Laboratorio de Cromatografía Q.

I 501

PRACTICA N° 1

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

OBJETIVO:

Conocer la cromatografía como técnica de separación de mezclas de

sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen. Estudiar la
incidencia del coeficiente de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Analizar la influencia del solvente en la separación cromatográficas. Observar
las diferentes características de la placa en la cromatografía.

FUNDAMENTO:

La palabra cromatografía significa gráfica de colores y fue diseñada por

Michael Tswett en el 1903. Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla
de pigmentos de hojas verdes y luego pasó este extracto a través de un tubo
de vidrio empacado con carbonato de calcio; de esta forma logró separar los
pigmentos presentes en las hojas.

Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas

utilizadas en la determinación de la identidad de sustancias, en la separación
de componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta
técnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación
como a nivel industrial.

Este método puede variar de técnica en técnica, pero siempre se basa en el

mismo principio: Todos los sistemas de cromatografía contienen una fase
estacionaria y una fase móvil.

“Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancia problema,

puedan tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de
inmisibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel “fase
estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil constituida generalmente por
una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de
Cromatografía la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel
invertido), radial y de separación de zonas y sectores.

Las cámaras cromatográficas son de varios tipos, de forma cilíndrica, de unos

30-40 cm de altura deben cerrar perfectamente, para evitar la evaporación del
disolvente que satura la atmósfera, se trabaja con papel cromatográfico
(Schleider, Schull, Whatman, etc.) Al las sustancias a analizar estas al entrar
en contacto con los disolventes empiezan su fase de movilidad, produciendo
unas manchas características únicas para cada sustancia, las cuales
dependerán de la cantidad de compuestos que las compongan.

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

Generalmente, estas manchas no son coloreadas de por sí y se ponen de

manifiesto por su posible fluorescencia a la luz ultravioleta frecuente en
sustancias orgánicas o mediante reactivos químicos que pueden dar una
reacción coloreada y que se reparten en gran estado de división. Los contornos
de las manchas así «reveladas» se señalan con lápiz y constituyen la
referencia para la identificación de las sustancias aisladas. Como medida en
cromatografía sobre papel se emplea el Rf (del inglés: Retención factor). Se
define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el del
disolvente, o sea la distancia que media desde el origen hasta el centro de la
mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente
del disolvente (S). Rf = X/S.

MATERIAL PRODUCTOS
• Papel filtro • Hexano
• Acetona
• Hojas de 25 * 5 cm • Agua Destilada
aproximadamente • Mezcla de N-Butanol, Ac.
Acético y Agua.
• Frasco cilíndrico de fondo
plano.

• Pipetas capilares de vidrio 1 *

50 mm del tipo empleado para
tomar muestras para análisis
de sangre.
• Probeta
• Colores

TECNICA:

• Se prepara un papel para cromatografía el cual esta cortado en forma

rectangular.

• Se traza el papel con un lápiz con una medida de 15 cm entre cada línea
del extremo del papel.

• En el papel procedemos a realizar la colocación de pequeñas cantidad

de sustancia cerca del extremo del papel, en forma paralela una de otra,
así podremos observar con claridad la cromatografía.

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• Las muestras serán distintas tintas, las cuales tienen distintos colores
rojo, azul y negro, veremos que cada una tiene una distinta composición
y características cromatográficas, hacen que sean diferentes sus
desplazamientos, como las sustancias que los componen.

• Se procede a poner en la cámara cromatográficas, con las pipetas

correspondientes los disolventes a utilizar, Hexano, Acetona, agua y la
mezcla estos en distintas relaciones se la adicionan.

• Se mezclan estos disolventes dentro de la cámara cromatográficas,

luego tomamos el papel cromatográfico tratado previamente con las
distintas tintas, el cual se sumerge en la cámara.

OBSERVACIONES:

Se observó en esta práctica que por medio de la cromatografía es posible

identificar que sustancias esta compuesta una mezcla. Como la polaridad del
solventes utilizados para la cromatografía determinan la el resultado
mostrándonos sus diferentes compuestos.

Se observo que en la Acetona si hubo separación pero solo que se saturo

mucho con la muestra y no se pudo apreciar bien la practica se veían
diferentes manchas.

Como ciertos factores pueden modificar el restado en esta practica.

Hay poca separación en algunos procedimientos por que los solventes son
poco polares por ejemplo el hexano es poco polar, mientras que en la acetona
si hubo separación por que la acetona es muy polar

ESQUEMAS:

Hubo separación pero no fue la adecuada ya que

hubo saturación de la tinta, el solvente si es muy
polar.

