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roteiro_para_aulas_praticas[1]

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Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010

Profa Daiane Bopp Fuentefria

Roteiro de aulas práticas

Normas do Laboratório de Microbiologia 1. Os alunos somente poderão assistir ou participar dos experimentos práticos protegidos com avental apropriado (uso obrigatório); 2. Os alunos que apresentem soluções de continuidade (ferimentos ou cortes) na pele devem informar ao professor antes do início da prática para que o mesmo avalie se o aluno pode participar diretamente da prática; 3. Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prática (caderno, caneta, lápis, etc...), devem ser colocados nos armários; 4. Os alunos devem, de preferência, ocupar um lugar específico na bancada e mantê-lo fixo por todo o semestre; 5. Os estudantes devem evitar conversas paralelas e circulação entre as bancadas para diminuir os riscos de contaminação; 6. Antes de iniciar os trabalhos, os alunos devem sempre realizar a desinfecção da bancada utilizando algodão embebido em soluções de álcool a 70% ou de hipoclorito de sódio a 1000 ppm, ou outro agente, por um período adequado; Apesar de não trabalharmos com amostras clínicas ou microrganismos virulentos, convém considerar que todo material biológico é infeccioso; 7. Todo experimento deve ser efetuado com o máximo de cuidado e atenção; 8. Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório; 9. Manter a bancada arrumada e colocar papéis no lixo; 10.É recomendado não assistir aulas de chinelos, sandálias ou bermudas; 11.Ao receber o material para a prática verificar se está devidamente íntegro, tubos tampados adequadamente, se não há vazamentos; 12. Ao utilizar alças e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por flambagem antes e após cada operação efetuada com culturas microbianas; 13.Colocar os instrumentos e materiais utilizados inclusive vidraria, em recipientes apropriados, ao final do experimento; 14.Caso ocorra algum acidente comunicar imediatamente ao Professor Responsável que tomará as providências cabíveis; Ao final dos experimentos envolvendo microscopia, as objetivas devem ser limpas, o condensador deve ser deixado na posição original e o equipamento devidamente protegido e desligado; 15.Os alunos devem trazer canetas tipo Pilot para identificar devidamente os materiais utilizados na prática, facilitando o reconhecimento posterior; 16.Não é permitido pipetar com a boca, em vez disso usar pêras ou pipetadores apropriados; 17.Não recapear agulhas; 18.Ao final da aula prática envolvendo culturas microbianas, lavar as mãos com sabão líquido e enxugar com papel toalha ou álcool-gel; 19.Após o término do experimento o aluno deverá deixar a bancada limpa e organizada; 20.Após o término da aula, o aluno deverá retirar o jaleco e acondicioná-lo apropriadamente, pois não será permitido que o aluno circule pelas dependências do Instituto com o avental utilizado na aula prática;

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Após os trabalhos de laboratório, o recolhimento do material e o descarte das culturas são feitos por técnicos do laboratório. Cabe ao aluno, entretanto, deixar a bancada organizada e limpa. Uso do Bico de Bunsen A chama tem três zonas: duas internas, mais frias, formadas por um gás que não entrou em plena combustão; a última é a zona oxidante da chama, sendo a que mais se emprega em microbiologia. Esta região azul da chama, na parte superior, é que deve ser utilizada para esterilizar alças e agulhas de platina. As alças devem ser colocadas num ângulo de 45o na chama até ficarem incandescentes. Esperar esfriar e utilizar. Todo o material de microbiologia deve ser manipulado atrás do fogo, na área estéril, de forma a proteger o operador de possíveis aerossóis gerados e proteger a amostra biológica de contaminação. Procedimento: 1. Abrir a válvula de controle do gás; 2. Acender o fósforo; 3. Abrir lentamente a válvula do distribuidor; 4. Ajustar a chama; 5. Desligar na ordem inversa: feche a válvula do distribuidor e em seguida a válvula de controle de gás.

