (2001), é de fundamental importância a escolha adequada das doadoras e receptoras para o programa. Na seleção das doadoras podemos avaliar as seguintes características: Genótipo: usualmente, realiza-se a cariotipia da doadora, excluindo-se do programa aquelas fêmeas que apresentarem qualquer tipo de anomalia

cromossômica. Dentro das possibilidades, faz-se uma análise dos ascendentes e descendentes, quanto à ocorrência de defeitos com origem hereditária. Fenótipo: a doadora deve possuir um fenótipo considerado superior dentro da raça, levando-se também em consideração a sua habilidade em transmitir estas características aos seus descendentes. Saúde Geral: a constatação à inspeção e ao exame clínico geral de um animal sadio é indispensável para a obtenção dos resultados esperados. Saúde Genital: órgãos genitais sadios que executem as funções fisiológicas do ciclo estral dentro dos padrões normais são exigências que o Médico Veterinário deve examinar com rigor a fim de poder selecionar doadoras com potencial de produção de embriões viáveis compatíveis com o número médio (5/colheitas) descrito para a espécie bovina. Na avaliação das receptoras, os itens saúde geral e saúde genital descritos acima são determinantes do percentual de prenhez a ser obtido no trabalho. Propriedades bem organizadas e com bom manejo dos animais, normalmente obtêm índices de prenhez semelhantes aos observados em propriedades dos países desenvolvidos.

4 – Ciclo Estral
De acordo com Hafez (1995) e Rodrigues (2001), o emprego da transferência de embriões exige o domínio do ciclo estral, da função ovariana e da folículogênese. O ciclo estral bovino é definido como o período compreendido entre dois estros, tem duração média de 21 dias, considerando-se fisiológica variações entre os 18 e 24 dias. As diferentes fases em que o ciclo estral pode ser caracterizado são: Estro: é a fase em que a fêmea aceita ser copulada pelo macho, dura em média 18 horas. O endométrio encontra-se em proliferação, sendo sinais característicos a fêmea deixar-se montar, o edema da vulva e o corrimento vaginal mucoso. No aspecto endocrinológico, existe uma dominância da ação dos estrógenos, produzidos pela teca interna do folículo, que estimulando o centro sexual no hipotálamo, são os receptores pelas manifestações clínicas do estro. No início desta fase ocorre o pico de LH, que é responsável pelo final da maturação do ovócito e pela ocorrência da ovulação. Metaestro: é a fase compreendida entre o final do estro e o diestro, dura em média 5 dias nos bovinos. A ovulação, a fecundação e o desenvolvimento embrionário até o estágio de mórula não compacta são eventos que ocorrem no metaestro. A luteinização das células da fossa ovulatória dá origem ao corpo lúteo, responsável pela produção de progesterona, que aumentando progressivamente os seus níveis séricos, alcança um platô a partir do 6º dia pós-ovulação. Os níveis circulantes de estrógenos decrescem após a ovulação e sob a influência da progesterona, o endométrio passa da fase de proliferação para a fase de secreção, preparando-se para receber o embrião em desenvolvimento. Diestro: é a fase mais longa no ciclo estral, dura em média 10 a 20 dias e caracteriza-se pela ação da progesterona. O útero apresenta-se relaxado e em um dos ovários está presente o corpo lúteo. Ao redor do 16º dia do ciclo estral ocorre a liberação de prostaglandina pelo endométrio que, chegando ao ovário através da anastomose da veia uterina com a artéria ovárica, promove a luteólise, o que caracteriza o final do diestro. Próestro: tem início a partir da luteólise, ocorrendo entre o 17º e o 20º dia do ciclo estral, onde acontece os eventos que permitirão que o folículo dominante siga desenvolvendo-se e produzindo estrógeno, fazendo com que a fase de secreção do endométrio, presente no diestro, assuma as características de proliferação. O próestro constitui-se em uma preparação dos órgãos genitais para o estro, observando-se gradualmente