Fue muy poca la separación por que el hexano

no es polar y es el menos recomendable para
hacer una cromatografía en papel

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Lo que pasó es que se separó la tinta china, pero

no corrió mucho y las demás no se separaron

En la mezcla si hubo separación para las tres por

las diferentes polaridades.

BIBLIOGRAFIA:

• www2.uah.es/quimica_organica/docencia/practicas/practicas_quimica_or
ganica_farmacia.pdf
• www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_pa
pel.pdf

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PRACTICA N° 2

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

OBJETIVOS:

Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, c.c.f., sus características y

los factores que en ella intervienen. Calcular valores de r.f. de varias sustancias
y correlacionarlo a la selección adecuada del eluyente y deducir la relación que
existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan en este caso es
cafeína y capsaicina además de los eluyentes utilizados. Aplicar la técnica de
c.c.f. como criterio de pureza e identificación de sustancias.

FUNDAMENTO:

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo
un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá,
por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta
produciendo “manchas” de los componentes.

Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó
metálicos (ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCf convencional son:
20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2.

Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la

identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son
coloridos se requerirán técnicas de revelado.

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.

-éter de petróleo
-tolueno
-dietil-éter, t-butil-éter
-diclorometano
-acetato de etilo
-n-pentano, n-hexano
-ciclohexano
-tetracloruro de carbono
-éter dietílico
-cloroformo
-acetona
-iso-propanol
-etanol
-metanol
-ácido acético

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REVELADORES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras
pueden revelarse mediante:

• Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el
número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de
excitación del indicador utilizado.

• La introducción de la placa en vapores de yodo.

• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un

compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de
extracción de gases).

• Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta

carbonizar los compuestos.

ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA

FINA.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
e) Para la selección del adsorbentes deber tomar las siguientes
consideraciones:
f) Polaridad
g) Tamaño de partícula
a. Diámetro
b. Área Superficial
h) Homogeneidad
i) Pureza

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR

CROMATOGRAFÍA DE
CAPA FINA.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en
la fase estacionaria.

b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.

c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o

agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala,
éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y
metanol y después dejar secar completamente antes de aplicar la
muestra.

d) Pureza de los disolventes.

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CAFEINA:

La cafeína es la droga de consumo más popular en todo el mundo. Se estima

que una persona consume en promedio unos 70 mg diarios de cafeína (54 %
contenida en el café, 43 % en el te y el restante 3 % en otras formas).

La cafeína es naturalmente una droga psicoactiva, lo que significa que tiene la

potencialidad de alterar el pensamiento, el comportamiento y los estados de
ánimos de las personas. Pertenece a la categoría química denominada
xantinas que son drogas estimulantes del sistema nervioso central.

En su forma mas pura la cafeína tiene forma de cristales de sabor amargo y se

encuentra en muchas sustancias de uso cotidiano como el café, el té, el mate,
la cocoa, el chocolate, las bebidas cola y algunos preparados médicos
(pastillas para el dolor de cabeza y analgésicos).

Las palabras cafeína y café provienen del árabe gahweb.

La cafeína fue separada por primera vez del café en el año 1821. El café
proviene originariamente de una planta nativa de Etiopía. Fue introducido por
primera vez en Arabia y el resto de Oriente en el siglo IV después de Cristo.

Las poblaciones nómades de Etiopía descubrieron aparentemente la bebida del

café cuando notaron que sus animales domésticos se tornaban muy activos
luego de comer los frutos del árbol. Los nómades descubrieron que ellos
también se sentían muy activos luego de comer los frutos del árbol y
comenzaron a hacer una bebida a partir del tostado de los granos.

El café se utilizó en ceremonias religiosas y rituales donde grupos de personas

tomaban enormes cantidades y pasaban noches enteras rezando y cantando.

Aproximadamente en el año 1573 el café comenzó a ser introducido a Europa,

venciendo enormes resistencias. Las autoridades intentaron prohibirlo
aludiendo que era una droga nueva y desconocida, pero estos esfuerzos
fracasaron.

Por su parte, el té fue introducido por primera vez en Inglaterra en el año 1657
y desde entonces se ha convertido en una institución.

Suiza elaboró en el año 1657 su primera barra de chocolate y las bebidas colas
comenzaron a aparecer a finales del siglo XIX.

La planta de café es cultivada actualmente en muchos países tropicales de

todo el mundo y la producción, comercialización, posesión o consumo de
cafeína no es objeto de prohibición alguna.