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Aula 01 – Coloração de Gram 1. Princípio Baseado na impregnação pelo cristal violeta (corante primário) na parede celular de algumas espécies bacterianas após este corante formar um complexo insolúvel com uma solução de iodo (lugol – mordente). Estas bactérias, devido à natureza de sua parede celular, retém o cristal violeta, mesmo após tratamento com descorante orgânico (álcool-acetona) e são chamadas de Gram-positivas. As bactérias que perdem a coloração primária são ditas Gram-negativas, sendo posteriormente coradas pelo corante secundário (fucsina), tomando a coloração rósea. 2. Amostra 2.1. Tipo de amostra Qualquer amostra clínica onde se deseja pesquisar a presença de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, anteriormente ao cultivo ou não ou, ainda, de colônias isoladas em meios de cultivo primários. 3. Metodologia - Posicionar a lâmina sobre o suporte. - Cobrir a lâmina com violeta de Genciana por 1 minuto. - Lavar com água corrente e adicionar o lugol, deixando-o agir por 1 minuto. - Com a torneira ligeiramente aberta, retirar todo o lugol e proceder a descoloração com álcool-acetona (tempo crítico – aproximadamente 5 segundos), até que a coloração violeta não se desprenda mais da lâmina. Enxaguar imediatamente. - Adicionar a Fucsina de Gram por 30 segundos. Enxaguar e secar a lâmina. Observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). 4. Interpretação Bactérias Gram-positivas = se coram em azul Bactérias Gram-negativas = se coram em vermelho 5. Interferentes O cristal violeta pode precipitar, formando estruturas semelhantes a cocos Gram-positivos. Entretanto os precipitados são geralmente maiores que as bactérias. Nesse caso, o corante deve ser filtrado antes do uso. O descoramento em excesso ou a falta do mesmo podem fornecer resultados errôneos, assim como o ajuste inadequado do conjunto ótico do microscópio.

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bacilos. Staphylococcus sp. Enterococcus sp.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 02 . em cadeias. 4 . Escherichia coli 6. 8. Morfologia Arranjo Gram 3. 2. agrupados. Neisseria sp. Streptococcus pneumoniae 5. em cachos de uva. arranjo (isolados. aos pares. cocobacilos. Bactéria 1.Observação de características morfológicas e tintoriais na Coloração de Gram Observar ao microscópio. Streptococcus sp. vibrio). em tétrades) e coloração de Gram (Gram-positivos ou Gram-negativos). em imersão. 4. 7. Acinetobacter sp. e avaliar as seguintes bactérias quanto a morfologia (cocos. Bacillus sp.

Anotar também as características observadas nos microrganismos dos outros colegas Meio de cultura Bactéria testada Pigmentaç ão (Cor da colônia) Característica diferencial do meio Observações Sangue Mac Conkey XLD Hektoen Observações: 5 . Proteus mirabilis. Incubar as placas a 35 ± 1 oC por 24 horas. Salmonella sp. pela técnica de isolamento. Após o período de incubação observar e anotar as características das colônias nos diferentes meios de cultura.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aulas 03 – Semeadura em Meios de cultura seletivos e diferenciais Cada dupla receberá um microrganismos (Escherichia coli.. Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella sp) e deverá inocular em diferentes meios de cultura.