o aparecimento dos sinais clínicos que nos permitem identificá-lo. O limite entre o próestro e o estro é o momento em que a fêmea passa a aceitar a monta. A função ovariana nos bovinos tem início ainda no período fetal e estende-se, após a puberdade, até idades que podem atingir aos 15 anos. Durante o desenvolvimento fetal sob a influência dos hormônios maternos, os ovários do feto apresentam crescimento e atresia folicular. Do nascimento à puberdade, na ausência de função do hipotálamo e da hipófise, as gônadas femininas permanecem em repouso. Após a puberdade, quando o sistema nervoso central e a hipófise iniciam a liberação do GnRH e das gonadotrofinas (FSH e LH), respectivamente, os ovários passam a funcionar, realizando um conjunto de atividades, as quais denominamos ciclo ovariano. Nas diferentes fases do ciclo estral existem nos ovários um número de folículos entre 200 e 400 que se encontram em fase de crescimento, destes 25 a 50 são folículos terciários, dos quais um será selecionado como folículo dominante, adquirindo as características para realizar a maturação e a ovulação.

5 – Sincronização
Segundo Rodrigues (2001), a necessidade da sincronização dos ciclos de diferentes doadoras faz com que um período de tempo maior seja necessário para que as atividades possam ser realizadas de forma adequada. Usualmente as doadoras recebem uma primeira dose de prostaglandina e onze dias após uma segunda, o que proporciona à indução simultânea dos estros na totalidade dos animais envolvidos no programa. O tipo de hormônio vai determinar a forma e a dose de administração, por exemplo o eCG por tratar-se de uma proteína de alto peso molecular, tem uma meia vida longa, o que facilita sua utilização, pois todo tratamento resume-se a uma única aplicação intramuscular da dose total estipulada. Ao contrario os hormônios obtidos. Atualmente a utilização de progestágenos na forma de implantes auriculares ou espirais intravaginais permitem uma sincronização com maior controle do ciclo estral das doadoras, o que proporciona um trabalho mais confortável ao medico veterinário, no que diz respeito a escolha do calendário de datas para realizar as atividades de colheita e transferência de embriões. De acordo com Hafez (1995), para uma transferência de embriões bem sucedida, é necessário a sincronização entre o estágio do ovo e trato reprodutivo da receptora. Isto é realizado usualmente pela seleção de receptoras que estiverem em cio ao mesmo tempo que a doadora, seja naturalmente ou em conseqüência de sincronização do cio. Para resultados ótimos, a receptora deve estar em cio com um limite de 12 horas em ralação à doadora. A taxa de gestação cai drasticamente se a diferença for de 24 horas em vacas. As receptoras de embriões congelados ou armazenados em baixa temperatura devem ser selecionadas para estarem em sincronia fisiológica com o estágio de desenvolvimento do embrião. Assim, se embriões estiverem congelados por 2 dias, eles deverão ser transferidos para receptoras que estiverem no cio 2 dias após a doadora. As perdas de gestação por transferência não sincronizadas são provavelmente devido à colocação dos embriões em ambiente adversos, ou à inabilidade de embriões não sincronizados para exercer uma ação luteotrófica sobre o corpo lúteo da receptora. Segundo Costa et al. (2000), as melhores taxas de sincronização de cio em raças zebuínas são obtidas quando são considerados algumas particularidades da fisiologia destes animais, como por exemplo a menor duração do cio e a menor intensidade de manifestações dos sinais do cio, os animais ovulam em menor tempo após o início do cio, o

padrão do crescimento folicular e a secreção e metabolismo de estrógeno são diferentes dos observados em espécies européias e o pico de LH após a sincronização de cio é menor do que aquele observado em animais Bos taurus. Etiproston é um análogo sintético de prostaglandina F2α que possui dois átomos de oxigênio no C15. Sua molécula é muito estável, possuindo meia vida maior que a PGF2α natural. Além do efeito luteolítico, este análogo tem uma forte ação sobre a contração uterina, o que o destaca dos demais.