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CAPSAICINA:

El compuesto químico capsaicina (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida) es el

componente activo de los pimientos picantes (Capsicum). Es irritante para los
mamíferos; produce una fuerte sensación de ardor en la boca. La capsaicina y
otras sustancias relacionadas se denominan capsaicinoides y se producen
como un metabolito secundario en diversas plantas del género Capsicum, lo
que probablemente les impide ser consumidas por animales herbívoros. Las
aves en general no son sensibles a los capsaicinoides. La capsaicina pura es
un compuesto lipofílico, inodoro, incoloro, parecido a la cera.

La capsaicina, que es el principio responsable de la tonalidad picante en

algunos alimentos, es empleado en algunas neuralgias, neuropatía diabética,
algunos cuadros dolorosos referidos a territorios específicos de la piel y en los
picores de los dializados por insuficiencia renal u otras afecciones difusas de la
piel similares. Es de suponer que tiene cierta acción anticancerosa.4 Durante
alguna época se le atribuyeron al pimiento picante virtudes afrodisíacas.
Parece ser que la estimulación del tracto génito-urinario por la capsicina
(picante) absorbida y no metabolizada, sería responsable de esta acción.

MATERIAL REACTIVOS
• Cromatofolios
• Pipeta de 10 ml
• Pipeta capilar • Hexano
• Tijeras • Acetona
• Regla
• Lápiz de pinta suave
• Frascos Gerber o
mayonesa

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TECNICA:

1. Cortar los cromatofolios 3 x 10

2. Marcar en el frente 1 cm de altura así como el tope también
3. Preparar la mezcla 50:50 Hexano y Acetona y depositarlo en un frasco
de mayonesa o Gerber
4. Colora 5 µl de cafeína y capsaicina en el cromatofolio previamente
cortado y medido.
5. Observar los resultados.

OBSERVACIONES:

No se pudo observa a simple vista pero mediante la luz ultravioleta pudimos

detectar la separación

ESQUEMAS:

Elución 50:50

BIBLIOGRAFIA:

http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin.htm

http://es.wikipedia.org/wiki/Cafe%C3%ADna

http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina

http://www.d-lamente.org/sustancias/cafeina.htm

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PRACTICA N° 3

SEPRACION DE ESTRONA, PROGESTERONA ANDRAESTRONA POR

CAPA FINA

OBJETIVO:

Utilizar la cromatografía en Capa fina para la separación de mezclas de

compuestos orgánicos como son la Estrona, progesterona y andraestrona.

FUNDAMENTO:

 Hormonas de los ovarios que junto a la O

progesterona controlan el ciclo sexual
de los mamíferos hembra. H

 Producen estrus (calor), que va H H

acompañado de cambios característicos HO
en el epitelio vaginal (algunos de ellos Estrona
base de métodos de análisis).
 El primero aislado fue la estrona. Por
Doisy, Butenandt y Laqueur en 1929 de
la orina humana de embarazada.
 Características Químicas: Anillo A es
aromático; Por ello no tienen grupo
metilo en C-10 y el OH en C5 es
fenólico.
 Los estrógenos provocan proliferación
de celulas específicas del cuerpo y son
la causa del crecimiento de los organos
sexuales y de la mayor parte de los
caracteres sexuales secundarios.
 Secreción en los ovarios y cantidades
mucho más pequeñas en suprarrenales
 En la placenta cantidades enormes (300
veces la secretada por los ovarios en un
ciclo sexual normal).
 En la pubertad 20 veces más
producción que en la infancia
 En plasma sanguíneo de mujer los 3
más importantes aislados son: estrona,
estradiol y estriol

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 Es la hormona masculina propiamente OH

dicha., las demás no son más que
H
productos del metabolismo de esta.
 Producidas por órganos y puestas en H H

circulación con la sangre para influir en O

Testosterona
la actividad o desarrollo de otras partes
del organismo

 De las hormonas gestógenas el más O

importante es la progesterona que se

produce en el ovario (curpus luteum= H
cuerpo amarrillo). Aislada(1934) de
cuero lúteo de cerdas preñadas H
H
PROGESTERONA

 Prepara la matriz para la implantación O

del huevo fecundado

 Una vez producida la concepción
mantiene el embarazo y lactancia
 Disminuye la frecuencia de las
contracciones uterinas (evita así la
expulsión del huevo implantado
 Estimula las secreciones de Trompas de
Falopio y ayuda a la nutrición del huevo
y aumenta lobulillos y alvéolos de
mamas para prepararlos (solo preparar
no provocar) para la secreción de leche.
MATERIAL REACTIVOS
• Cromatofolios
• Pipeta de 10 ml
• Pipeta capilar • Etanol
• Tijeras • Acetato de etilo
• Regla • Hexano
• Lápiz de pinta suave • Estrona
• Frascos Gerber o • AD
mayonesa • Testosterona

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

TECNICA:

6. Cortar los cromatofolios 3 x 10

7. Marcar en el frente 1 cm. de altura así como el tope también
8. Preparar 2 ml de etanol y depositarlo en un tubo de molisis
9. Pesar 10 mg de AD y depositarlos en el tubo con el etanol y diluir y asi
sucesivamente con la progesterona y la estrona
10.Aplicar la mezcla con una pipeta capilar 5 µl en el cromatofolio
previamente cortado y medido.
11.Observar los resultados.