Coletar também qualquer outro ponto de pus. imediatamente após a coleta. Amostra 2. Princípio Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe.01 tubo de Stuart (meio de transporte) Procedimento: • Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo a obter boa iluminação na cavidade oral. corar pelo método de Gram e observar ao microscópio com objetiva de 100x. Metodologia 3. • Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue (AS) e. 3. 2.1 Bacterioscopia Após fixar o esfregaço. amigdalite). com o abaixador de língua. Estabilidade da amostra Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura ambiente Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente 2. potencialmente graves. • Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal e não carregar saliva. 2. faringe. nas amígdalas e na faringe posterior. células e bactérias. fazer a semeadura do material no meio pela técnica de isolamento. mas também para evitar complicações posteriores. de maneira rotatória. 3. posteriormente. Tipo de amostra Secreção de orofaringe. • Esfregar o swab. 6 . verificando a presença de leucócitos.01 placa de Agar sangue ou .3. • Caso não esteja disponível a placa de AS. • Expor o máximo as amígdalas.02 lâminas para microscopia .1. introduzir o swab em um meio de transporte de Stuart. Incubar em jarra com 5% de tensão de CO2 por 24-48 horas.2. fazer um esfregaço em lâmina. caso contrário haverá contaminação da amostra. Material para coleta . Semeadura e isolamento Com auxílio de uma alça de platina. glomerulonefrite e endocardite reumática.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 04 – Coleta de secreção de orofaringe 1.2.01 abaixador de língua . A urgência não é justificada apenas pela doença básica (faringite. especialmente estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. como febre reumática. uma vez que se faz necessária a terapia imediata. amígdalas e/ou pontos purulentos dessas regiões.01 swab estéril .

7 .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Proceder a identificação baseada na morfologia das colônias e hemólise em Agar sangue. 4. Atividade de quinta-feira: Após o período de incubação. presentes na saliva e na cavidade oral (ex. Interferentes Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer resultados falso negativos. Entretanto. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal. fazer um esfregaço e corar pelo Gram. este tipo de contaminante não deve ser valorizado em culturas de orofaringe. Isto pode gerar dificuldades na interpretação clínica do resultado. Observar ao microscópio.: Estreptococos do grupo Viridans e estafilococo coagulase-negativo). selecionar uma colônia da placa.

1 atm (120oC). de pressão chegar a zero. Aguardar a autoclave atingir a pressão de a 1 atm. Abrir a autoclave. sem colocar o rosto em Retirar o material cuidadosamente. Colocar o material a ser autoclavado no Fechar a autoclave. Quando a pressão chegar temperatura média e marcar o tempo de 15. cesto. microondas 6. 17.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 05 – Preparo de meios de cultura 1. 7. 16. máxima. 13. 18. desejado 4. Abrir a válvula de vapor. 11. 8 . mangueira. Desligar a autoclave e esperar o indicador Abrir a válvula de vapor. 12. 10. Ligar a autoclave na temperatura Aguardar a saída contínua de vapor da Fechar a válvula de vapor. 5. atm. 8. respeitando a carga máxima. baixar o termostato para a esterilização. Verificar se o nível da água cobre a resistência (a água deve tocar o fundo do cesto). 14. Uso da Autoclave 1. recipiente de autoclavacao 3. 2. 9. cima. Calcular a quantidade de meio necessária Pesar o meio de cultura e colocar no Medir o volume de água destilada Adicionar a água ao recipiente Dissolver com ou bastão de vidro e/ou no Autoclavar por 15 minutos a 120 0C a 1 Esperar esfriar (ficar morno) e verter nas placas.

Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas. fazendo estrias. H2S – AA + + : ácido. Inocular a superfície do meio inclinado. ácido. Incubar no banho-maria a 42oC. H2S – Visualizada no meio SIM Turvação ou crescimento difuso na picada: positivo Ausência de turvação ou crescimento difuso: negativo Adicionar 3 gotas do reativo de indol no tubo de SIM e aguarda 2 min. Coloração rosa Pink: positivo Produção de pigmento negro no meio SIM Rosa: positivo Cor inalterada: negativo Fica amarelo e retorna a púrpura: positiva Amarelo: negativa Adicionar 5 gotas de cloreto férrico 10% na superfície. Usar a alça. gás +. Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder a identificação do microrganismo. H2S + KA + .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 06 – Identificação de Enterobactérias e Bacilos Gram-negativos não fermentadores Quarta-feira 1. 2. gás +. Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Usar a agulha . Cor verde escuro: positivo Cor do meio inalterada: negativo Azul: positivo Verde ou ausência de crescimento: negativo Turvação do caldo: positivo Ausência de crescimento: negativo Colocar uma colônia sobre a tira de oxidase Usar a agulha. Meio Citocromooxidase TSI Semeadura em provas bioquímicas Interpretação Como inocular Pigmento roxo: positivo Pigmento incolor: negativo KK . 3. ácido. Identificar o microrganismo. 2. Usar a alça e soltar 1 a 2 colônias no caldo.: ácido. Usar a alça. gás +. Inocular a superfície do meio inclinado. Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da citocromo-oxidase. Resu lt Motilidade Indol H2S Uréia Lisina Fenilalanin a Citrato Cresciment o a 42oC 9 . Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica. fazendo estrias. Inocular 1 a 2 colônias e cobrir o tubo com 3 gotas óleo mineral. Usar a alça. Inocular em picada e fazer estrias na superfície inclinada. ácido. Quinta-feira 1.. Incubar as provas de identificação a 35 ± 1 oC por 24 horas. 3.: ácido.: inerte AA + . Inocular em picada e na superfície do agar inclinado.

fazendo uma estria.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 DNAse Halo claro: positivo Sem halo: negativo Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Usar a alça. Adicionar HCL 1 N para proceder a leitura. Esquema Geral de Identificação 10 .

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 1 .Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%). Nível de complexidade 1. (ANVISA. Módulo V) 11 .

Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%). (ANVISA. Módulo V) 12 .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 . Nível de complexidade 2.

Oxidase-negativa. Motilidade positiva.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquemas de identificação de bacilos gram-negativos não fermentadores da glicose Tabela 1 .Bacilos Gram-negativos. TSI inerte 13 .

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 – Bacilos Gram-negativos. Oxidase positiva. Motilidade positiva. TSI inerte 14 .

transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no peróxido c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO 3. 4. Prova da catalase Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos. pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes b) Com auxílio de uma alça. Princípio Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero: Staphylococcus. a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S. Observar as hemólises e características das colônias em agar sangue de carneiro 5%.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 07 – Identificação de cocos Gram-positivos 1. 15 . 2. aureus. realizar uma bacterioscopia e depois a prova da catalase. Catalase-positivos Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35 oC por 4 horas. Streptococcus e Enterococcus. a) Em uma lâmina limpa. Após o período de incubação.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquema de identificação de cocos Gram-positivos de importância médica Identificação de Staphylococcus soagulase negativos (SCN) CAT Stap 16 .

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Identificação de Enterococcus 17 .

Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinárias e sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. punção suprapúbica.Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados 5. 4.Amostra em frasco não estéril . proceder a semeadura com alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey. podendo permanecer nestas condições por. Metodologia 5. Preparo da amostra Não é exigido 3. Semeadura e isolamento • Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl (1:1000) ou 10 µl (1:100).Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica) . 18 . no máximo. • Após a homogeneização da amostra.1.1.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Aula 08 – Urocultura Roteiro de aulas práticas 1. Amostra 2. pela técnica de esteira. 24 horas. Materiais inadequados . diferenciando infecção de colonização. Estabilização e armazenamento A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da semeadura. 2. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central na superfície do Agar. 2. Tipo de amostra Urina colhida por micção (jato intermediário).Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês) . seguida de um estriamento perpendicular a esta estria inicial. possibilitando assim. a obtenção de colônias isoladas para contagem. cateterização ou sonda uretral.2. O objetivo é isolar e quantificar bactérias patogênicas do trato urinário.

multiplicado por 1000. O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100.1. “positivando” a cultura. Incubar as placas a 35o C por 18-24 horas. o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa. Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100. 6.000 UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma). • Analisar as características das colônias e proceder a identificação (Bacilos Gram-negativos ou Cocos Gram-positivos). Amostras não refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias contaminantes. proceder a interpretação de acordo com a necessidade. Interferentes O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de colônias. Modelo de resultado Desenvolvimento de Escherichia coli Contagem de colônias: Superior a 100. Contagem de colônias • Caso seja utilizada a alça de 1 µl.2. 19 . 6. multiplicado por 100.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 5. • Caso seja utilizada a alça de 10 µl.000 UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso. Interpretação De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade. Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal. o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa.000 UFC/ml Cultura negativa Contagem de colônias: zero UFC/ml 7.