6 - Superovulação
Rodrigues (2001), descreve que são utilizados 3 preparos hormonais para a indução da ovulação múltipla na fêmea bovina: a) FSH: hormônio folículo estimulante obtido de extrato de hipófise suína ou ovina. b) ECG: gonadotrofina coriônica eqüina, obtida a partir do soro de éguas prenhes entre os 70 e os 120 dias de gestação. c) HMG: gonadotrofina da menopausa humana, extraída da urina da mulher em menopausa. Como objetivo de avaliar a resposta a superovulação vacas da raça Nelore foram tratadas com 25 mg de FSH-P, em oito sub-doses decrescentes com intervalos de 12 horas. Em dois animais não foi possível recuperar estruturas, o que resultou em 90% de índice de recuperação. As colheitas entre 6.5 e 7.5 dias após o estro das doadoras, sendo recuperadas 162 estruturas (media de 8.1 por doadora), com 31 não fertilizadas (media de 1.55 por doadora). Os embriões foram classificados como excelentes (64), bons (24), regulares (15) e degenerados (23). Nas condições deste experimento, os resultados permitem concluir que a dose de 25mg de FSH-P é eficaz para induzir superovulação em vacas Nelore embora a falta de padronização nas respostas ao tratamento superovulatórias ainda é um obstáculo a ser vencido para melhor eficiência do processo (Molina & Saturnino, 1993). De acordo com Hafez (1995), os processos atuais, a superovulação aumenta a produção de embriões normais em aproximadamente 5 vezes na vaca, porém levemente em porcas e éguas. Em todas as espécies existem extremas variações individuais nas respostas. Muitas doadoras não produzem nenhum embrião normal, enquanto que porcas produzem grandes números. Por exemplo, aproximadamente metade dos embriões recuperados de um grande grupo de doadoras superovuladas são tipicamente produzidos por um quarto das doadoras. Infelizmente não é possível predizer como irá responder uma determinada doadora; este é o maior obstáculo para uma aplicação mais satisfatória.

7 – Colheita de embriões.

De acordo com Frare (1997), desde que se iniciou a transferência de embriões, busca se a praticidade e economia da técnica, além da intenção de maximizar o uso de doadoras e receptoras envolvidas no processo da T.E., pois estes animais ficam na maioria das vezes ociosos por muito tempo a espera dos trabalhos de coleta e transferência dos embriões. Rotineiramente, as coletas de uma mesma doadora ocorrem a intervalos de 60-90 dias como indicados por vários autores e técnicos, espaço ate então raramente reduzido. Em testes coletados até 8 vezes seguidas com intervalo de 33 a 42 dias, de acordo com o programa estabelecido para a propriedade. “Há casos em que optamos não por 35 mas por 42 dias, de intervalo entre as coletas o que serve para aproveitar a re-sincronia das receptoras (o segundo cio natural após a transferência) que não contraíram gestação na transferência anterior”. Os resultados obtidos não são, ao seu modo de ver estatisticamente diferente entre os dois sistemas (intervalo 60-90 e 33-42). As dificuldades em emprenhar os animais após uma série grande de coletas seguidas a intervalos de 35 dias, tem-se mostrado até o presente momento similares as dificuldades apresentadas no esquema 60-90 dias. Também até o presente momento não se observou alterações hormonais perceptíveis externamente nas doadoras envolvidas, nem alterações de comportamento reprodutivo. Efeitos negativos para a técnica poderão surgir com decorrer do tempo, todos os proprietários dos animais envolvidos optaram por continuar os programas no mesmo ritmo, pois a compensação em ganho de tempo tanto para as doadoras como para as receptoras é muito grande e o resultado econômico dos programas realizados também se demonstram altamente favoráveis a continuidade da técnica.

8 – Fecundação in vitro
Hafez (1995), afirma que os primeiros estudos sistemáticos de fertilização de ovos de coelha in vitro por espermatozóides recuperados do trato feminino foram comunicados pela primeira vez em 1954. O desenvolvimento e aplicação da FIV em animais domésticos foram revistos intensivamente em 1981. A FIV é significado prático para obter grande número de embriões para investigações científicas ou para transferência subseqüente a receptoras apropriadas.