ESQUEMAS:
 Diluimos 10 mg de AD, estrona
y testosterona con 2 ml de
EtOH, la testosterona y la
progesterona se diluyeron
fácilmente pero la estrona se
tubo que calentar.

Colocamos 5 µl de estrona y
progesterona el resultado fue el
siguiente (50:50 hexano, acatato de
etilo lo observamos en UV λ corta

Colocamos 5 µl de AD y estrona en
una sol 50:50 hecano, acetato de
etilo UV λ corta

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OBSERVACIONES:

En primera la estrona no se disuelve tan fácilmente en etanol requiere de

calentamiento caso contrario con las demás hormonas que si se disolvieron el
resultado fue que no se vio en la luz visible si no por medio de UV

BIBLIOGRAFIA:

www.portalesmedicos.com/diccionario_medico/index.php/Estrona

es.wikipedia.org/wiki/Progesterona

es.wikipedia.org/wiki/Testosterona

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PRACTICA N° 4

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA CON REVELADOR

OBJETIVO:

Desarrollar la cromatografía en capa fina pero utilizando un revelador /una

mezcla de NaOH y EtOH 5 % y 50 % respectivamente con un atomizador y
calentando en la parrilla.

FUNDAMENTO:

El revelado puede realizarse por métodos físicos o por métodos químicos:

- Entre los métodos físicos se encuentra la pulverización de una sustancia
fluorescente (fluoresceína) sobre la placa, con lo que al iluminarla con luz UV
se observan las manchas oscuras sobre fondo fluorescente. Así mismo,
resultan de utilidad los adsorbentes que llevan incorporada una sustancia
fluorescente, lo que permite la rápida localización de las manchas a la luz UV
sin necesidad de pulverizar.
- Otras veces se recurre a procedimientos químicos, consistentes en la
pulverización sobre la placa de un agente revelador que dé una reacción
coloreada con las sustancias problemas, o bien se introduce la placa en el
líquido revelador.

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

TECNICA:

12.Cortar los cromatofolios 3 x 10

13.Marcar en el frente 1 cm. de altura así como el tope también
14.Preparar de acetato de etilo y xileno y depositarlo en un tubo de
hemolisis
15.Pesar 10 mg de AD y depositarlos en el tubo con el etanol y diluir y así
sucesivamente con la progesterona y la estrona
16.Aplicar la mezcla con una pipeta capilar 5 µl en el cromatofolio
previamente cortado y medido.
17.Observar los resultados.

MATERIAL REACTIVOS
• Cromatofolios
• Pipeta de 10 ml
• Pipeta capilar • Etanol
• Tijeras • Acetato de etilo
• Regla • Hexano
• Lápiz de pinta suave • Estrona
• Frascos Gerber o • AD
mayonesa • Testosterona
• Lámpara de rayos UV

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

ESQUEMAS:

A la placa le adicionamos un
revelador formando de NaOH 5 % y
EtOH 50 % y lo dejamos secar.

Lo colocamos en una lampara de

luz UV de λ corta

OBSERVACIONES:

La técnica de cromatografía en capa fina (CCF) tiene numerosas ventajas,

aparte de ser rápida, sencilla, barata... tiene también la ventaja de utilizar poca
cantidad de muestra.

Las muestras de las hormonas son mezclas meterlas en el frasco de elución, el

disolvente subio por la placa e irá separando la mezcla, dejando abajo el patrón
más polar pero nos epudo apreciar en la luaz visible. Luego, gracias a los
reveladores físicos y químicos, se ve la separcion de los esterides.

BIBLIOGRAFIA:

http://html.rincondelvago.com/cromatografia-en-capa-fina.html

http://www.tamibar.com/id16.html

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 Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

PRÁCTICA N° 5

“CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA”

OBJETIVOS:
• Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de
mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella
intervienen.
.

FUNDAMENTO:

Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes

individuales de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto
comparando su comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas
empleadas como patrón.

La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos

fases, una de ellas, habitualmente sólida, llamada fase estacionaria,
experimenta una serie de procesos (adsorción en fase sólida, solubilización en
cada fase, arrastre por la fase móvil, etc.) que, en último extremo, llevan a que
el soluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relación entre las
concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina
coeficiente de reparto. Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente
de reparto diferente del de los otros, la separación será buena. Naturalmente,

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, así como de las

condiciones de la cromatografía.