E. 3. Princípio O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas gastroenterites. coli invasora EIEC e E.EPEC) presentes na amostra. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias enteropatogênicas (Salmonella. em meio de transporte. conforme descrito a seguir. pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. Amostra Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou swab retal em meio de transporte. Hektoen e no caldo GN.2Exame microscópico direto A partir de um frasco sem meio de transporte realizar uma suspensão em salina sobre uma lâmina e observar a presença de leucócitos em objetiva de 40x. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas (máximo 6 horas). 1 gota do anti-soro e misturar com uma gota da suspensão bacteriana. Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima. caso necessário. etc) das fezes (p. Homogeneizar por 2 minutos. realizar a sorologia indicada. Sorologia: Após a leitura das provas de triagem. a refrigeração pode inviabilizar algumas cepas de Shigella. Shigella. moldadas. 2. 3.: diarréicas. 20 . Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por 18 – 24 horas a 35oC.4Semeadura e isolamento Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey.3Bacterioscopia de Gram Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos). Observar ao microscópio (10x) a presença de aglutinação.1Exame macroscópico Anotar sempre o aspecto mucosanguinolentas. deve ser feito sob refrigeração por mais 24 horas. 3.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 09 – Coprocultura 1. Procedimento: Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem. Metodologia 3. Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra. ex. Entretanto. deixar secar e corar pelo método de Gram. coli enteropatogênica . O armazenamento após a semeadura direta e enriquecimento da amostra. 3. Identificar as colônias de interesse por meio de provas bioquímicas. Colocar em uma placa escavada.

“Desenvolvimento de Salmonella”. 3) Shigella: S. Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella. Modelo de resultado Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados. Shigella e E. 21 . S. re-isolar as cepas e repetir a sorologia. S. dysenteriae. boydii. S. Caso a aglutinação se repita. flexneri. sonnei. coli enteropatogênica clássica”.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Anti-soros utilizados: Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 2) Salmonella polivalente somático e flagelar. pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. Interferentes A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte. Algumas cepas de EPEC podem apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas autoaglutináveis). 5. A semeadura em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e não permitir a obtenção de colônias isoladas. Nestes casos. 4) EPEC (crianças até 02 anos): polivalentes A. B e C 5) EIEC: polivalentes A e B 4. o resultado é inconclusivo. conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos de idade).

Procedimentos: • Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente. 2. • No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação. Transferir uma gota para preparar lâminas para corar pelo Gram. identificação e antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo infeccioso da corrente sanguínea. Tranferi-lo imediatamente para o frasco de hemocultura. Princípio O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento. Incubar as placas a 37oC por 24 horas. liberar o resultado da hemocultura como Negativo. vácuo e CO2. • Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a 10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). O frasco de hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS). identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o antibiograma específico para o patógeno isolado. Amostra Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial. utilizando o Agar sangue. incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para pesquisa de hemoculturas positivas. maior será a probabilidade do isolamento do agente etiológico causador da infecção. Hemoculturas positivas: • Homogeneizar bem a amostra e. Enviar o frasco para o setor. utilizando algodão embebido em álcool 70%.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 10 – Hemocultura 1. Identificar o frasco. para que haja diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue.Cultura de ponta de cateter 1. Hemocultura negativas: Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC. grumos ou hemólise). coletar 0. Após o término da incubação. 2. O número de amostras varia conforme solicitação médica. • No setor. Aula 10 . Quanto maior o número de amostras coletadas. • Enquanto isso. Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias. Deixar o álcool agir por 1 minuto. friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de borracha do frasco de hemocultura. permitindo assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em bacteremias. observando-as a cada 24 horas. • Caso haja crescimento.1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue. proceder da seguinte maneira. Tipo de amostra 22 . Mac Conkey. com auxílio de uma seringa de insulina. Isto é possível através da incubação das amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Ponta de cateter. 4. Procedimento • Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente. Interpretação Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue. • Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. retirar a ponta de cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5 vezes) • Incubar a 35oC por 24 horas. • Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada). 23 . caso positivo. • Observar se houve crescimento e. contar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente cresce um único tipo). Modelo de resultado Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado. Exemplo: Microrganismo isolado: Staphylococcus aureus Contagem de colônias: 89 UFC/segmento Ou Não houve desenvolvimento de microrganismos. Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 3. 5. Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de infecção.