8.1 – Capacitação de espermatozóide

Os espermatozóides não atingem sua capacidade total de fertilização até depois de serem transportados no trato reprodutivo feminino. Os espermatozóides devem passar por novas modificações fisiológicas antes de poderem penetrar na zona pelúcida e fundirem-se com o vitelo dos ovos. O desenvolvimento de condições definidas em que a fertilização pode tomar lugar fora do organismo aumento rapidamente a profundidade de compreensão da capacitação espermática e a da reação do acrossomo dos espermatozóides a maior parte dos experimentos iniciais com FIV não foram bem sucedida, porque os espermatozóides não estavam capacitados, termo que se refere a modificações dos espermatozóides ejaculados no trato reprodutivo feminino, tornando-os capazes de fertilizar os oócitos, o mecanismo molecular de capacitação é desconhecido. Uma teoria é que as membranas da célula espermática não capacitada são especificamente estabilizadas para proteger contra danos no trato reprodutivo feminino e que a capacitação é o inverso desta estabilização. Uma outra é que a capacitação consiste na remoção de inibidores das enzimas acrossômicas. Em cada espécie, a capacitação é completada pelo maior tempo que os espermatozóides entram em contato com os oócitos. Uma provável explicação da capacitação invoca o fator de captação, o qual julga-se seja produzido nos epidídimos ou glândulas sexuais acessórias do macho e juntado aos espermatozóides.

8.2 – Fertilização de oócitos

Oócitos para FIV são obtidos usualmente das trompas logo após a ovulação, porém podem também ser conseguidos de folículos ou da superfície do ovário. Enquanto que os espermatozóides podem penetrar os oócitos com idade variável do estágio primário imaturo antes do rompimento da membrana nuclear até oócitos envelhecidos recuperados a mais de um dia após a ovulação, o desenvolvimento embrionário normal não resulta da fertilização de oócitos em qualquer extremo. Vários tipos de placas de cultura tem sido utilizada para a FIV (HAFEZ, 1995). Segundo Rodrigues & Rodrigues (2000), os experimentos realizados a partir de 1980 na Georgia (USA) pelo grupo liderado pelo professor Brakett, proporcionaram avanços consideráveis às técnicas de produção de embriões bovinos no laboratório, permitindo sua utilização em associações aos programas de ovulação múltipla e de transferência de embriões (MOET) com o objetivo de subsidiar programas de seleção animal. As diferentes considerações e propostas sobre o emprego do MOET permitiram o desenvolvimento de novas idéias no âmbito dos testes de progênie e dos programas de seleção animal, que tem como base famílias formadas por irmãos inteiros e meio irmãos. Além dos aspectos envolvendo os programas de seleção animal, a produção in vitro de embriões proporcionou meios para o desenvolvimento de experimentos na área da micromanipulação envolvendo as particularidades ligadas à sexagem, a clonagem e a produção de animais transgênicos. De acordo com Esper (1998), várias características e mudanças que ocorrem no embrião tem sido exploradas com intuito de se obter metodologia que possibilite uma variação segura do "status" do embrião a ser transferido como: número de células, corantes florescentes, testes bioquímicos, cronologia pelo estágio, critério morfológico e análise estrutural.

8.3 – Critérios para a FIV

Conforme Hafez (1995), existem vários requisitos para a fertilização in vitro tais como: 1. Maturação nuclear e citoplasmático de gametas nas gônadas

2. Desenvolvimento da fertilidade de gametas nos tratos reprodutivos masculino e feminino 3. Um número ótimo de espermatozóides fertilizáveis com motilidade rigorosa 4. Um óvulo fertilizável com um primeiro corpúsculo polar

8.4 – Criopreservação

A principal vantagem da criopreservação de embriões ao invés dos espermatozóides ou oócitos é que o embrião possui o genoma completo, que pode ser transferido para uma mãe adotiva de fundo genético conhecido ou não, sem o risco de modificação genética. A criopreservação de embriões facilita os centros de criação animal de possuir maior variação de estoques, inclusive para o uso não imediato, salvando deste modo espaço e dinheiro, assim como oferecendo proteção contra perdas por fogo, doenças e outros riscos. Linhagens consangüíneas, mutações e combinações genéticas especiais podem ser preservadas; este é um recurso valioso para a pesquisa avançada em genética animal. Além disso, padrões de pedigree genéticos podem ser estabelecidos e testados para uma direção genética em gerações subseqüentes.