Una de las técnicas cromatográficas más sencillas es la que se realiza en capa

fina, llamada así porque la fase estacionaria es una capa fina de un material
poroso (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida para su manejo mecánico sobre
un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes
proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la
capilaridad. En su movimiento, arrastra más o menos a los componentes de
una mezcla en función de sus mayores o menores coeficientes de reparto.

El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar, y

relacionado con él, se emplea el denominado Rf, característico de cada
sustancia, definido como la relación entre la distancia que recorre dicha
sustancia y la que recorre la fase móvil. Las más insolubles tendrán, en el
disolvente empleado, un Rf próximo a cero, mientras las más solubles se
acercarán a uno.

Cromatografía en columna:

Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala

preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o
alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una
buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de
la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna
se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna
poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar
que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se
engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra
por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido,
recogiéndose por lo general en tubos de ensayo.

Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia

sólida de propiedades adsorbentes constituida por pequeñas partículas: gel de
sílice y alúmina son las más usadas. Este relleno es lo que se conoce en
cromatografía como la fase estacionaria. A través de la columna se hará pasar
una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente
y/o fase móvil.

La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de

disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna,
quedando adsorbida por el mismo. A continuación se pasa un flujo de eluyente
a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son
arrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la
columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma
velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografía. Algunos
compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (fase
estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros
apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad.

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

En general se dice que la separación en la cromatografía se basa en la

afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase móvil o la fase
estacionaria.
El orden aproximado de elución de compuestos y de polaridad es
aproximadamente el que se indica:

Cromatografía en Capa fina

La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina

se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una
cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea
separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se
denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es
inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar"
(eluír) a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas moléculas en
la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a
los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que
"prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que
sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.

Cromatografía en columna (por fase inversa): Esta es una cromatografía de

interacción en la que la fase estacionaria, con moléculas hidrofóbicas,
interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra. La matriz consiste de
fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerán a las moléculas
hidrofóbicas de la muestra mientras que las hidrofílicas salen con el
amortiguador. Las moléculas son eluídas de la columna lavando con soluciones
de distinta concentración de alcohol o cualquier otro solvente no polar.

MATERIAL REACTIVOS
• Frasco vial de 15 ml • Azul de metileno
• Vasos de pp. de 250 ml • gel de sílice para columna
• Colector • acetato de etilo
• Embudo de vidrio • hexano
• Pipeta Pasteur
• Espátula
• Columna p/cromatografía
• Frasco cámara
• Probeta de 25 ml
• Varilla de vidrio(50 cm. de
longitud)
• Capilares
• Algodón

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

• Lámpara de luz U.V

EQUIPO:
Parrilla de calentamiento.

TECNICA:

PREPARACIÓN DE SÍLICE GEL PARA LA COLUMNA

En un frasco se mezcla sílice gel con benceno, de tal forma que quede una
papilla no muy floja.

EMPAQUE DE LA COLUMNA

Se coloca la bureta de 25 ml en un soporte universal, y se le agregan 10 ml de

benceno, y se le introduce un pequeño cacho de algodón, de tal forma que
quede y se moje con benceno en la parte inferior de la bureta y posteriormente
se le agrega 1 cm aproximadamente de NaCl.

Cuando este paso se haya realizado, con la ayuda de un embudo se agrega la

papilla de sílice gel dentro de la bureta.

NOTA: cuando se realice este paso se tendrá que verificar que no exista
burbuja de aire alguna, cuando este el sílice gel dentro de la bureta.

Se le agrega otro centímetro de NaCl.

Indique la toxicidad de las sustancias que utilizó y como se podrían desechar:

ACETATO DE ETILO: Líquido incoloro, de olor característico.

El vapor es más denso que el aire y puede extenderse a ras del suelo; posible
ignición en punto distante; El calentamiento intenso puede originar combustión
violenta o explosión. La sustancia se descompone bajo la influencia de luz UV,
bases y ácidos. La solución en agua es un ácido débil. Reacciona con
oxidantes fuertes, bases o ácidos. Ataca muchos metales en presencia de
agua. Ataca los plásticos.

La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La sustancia puede

tener efectos sobre el sistema nervioso. La exposición muy por encima del OEL
puede producir la muerte. Se recomienda vigilancia médica; El contacto
prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis.

ALÚMINA: La inhalación de altas concentraciones de polvo de ésta sustancia

puede originar irritación de los ojos y tracto respiratorio superior. Barrer la
sustancia derramada e introducirla en un recipiente, eliminar el residuo con
agua abundante, Barrer con cuidado para evitar la formación de polvo.