1 Interpretação A cultura de escarro é de valor questionável. que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de interesse clínico nesse tipo de material. Dentre estes. Sugerimos repetir exame. Resultados 5. o escarro não é o material mais representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. os mais freqüentes são: Staphylococcus aureus: ++++ Pseudomonas aeruginosa: +++ Streptococcus pneumoniae: ++ Klebsiella pneumoniae: ++ Haemophilus influenzae: ++ 24 . Isto é devido ao fato deste material ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato respiratório superior.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 11 – Cultura de escarro 1. O Agar chocolate deve ser incubado em tensão de CO2. incluir no laudo a seguinte observação: “Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Por outro lado. pesquisar principalmente microrganismos cuja patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. A análise microbiológica de outros materiais como lavado brônquico. Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos. Se for observada uma quantidade superior a 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo (observar 10 campos). 2. diferenciais e enriquecidos. SEMEADURA E ISOLAMENTO Semear em ágar chocolate. 5. Incubar a 35oC por 24 horas. aspirado traqueal. Amostra Escarro Coleta: Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato respiratório inferior Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora 3. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias de prováveis patógenos e proceder a identificação. Metodologia BACTERIOSCOPIA • Observar a presença de leucócitos. leva a resultados mais conclusivos. Agar sangue e Mac Conkey pela técnica de isolamento. observando rigorosamente as instruções de coleta”. Para contornar o problema de contaminação com bactérias não patogênicas. Material inadequado Amostra contendo muita saliva 4. células epiteliais e bactérias (fazer o Gram mesmo que o médico não tenha solicitado) • Observar em aumento de 10x.

resultado não divulgado). Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram positivas.3 Preparo da amostra BACTERIOSCOPIA Preparar duas lâminas diretamente do material e corar pelo Gram para avaliar a qualidade da amostra (controle de qualidade interno. Atividade prática: Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e. classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas. em UTIs).2 Coleta Coleta: procedimento médico 2. exceto quando houver solicitação médica em pacientes gravemente debilitados (ex.1 Tipo de amostra Aspirado traqueal 2. Amostra 2. adicionar 100 µl mais 900 µl de solução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10) Diluição final 1/20 • Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira. utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue. Contagem de Contagem de células leucócitos epiteliais Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina 1 2 3 4 5 Avaliação Bactérias Aula 11 – Cultura quantitativa de aspirado traqueal 1. 2. de acordo com os critérios acima descritos. SEMEADURA • Homogeneizar bem a amostra • Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1% (fluidificante) (Diluição ½) • Da mistura anterior (Diluição ½).000) 25 . (Diluição final: 1/20. Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média. Agar chocolate e Mac Conkey) e um fluidificante.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Moraxella catarrhalis: ++ Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas As bactérias acima descritas devem ser pesquisadas primeiramente na cultura do escarro de rotina.