8.5 – Maturação com água de coco

Segundo Blume, et al. (1997), a água de coco mostrou-se eficiente como meio de cultivo de embriões murídeos frescos e congelados em diferentes estágios de desenvolvimento por um período de até 48 horas (Blume & Marques Jr., 1994). O presente trabalho foi o de avaliar a água de coco in natura e enriquecida na maturação de ovócitos bovinos, classificados quanto ao tipo de envoltório nuclear, levando-os a FIV e analisando os resultados da clivagem. As taxas de maturação e o percentual de clivagem na FIV, mostram que a água de coco pode ser usada como meio de maturação in vitro de ovócitos bovinos.

9 - Inovulação
É o ato de deposição dos embriões no trato reprodutivo da fêmea receptora. Duas técnicas são utilizadas:

9.1 – Cirúrgica pelo flanco

A técnica cirúrgica pelo flanco é a mais utilizada e é ainda empregada por grupos em atividade por apresentar as seguintes: Melhor controle sobre a inovulação Deposição do embrião no local apropriado. Maior índice de prenhez

Para utilização na propriedade rural esta técnica apresenta algumas limitações: -necessidade de laparotomia -maior custo por embrião transferido -maiores recursos humanos As equipes que utilizam a cirurgia no flanco têm como argumento a maior eficiência e constância nos resultados obtidos.

9.2 – Fundo de saco vaginal

A cirurgia no fundo de saco vaginal, que era realizada pelo grupo de trabalho da STRACTA em Brasília, consiste numa incisão no fundo do saco vaginal, com a exteriorização do corno uterino através da vagina. Os resultados obtidos são semelhantes aos descritos com a cirurgia no flanco, porém não se aconselha o uso desta técnica com novilhas pela dificuldade de exposição dos cornos uterinos. A sincronização dos ciclos

estrais da doadora com a receptora é fundamental para a obtenção de bons resultados (Rodrigues, 2001). Hafez (1995), afirma que os resultados de transferência de embriões não cirúrgica foram resumidos por Foote e Onuma (1970). Com a técnica desenvolvida Sugie (1965), a cérvix não é ultrapassada. Corretamente o método mais comum é depositar os ovos no útero através da cérvix com uma palheta de inseminação artificial, 6 a 12 dias após o cio (SREENAN, 1978; TROUNSON et al., 1978a).

10 – Eficiência da Técnica
O trabalho de rotina mostra a necessidade de um período entre 6 e 12 meses para a organização da infra-estrutura, tanto material como humana para o desenvolvimento de um programa de

transferência de embriões na propriedade rural. Depois da solução dos problemas básicos, é também importante o estabelecimento de padrões para estimar a relação custo benefício. Nos programas de iniciativa particular e individual, que são a maioria absoluta dos existentes no Brasil, podemos sugerir 3 critérios:

a) Coletas/Doadora/Ano: pode-se realizar de 5 a 6 coletas de embriões por doadora por ano. Atualmente existem técnicas de aspiração folicular, que já permitem a utilização com a maior freqüência de fêmeas doadoras.

b) Embriões viáveis/Coleta: a espécie bovina por proporcionar uma média de 5 embriões viáveis por coleta, esta pode variar com programas de superovulação onde são selecionadas doadoras com grande número de ovulações. Médias abaixo de 3 embriões viáveis por coleta inviabilizam o processo.

c) Prenhez/Coleta: é a relação que mostra com maior objetividade a eficiência do método como um todo. Os grupos de trabalho com excelente qualidade de rotina consegue em média 2,6 bezerros por coleta. Nas condições de trabalho na propriedade encontrados no Brasil, resultados médios de 1,8 a 2,3 bezerros por coleta são considerados suficientes para tornar o emprego do método econômico (RODRIGUES, 2001).

11 – Agentes infecciosos na reprodução voltado a inovulações
11.1 – L.E.B. – Leucose Enzoótica Bovina

O vírus da LEB é transmitido horizontalmente, da mesma forma que muitos outros agentes. A resposta sorológica e o transporte de leucócitos com o vírus perduram ao longo da vida dos animais infectados. Dessa forma, os fluídos uterinos podem estar infectados por causa da contaminação sanguínea. Entretanto, não há evidência de que a T.E., a partir de doadoras infectadas cause infecção das receptoras ou resulte no nascimento de bezerros infectados. Assim, as pesquisas conduzidas por

BOUILLANT et al. (1981) e HARE et al. (1985), indicaram que embriões colhidos de doadoras infectadas ou expostos in vitro ao vírus da LEB não causaram infecções em receptoras e em suas crias (VIANA, 1990).