HEXANO: Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar

bastante rápidamente una concentración nociva en el aire. La sustancia irrita

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Laboratorio de Cromatografía Q.I 501

los ojos. La ingestión del líquido puede originar aspiración dentro de los
pulmones con riesgo de neumonitis química. La sustancia puede causar
efectos en el sistema nervioso central. El contacto prolongado o repetido con la
piel puede producir dermatitis. El líquido desengrasa la piel. La sustancia puede
afectar al sistema nervioso periférico, dando lugar a polineuropatías. Puede
originar lesión genética en los seres humanos. La experimentación animal
muestra que esta sustancia posiblemente cause efectos tóxicos en la
reproducción humana.

CONCLUSIONES:

Mediante el análisis de resultados podemos concluir que la prueba en

cromatografía en columna para la separación de componentes de nuestra
miuestra con ciertas sustancias fue en parte satisfactoria, por que se
obtuvieron buenos resultados en cuanto a los productos, aunque no todos nos
garantizaban que todos los compuestos contenidos en ellos eran iguales, pero
mediante la identificación de un eluyente adecuado.

ESQUEMAS:

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BIBLIOGRAFÍA:

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm

http://depa.pquim.unam.mx(9/oct/2006)

PRACTICA N° 6

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

FUNDAMENTO:

El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o

Cromatografía liquida de alta resolución, es una técnica cromatográfica usada
para separar componentes usando una variedad de interacciones químicas
entre el analito y la columna cromatográfica.
Básicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase móvil, bomba,
inyector, columna de separación y detector. El analito se pasa a través de una
columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta
presión. La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la
fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones químicas con la fase
estacionaria mientras atraviesa la columna.

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El retardo se conoce como tiempo de retención, único para analito. Depende de

la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composición de la fase
móvil. Los solutos más comunes usados en la fase móvil son combinaciones de
agua purificada con líquidos orgánicos, los mas comunes son Metanol y
Acetonitrilo, también suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la
separación de componentes. También se usa el Acido Trifluoroacetico para
actuar como formador de pares iónicos.
Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elución. Consiste
en la variación de la composición de la fase móvil, para adaptarse a los
diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la
matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición de la
fase móvil. Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la
máxima separación de picos en el detector.

Existen varios tipos de HPLC:

Cromatografía de fase normal:

Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Este
método usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa
cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria
polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre
analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de
interacción depende no solo de los grupos funcionales, sino también de
factores estéricos e isómeros estructurales.
El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que
disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de retención. Algunos solutos
polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

Cromatografía de fase inversa

Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase
estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar.
La fase estacionaria típica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una
cadena lineal con un grupo alcalino.

La adición de disolventes polares incrementa el tiempo de retención y añadir

disolventes hidrofóbicos lo disminuyen. El tiempo de retención es mayor para
moléculas no polares. El principio básico de este método esta basado en las
interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no
polar.

Las características del analito son importantes para sus propiedades de

retención. Las moléculas muy grandes pueden causar que la interacción no sea
completa. El tiempo de retención aumenta con el área hidrofobicidad, que es
inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los componentes ramificados
eluyen más rápido por que el área total esta disminuida. Hay otros
modificadores de la fase móvil que afectan a la retención del analito. Añadir
sales inorgánicas causa incremento lineal en la tensión superficial de
soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retención.

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El pH también es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso

se suele usar un buffer como fosfato sódico para controlar el pH. Un ácido
orgánico como ácido fórmico o ácido trifluoracetico. Sirven para muchas cosas,
controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase
estacionaria y actúa como formador de pares iónicos para neutralizar la carga
del analito. Los efectos varían pero aumentan la calidad de la
cromatografía.Las columnas de fase inversa son más difíciles de dañar que las
normales. Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con
sales acuosas, destruirían el silicato. Pueden ser usados con ácidos acuosos,
pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en
bajo contenido para que la separación de sustancias sea mejor.

Cromatografía de exclusión por tamaño:

También conocida como cromatografía de gel permeante o cromatografía de

gel filtrante. Separa las partículas en función del tamaño. Es una cromatografía
de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias
de proteínas y es la técnica común para averiguar el peso molecular de
polímeros sintéticos y naturales.

Cromatografía de intercambio iónico:

La retención esta basada en la atracción entre iones del soluto y la carga

complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase
estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores
de iones son:

Resinas de Poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la

cadena.
Celulosa: Tiene tamaño de poros mas grandes y bajas densidades de carga
que los hacen ideales para la separación de proteínas.
Poro controlado de vidrio o silicona porosa.
Los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y
radio inferior. Un incremento en el contra-ión (con respecto a los grupos
funcionales de resinas) reduce el tiempo de retención. Un incremento del pH
reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, pero bajar el pH
reduce la retención en intercambio aniónico.