Para calcular o número total de colônias por mililitro de amostra. Proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada.000.000. Resultados 3.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • • • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Incubar a 35oC por 24 horas Observar o crescimento e caso positivo anotar a quantidade de colônias de cada tipo e confeccionar uma lâmina das colônias de interesse para iniciar a identificação.2 Modelo de resultado No laudo deve constar a bactéria identificada e o número de colônias contadas. nestes casos a contagem de colônias é geralmente baixa. 3.000 UFC/ml”. 4. Exemplo: “Desenvolvimento de Klebsiella pneumoniae Contagem de colônias: 1.000 UFC/ml) O resultado será expresso conforme abaixo.000. Fluxograma de processamento do aspirado traqueal 26 .000.1 Interpretação A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal. 3. “Não houve desenvolvimento de bactérias Contagem de colônias: zero UFC/ml”. (Exemplo: contagem de 50 colônias x 20. Interferentes A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecer resultados falso-positivos. Entretanto. contar todas as colônias e multiplicar por 20.000 UFC/ml) Valor significativo para aspirado traqueal: 106 UFC/ml (1. 5.000 = 1.

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Dependendo do microrganismo presente. prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais ao exame. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é 1 mL. Liberar no laudo o gênero e espécie do microrganismo isolado. daí a importância da concentração da amostra antes do processamento. porém volumes menores podem ser aceitos. Quando houver pedido de citologia e bioquímica.Cultura de Líquor 1. inocular em Agar chocolate e Agar sangue (pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar pelo Gram. Princípio A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e representa uma emergência médica. 4. Procedimento Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos. bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. o material deve ser primeiramente encaminhado a bacteriologia e depois aos demais setores. observar se há crescimento bacteriano. • Após período de incubação.000 rpm por 15 minutos. 2. • A partir do sedimento. • Incubar as placas a 35 oC com 5% de CO2 por 24-48 horas. entretanto observar a correlação dos achados na cultura com características físicoquímicas. Geralmente a concentração de microrganismos no líquor é baixa. • Identificar por provas bioquímicas. 28 . Por se tratar de um material estéril em condições habituais. qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura deve ser considerado e criteriosamente reportado. citológicos e bioquímicos do líquor. Exemplo de resultado: Cultura de líquor: “Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 12 . • Transferir a amostra para um tubo estéril. Resultado O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite. Amostra A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. • Centrifugar a 4. Coleta da amostra: equipe médica especializada 3.

Interpretação A determinação do perfil de susceptibilidade de uma bactéria pode fornecer um auxílio muito importante para o clínico.5 de Mc Farland com boa luminosidade contra um fundo branco com listras negras.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 13 – Antibiograma 1. a absorbância deve estar entre 0. utilizando um tubo de solução fisiológica não inoculada para “zerar” o aparelho. com auxílo de uma pinça. Modelo de resultado Urocultura: Escherichia coli Contagem de colônias: superior a 100. é comum ocorrer discrepâncias entre as sensibilidades in vitro e in vivo. impregnados com concentrações conhecidas de antibióticos. Amostra Colônias previamente isoladas do microrganismo a ser testado.5 da escala de Mac Farland.08 = acrescentar mais colônias). tocar umas cinco colônias bem isoladas da bactéria em teste e inoculá-las em solução fisiológica. retirar o excesso nas paredes do tubo e semear na placa de Mueller-Hinton pela técnica de “8 direções”. 15 mm de distância (centro a centro). • Ajustar a turvação da suspensão bacteriana para o equivalente do tubo 0. comparando-se com uma escala de 0. Importante: Cultura pura 3. Ou. 5. pelo menos. 4. Cabe ao clínico perceber as situações e tomar as devidas providências. A medida do halo de inibição e a comparação deste com uma tabela normatizada é que vai fornecer a susceptibilidade do microrganismo. por 18-24 horas e proceder a leitura dos halos com auxílio de uma régua e tabela de interpretação.10. 2. (Se der > 0. É então formada uma concentração em gradiente pela difusão do antibiótico no Agar. através de zonas de inibição de crescimento in vitro.10 = diluir adicionando mais salina. Na superfície de um meio de cultura. se der < 0.000 UFC/ml Antibiograma: 29 . O ajuste é feito em espectrofotômetro. • Aplicar os discos na placa. onde é semeada uma quantidade padrão de microrganismos em teste. Princípio Observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa bacteriana apresenta frente a antimicrobianos. Procedimento • Com uma alça bacteriológica. e o crescimento do organismo em teste fica inibido a uma certa distância do disco. • Incubar a placa invertida. Entretanto. Para a quantidade de colônias de 3 x 10 8 UFC/ml. A seleção dos discos a serem utilizadas depende da bactéria testada (consultar manual do CLSI).08 e 0. • Embeber um swab no caldo inoculado. de maneira que os discos fiquem a uma distância de. são colocados discos de papel. a 625 nm. pode-se utilizar o ajuste visual.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Cefrtiaxona. Sensibilidade a: Amicacina. Gentamicina Sensibilidade reduzida a: Ciprofloxacina. Imipenem. Norfloxacina Resistência a: Não houve resistência aos sais testados. 30 . Nitrofurantína.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Bactéria testada: _____________________________________________________ Antibiótico Classificaçã o CLSI Medida do halo (mm) Classificação (S. I ou R) 31 .