11.2 – I.B.R. – Rinotraqueíte Infecciosa Bovina

O vírus da IBR causa problemas respiratórios e reprodutivos em bovinos. O animal infectado pode manter o estado de portador especialmente quando submetido ao estresse ou quando tratado experimentalmente com corticóides. Há descrição do isolamento do vírus a partir do corpo lúteo, do tecido ovariano do oviduto e do infundíbulo. Alguns estudos demonstram a capacidade do vírus de aderir à zona pelúcida. Nesse caso há necessidade de tratamento do embrião com tripsina e ou antisoro específico para assegurar a não infecção do mesmo. Nesse sentido, SINGH et al. (1982b), expuseram embriões bovinos ao vírus da IBR (106-8 TCID 50/ml*) e mesmo com 10 lavagens não conseguiram eliminar os

vírus aderidos na zona pelúcida. Entretanto nos 23 embriões tratados com antisoro por uma hora e nos 32 tratados com tripsina (0,25%), por um a dois minutos, não foi isolado este agente. Em outros experimentos, estes autores escolheram 63 embriões de 22 doadoras infectadas experimentalmente com o vírus de IBR. Após o tratamento com tripsina os embriões foram transferidos para 45 receptoras, resultando em 21 gestações. Todas as receptoras e as crias nascidas foram negativas para o vírus (SINGH et al., 1983).

11.3 – Diarréia Bovina Vírus

A diarréia a vírus pode apresentar-se clinicamente como uma doença aguda com diarréia e baixa mortalidade ou como uma doença grave onde predominam lesões das mucosas do trato digestivo, com alta mortalidade. Há casos de animais infectados de forma persistente que não apresentam respostas sorológicas detectáveis. Procura-se então fazer o isolamento do vírus nos líquidos uterinos. ARCHBALD et al. (1979), publicaram polêmico trabalho envolvendo a inoculação de vírus da diarréia bovina no lúmen do corno direito de 5 vacas. Após uma semana recolheram 22 embriões, 12 dos quais procedentes do corno uterino infectado. Destes, 8 possuíam zona pelúcida e apresentavam início de degeneração. Ao microscópio eletrônico foi identificada uma estrutura morfologicamente ao vírus. Os autores concluíram que o vírus poderia apresentar efeitos adversos nos estágios iniciais da gestação, resultando em infertilidade. Entre tanto SINGH et al. (1982a), expuseram 96 embriões de vacas a concentração de vírus entre 104 e 105 50ml TCID e não encontraram o agente após processo de lavagem do embrião. Estes autores discordam da conclusão ARCHBALD et al. (1979), e postulam que a degeneração do embrião não significa necessariamente infecção e o achado de partícula semelhante ao vírus não pode ser correlacionado com a infecção. POTTER et al. (1984), verificaram significativa redução na concentração deste vírus após incubação em solução salina com 5% de soro de cabra por 24 horas a 37ºC.

11.4 – Língua Azul (Bluetongue)

A doença tem sido relacionada com morte embrionária (30 - 40 dias), aborto e efeitos teratogênicos no feto, entretanto na opinião de VAN DER MAATEN (1985), tem uma grande controvérsia sobre a patogenicidade do agente, sensibilidade e validade dos vários