Se usa en la purificación de agua, preconcentración de componentes traza,

cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio de
iones de proteínas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y
polisacáridos.

Cromatografía de bioafinidad:

Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos

estables, específicos y reversibles. La formación de los complejos implica
fuerzas moleculares como Van der Waals, electrostática, dipolo-dipolo,
hidrofóbicas y puentes de hidrogeno. Una unión bioespecífica se forma por
acción simultánea de estas fuerzas en los sitios de unión.

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OBJETIVO:

Determinar el contenido de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C

usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin
de familiarizar al alumno en el uso de dicha técnica.

• Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de

cromatografía líquida de alta eficiencia.
• Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y
desgasificación de los mismos.
• Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena
separación de los picos En alguna muestra
• Preparar patrones de ácido ascórbico.

MATERIAL REACTIVOS

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• Cromatógrafo Konik KNK-500- • Gases: Helio

Serie A • Disolución Cromato potásico
• Cromatógrafo HP 1050 0.1‰
• Cromatógrafo HP 1090 • Disolución estándar de
• Columna Spherisorb ODS-2 Naftaleno, fluoreno, antraceno,
15x0.4 cm, 5m bifenilo, fenantreno
• Detector de absorbancia HP • Ftalato de dietilo.
1050
• Detector de absorbancia HP
1090
• Detector de absorbancia
Applied Biosystems 757
• Detector HP 1040 A
• Integrador HP 3390 A
• Jeringa de líquidos SGE 100
L
• Disolventes ACN y agua mili-Q

TECNICA

1. Emplear eluentes grado HPLC.

2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.
3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..
4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación
cromatográfica para poder realizar la purga con estos.
5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la
bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado
como 2/flow en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este
valor como preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para
encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.
6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo
contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de
los mismos.
7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera
se hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones
contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando
el flujo de 0,1 en 0,1 mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

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8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la

muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.

Condiciones Experimentales

 Volumen de inyección 10μL

 Detección a 254 nm
 Flujo: 1mL/min
 Fase móvil: 50 mM de KH2PO4

Preparación de la curva de calibración.

Se prepara una madre de 200 ppm

de acido ascórbico.

Se prepararon cuatro patrones de

5/10/15/ 20 ppm

Se inyectan al HPLC y se realiza una curva de

calibración graficando los valores de área de pico en
función de la concentración

Preparación de la muestra

Se pesa la pastilla inicialmente (Dato que debe ser colocado en el informe)

Se pulveriza la pastilla:

se pesan tres muestras de 0.30000 g

Se disuelven en agua y se enrazan en 100mL.

Se realiza una dilución de 0.40mL en 25 mL de cada una después

de filtrar la muestra en un filtro de celulosa

Se inyectan al cromatógrafo

ESQUEMAS:

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BIBLIOGRAFIA:

• //www.forumsci.co.il/HPLC/system.gif&imgrefurl=http://www.forumsci.co.i
l/HPLC/topics.html
• http://www.qi.fcen.uba.ar/materias/ai/clase4_2007.pdf

• http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa

• http://labquimica.wordpress.com/2008/02/07/cromatografia-liquida-de-
alta-eficiencia-hplc/

PRACTICA N° 8
CROMATOGRAFIA DE GASES
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
EN AGUA

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FUNADAMENTO:

La idea de esta técnica se basa en la volatilización de la muestra y su posterior

inyección en la cabeza de una columna cromatográfica. Para la elución de la
muestra se usa un gas inerte como fase móvil, de esta manera la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito, simplemente transporta el analito a
través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC):

Cromatografía gas-sólido (GSC): la fase estacionaria es sólida y la retención

de los analitos se produce mediante adsorción.

Cromatografía gas-líquido (GLC): la fase estacionaria son moléculas de

líquido inmovilizadas sobre la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa
más ampliamente.

GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se

produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de
adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de
cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la
superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su
única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso
molecular.

La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyección de

muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector.

OBJETIVO:

Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados

para:

1. Proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase

móvil)
2. Permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas
que fluye
3. Contener la longitud apropiada de fase estacionaria
4. Mantener la columna a temperatura apropiada (o la secuencia del
programa de temperatura)
5. Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna
6. Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de
cada componente

Requerimientos de un equipo de cromatografía de gases

El corazón de los procesos de cromatografía de gases es la separación en

columna.