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Entretanto. até a emissão de vapores. Princípio A parede celular das micobactérias. Amostra 2. .Além das micobactérias. 34 .Preparar o esfregaço do material e fixar com calor. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. Rhodococcus) Referências: KONEMAN. Esta coloração é realizada para detectar a presença e evidenciar as características morfológicas e tintoriais dos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). 1432 p. até que toda a fucsina seja eliminada. Não deixar ferver. . aspirado traqueal. uma vez coradas. óculos e luvas. por isso. outras bactérias podem apresentar álcool-ácido resistência parcial ou total (Ex.. . Metodologia . Interpretação A observação de bacilos álcool-ácidos resistentes (coradas em rosa) é altamente sugestiva de micobactérias. . apresenta resistência a coloração. aquecendo-a por duas vezes durante este período. Buenos Aires: Panamericana.Descorar com álcool-ácido. 1999. 254 p. leprae os mais frequentes. as micobactérias resistem ao descoramento por solventes orgânicos fortes (como o álcool-ácido) e. lavado brônquico. . são chamadas de álcool-ácido resistentes. líquidos estéreis em geral. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color.Secar e observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). Interferentes . secreção muconasal. linfa. São Paulo: Sarvier.1 Tipo de amostra: Escarro. secreção traqueal. devido ao seu alto conteúdo lipídico. 2.Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 5 minutos. 5. lavado bronco-alveolar. OPLUSTIL. sendo o Mycobacterium tuberculosis e o M. Elmer W.Riscos na lâmina podem ser confundidos com BAAR se o observador não tiver muita experiência. LCR. As amostras de vias aéreas superiores deve ser manipuladas com máscaras. 3. 4. fezes. urina. Nocardia.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 14 – Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR) 1. 2000.Cobrir com azul de metileno (coloração de fundo) por 2 minutos. Outras micobactérias também são álcool-ácido-resistentes. Carmen Paz.

fazer assepsia. Espalhar circularmente e cuidadosamente até obter os esfregaços homogêneos com 1 cm de diâmetro. Técnica de Coleta de Material para Baciloscopia: • • • • • • • • receber o paciente e explicar sobre o exame. usar lâminas de vidro novas e limpas . demarcar as lâminas do lado que serão feitos os esfregaços. usar uma lanceta para cada paciente. selecionar os sítios de coleta . sem sangrar. 1. fazer boa isquemia com a pinça de Kelly e a incisão. colocar o material coletado na lâmina previamente demarcada. Corar as lâminas com Zhiel-Neelsen (BAAR) e observar ao microscópio para pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes. 35 . identificá-las com o nome do paciente e o local da coleta.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 15 – Coleta de linfa do lóbulo da orelha e/ou dobra do cotovelo.

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