testes sorológicos e virológicos. A combinação de várias técnicas diagnósticas, incluindo a inoculação em animais sensíveis, contribui para onerar sobre maneira o custo do embrião. A inseminação de vacas doadoras com sêmen infectado pelo vírus da "bluetongue" ou a inoculação do vírus em vacas doadoras tem resultado na identificação do vírus nos fluídos uterinos, mas a transferência de embriões colhidos desses animais não resulta na infecção de receptoras negativas. SINGH et al. (1982a), submeteram 116 embriões a diversas concentrações do vírus de "bluetongue" (102 a 107 p.f.u./ml)* entre 1 e 24 horas sem que fosse evidenciada a infecção dos embriões. BOWEN et al. (1982), demonstraram que os embriões bovinos sem zona pelúcida se infectam e degeneram por ação do vírus, o mesmo não ocorrendo com embriões que a possui. SINGH et al. (1983), obtiveram 28 embriões de 10 vacas doadoras que foram transferidos sem causar infecção ou soroconversão nas receptoras e nas crias. THOMAS et al. (1983), transferiram 28 embriões de 10 vacas infectadas experimentalmente com o vírus de "bluetongue" e obtiveram 14 gestações sem evidência de infecção ou soroconversão das receptoras e suas crias. THOMAS et al. (1985), transferiram 20 embriões de 4 vacas inseminadas com sêmen infectado experimentalmente com vírus de "bluetongue", sem que encontrasse infecção ou soroconversão nas receptoras e suas crias.

11.5 – Brucelose

Em relação a Brucella abortus a pesquisa demonstrou que a lavagem dos embriões é eficaz para eliminá-las. Até 1982 não existia segurança para afirmar se este agente poderia ser transmitido ou não pela transferência de embriões. STRINGFELLOW & WRIGHT (1989), analisaram os principais aspectos epidemiológicos relacionados ao uso de doadoras brucélicas e concluíram que as diversas pesquisas são suficientes para garantir que não há transmissão deste agente através da T.E. e que os regulamentos sanitários devem dedicar mais atenção à manipulação apropriada dos embriões e menos ênfase ao teste da doadora para prevenir a transmissão da brucelose.

11.6 – Leptospirose

No Brasil os resultados sorológicos de bovinos obtidos por vários autores (ÁVILA et al., 1978; MOREIRA et al., 1979; GIORGI et al., 1981; RIBEIRO et al., 1978;

GIRIO & MATHIAS, 1989; BROD et al., 1995), também mostraram que a infecção está bastante difundida. Atualmente o sorotipo hardjo tem sido o mais freqüentemente detectado e é o que causa maior impacto econômico na eficiência reprodutiva de rebanhos de bovinos de diversas partes do mundo (MILLER et al., 1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al., 1994; BROD et al., 1995; LILENBAUM et al., 1995; RICHARDSON, 1995). Nessa espécie os primeiros sinais da leptospirose são os ligados à esfera reprodutiva, como aborto, natimortos, reabsorção fetal, nascimento de animais debilitados e infertilidade, podendo a fêmea necessitar de 3 - 6 coberturas para conceber (FAINE, 1982; ELLIS, 1994; ELLIS et al., 1985).

12 – Condições sanitárias internacionais básicas para comercialização de embriões.
A OIE (Office International des Epizooties) é um organismo internacional de referencia em caso de importação/exportação de animais e seus subproduto. Isto não significa que um pais ou grupo de paises não possa fixar

acordos/regulamentos próprios. Serão registrados neste capitulo as recomendações mais

importantes em relação ao outro (VIANA, 1990).

12.1 – Normas recomendadas por OIE, FAO, OMS (código, 1982)

Para a importação de embriões de ruminantes deve constar do certificado zoosanitário

internacional que: 1. As fêmeas doadoras e os animais do rebanho de origem não apresentaram sinal clinico de febre aftosa, peste bovina, IBR, LEB, língua azul, brucelose , 24 horas antes do embarque para o local credenciado de colheita e que nenhum caso de febre aftosa , peste bovina e IBR foi oficialmente constatado no rebanho de origem durante 30 dias seguintes ao do embarque. 2. As doadoras permaneceram no mesmo rebanho de durante 30 dias, precedentes a seu embarque para o local credenciado da colheita e que foram submetidas nesse período, com resultados negativos, provas de diagnostico. 3. As fêmeas doadoras foram vacinadas ou não contra febre aftosa, peste bovina, IBR e "bluetongue", especificando o tipo da vacina. 4. As fêmeas doadoras foram fecundadas com sêmen que satisfaz as condições da OIE. 5. As fêmeas doadoras foram transportada desde o local credenciado de colheita sem atravessar uma zona infectada de febre aftosa, peste bovina, "bluetongue", e que

o local de colheita permaneceu livre destas doenças durante os 30 dias seguintes á data da colheita. 6. No caso da LEB, da brucelose e da tuberculose deve ser atestado que as fêmeas doadoras procedem de rebanhos livres e que nos 30 dias anteriores ao do embarque apresentaram resultados negativo ás provas diagnosticas especificas pela OIE/FAO. .