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Los requerimientos básicos en un equipo de cromatografía de gases son:

1. Gas de arrastre o acarreador

2. Puerto de inyección
3. Una columna
4. Un detector
5. Un registrador o cualquier otro dispositivo de salida para medir la señal
del detector
6. Cromatogramas

En la siguiente figura de detallan estos requerimientos en un cromatógrafo de

gases:

MATERIAL Y APARATOS REACTIVOS

- Frascos de extracción de - Diclorometano PAR.

vidrio 500 mL. - Acetato de etilo PAR.
- Pipetas automáticas. - Ciclohexano PAR.
- Balanza analítica. - Cloruro sódico.
- Dispensador automático. - Sulfato sódico anhidro.
- Probeta graduada de 100 - Lana de vidrio.
mL. - Disoluciones de muestra.
- Matraz de fondo redondo de
50 mL.
- Embudo de cristal 5,5 y 10
cm de diámetro.
- Embudo de decantación de
1000 mL.
- Soporte de varilla.
- Tubo de ensayo graduado
de 10 mL.
- Papel de filtro sin cenizas
135 Albet.
- Baño-Rotavapor.
- Viales de 2 mL con tapón
de rosca y septum.
- Equipo de cromatografía de
gases con detector MS/MS.

METODOLOGÍA

4.1 Preparación de la muestra

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Filtrar el agua con papel de filtro 135 Albet sobre embudo de rama corta.

4.2 Extracción

- Añadir 500 mL de agua filtrada a un embudo de decantación de 1000

mL apoyado sobre un soporte de varilla.
- Se añaden al embudo de decantación 50 g de cloruro sódico y se
agita hasta su disolución.
- Se añaden 50 mL de diclorometano y se agita durante un minuto,
transcurrido el cual se deja reposar.
- La fase orgánica se coge en un matraz de fondo redondo 50 mL,
empleando un embudo de rama corta con lana de vidrio y sulfato
sódico anhidro.
- Repetir el punto anterior dos veces más con 25 mL de diclorometano.
- Lavar el sulfato sódico del embudo con un volumen de diclorometano
para arrastrar.
- Concentrar la fase orgánica en un baño-rotavapor a 40ºC hasta
sequedad.

4.3 Determinación cromatográfica

- Se disuelve el residuo con 1 mL de ciclohexano:acetato de etilo (9:1)

en baño ultrasonidos durante 10 minutos, y se pasa mediante pipeta
a un vial de tapón de rosca de 2 mL para su análisis por
cromatografía.

DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Inyectar el extracto y un multipatrón de 0,1 ppm (mg/L) en el CG-MS/MS

empleando el Método Practicas.

Una vez identificado un compuesto se cuantifica mediante integración

del área de éste, comparándola con la de su patrón correspondiente o curvas
de integración del método.

Los resultados se expresan en µ g/L (ppb), que expresan los microgramos del
plaguicida contenidos en cada litro de agua.

La ecuación a utilizar durante la cuantificación es:

Am Vip Cp Vf
C = 
Ap Vim P

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donde:

C = Concentración del plaguicida en la muestra (ppm)

Am = Área del pico del plaguicida en la muestra
Ap = Área del pico del plaguicida en el patrón
Vip = Volumen de inyección del patrón (µ L)
Vim = Volumen de inyección de la muestra (µ L)
Cp = Concentración del plaguicida en la disolución patrón (ppm)
Vf = Volumen de aforo final (mL)
V = Volumen de la muestra (mL)

RESULTADOS EXPERIMENTALES

PLAGUICIDA IDENTIFICADO CONCENTRACION, ppb

Dimetoato

Terbutiazina

Oxifluorfen

Fenitrotion

Metidation

Nota: Adjuntar los cromatogramas obtenidos.

CONCLUSIONES

(Tener en cuenta la normativa sobre residuos de plaguicidas en aguas de

consumo público)

ESQUEMAS:

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BIBLIOGRAFIA:

• Navarrete, P. et al. (1998). “Movimiento de plaguicidas en la zona no

saturada. Aplicación en una zona experimental de Castellón”.
Plaguicidas. Aspectos ambientales, analíticos y ambientales pp. 47-62.
Ed. I. Morell y L. Candela

• Hernández, F., Beltrán, J., Sancho, J. V. (1991). “Study of multiresidue

methods for the determination of selected pesticides in groundwater”.3rd
Workshop on Chemistry and Fate of Modern Pesticides. Bilthoven
(RIVM). The Nederlands. September, pp. 4-6.

• http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm

• F:\LA CROMATOGRAFíA DE GASES - Véalo en QuimiNet_com.mht

• http://www4.ujaen.es/~ajmoya/practicas/practica1.do c

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