14 – Perspectivas futuras da reprodução
Segundo Silva (2000), tecnológico seguindo ligado o a

desenvolvimento

reprodução estão disponíveis hoje, além da inseminação artificial, técnicas como

criopreservação, sexagem, T.E, FIV, clonagem de seres vivos e a produção de animais transgênicos. Todas estas metodologias são formas que possibilitam aumentar a produção animal, alem de viabilizar programas,

preservação e multiplicação da biodiversidade, em especial daquelas espécies que se encontram em perigo de extinção. Na reprodução de animais domésticos a clonagem (a partir de um clone se permite a produção de crias idênticas em larga escala) possui particular valor para identificação e uso de genótipos superiores. Estes, então, poderiam ser selecionados através de cruzamento direcionados e difundidos, aumentando de forma rápida as taxas de melhoramento genéticos. Experimentos anteriores de clonagem de animais não tiveram as repercussões que alcançou o trabalho de Wilmut e sua equipe ao anunciarem ao mundo, em 1997, o nascimento de um ser vivo (Dolly), a partir da transferência de um núcleo de uma célula de glândula mamaria, de uma ovelha adulta, para um oócito enucleado de uma ovelha receptora. Ficou provado que núcleos de uma grande variedade de células podem se revelar totipotentes com capacidade de formar células germinativas ou diferenciar-se em um individuo. Abriu-se, assim, amplas possibilidades de clonar animais com traços genéticos desejáveis através da transferência nuclear a partir de população celulares modificados, oferecendo novas perspectivas biotecnológicas. O nascimento da ovelha Dolly, trouxe um novo despertar sobre os avanços da reprodução, assim como sobre os aspectos éticos que cercam a clonagem de seres vivos. A produção de animais transgênicos, através da integração de determinados genes dentro do DNA do receptor, fazendo com que este DNA recombinante possa replicar e

transmitir a característica desejada, representa um grande potencial para a industria farmacêutico e de alimentos. Serve, também, como modelo para compreensão genética de varias doenças hereditárias. As dificuldades de produção de animais domésticos transgênicos varia de espécie para espécie, sendo mais difícil de promover a integração genética em bovinos; a interação dos genes esta em torno de 35% na maioria das espécies, em bovinos é da ordem de 6%. Em ovelhas, cabras e suínos existem relatos da interação dos genes na linhagem de células germinativas e a sua expressão transgênica nas crias dos animais transplantados. Em bovinos existe apenas o relato de um embrião transplantado que gerou um bezerro que manifestou a expressão transgênica, entretanto, não existem relatos que esta expressão tenha sido transmitida a seus descendentes.

15 – Conclusão
Nos países desenvolvidos, as biotécnicas de reprodução além do emprego pela livre iniciativa já estão sendo também utilizadas programas de seleção e melhoramento animal parece-nos ser de fundamental importância antes de pensarmos em utilizar a biotecnologia para multiplicar o potencial de alguns considerados excepcionais, estabelecendo parâmetros de seleção e melhoramento animal, que de maneira objetiva suportem emprego destas tecnologias. A transferência de embriões com toda sua potencialidade é objetivo de grandes avanços e sucessos, a necessidade de produção são crescentes, abrangendo vários e diferentes aspectos. As biotécnicas de reprodução vem sendo utilizadas em programas de seleção e melhoramento animal e para isso preciso uma equipe com experiência em transferência de embriões, pessoal treinado sanidade manejo, equipamento e o mais importante aos animais. A maior responsabilidade dos pesquisadores talvez não seja a pura e simples condução da rotina científica, mas bem informar a opinião pública sobre os mais diferentes aspectos do conhecimento, permitindo à sociedade a opção da escolha dos caminhos a serem por ela seguidos. Desta maneira é de fundamental importância que as associações de criadores junto com os organismos oficiais empreendam esforços para a organização de programas de seleção animal, respeitando as particularidades de cada raça, visando o bem

16 – Referências Bibliográficas

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