A cromatografia em coluna foi desenvolvida primeiramente pelo químico de petróleo- M.S. Tswett.
• Líquida
• Sólida
• Líquido pouco volátil
C) CROMATOGRAFIA PLANAR: Nesta caso a fase estacionária é suportada sobre uma placa
(CCD) ou nos poros de um papel (CP).A fase móvel se movimenta através da fase estacionária por
ação de capilaridade ou por ação da gravidade.
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
• Tira de papel-celulose;
• Câmara (cuba) cromatográfica;
• Capilares;
• Fase móvel;
• Mistura a ser preparada
AM↔FE↔FM
OBS: Cromatografia em papel: fase normal: a fase estacionária é a água ou um
composto polar.
COEFICIENTE DE RETENÇÃO: RF
RFa = dra
Dm
RFb = drb
Dm
RFc = drc
Dm
1. Método físico;
2. Método químico;
3. Método biológico
1. Método físico- A revelação é feita com uma lâmpada de ultra- violeta. Este
método é um método seletivo, pois nem todos os analitos conseguem absorver
este tipo de luz. Este método é não destrutivo.
Espectroscopia na Região da Ultra- violeta é visível:
200nm→ 400nm (U.V)
400nm→ 800nm (U.V)
1,84
2) hexano
3) Clorofórmio 4,80
5) Diclorometano 10,5
6) Acetona 21,05
7) Etanol 24,06
8) Metanol 33,4
9) H2O 80,4
• FASE NORMAL: Neste tipo de fase estacionária pode ser usado a água ou outro solvente
polar. Já a fase móvel deve ser moderadamente polar.
• FASE REVERSA: A tira de papel é molhada com óleo de silicone ou parafina. Nesse caso
utiliza-se fase móvel polar. Os compostos hidrofóbicos.
• ANÁLISE QUALITATIVA: É realizada conforme a cor, se os analitos forem coloridos, ou por
comparação dos RF de um padrão com o RF de um analito.
• ANÁLISE QUANTITATIVA:
1. Uma análise direta da intensidade da cor da mancha de um padrão com a mancha
de um analito.
2. Cortando o papel e pesando. Comparar com um pedaço de papel sem a mancha.
3. Análise densitométrica.
MECANISMO DE SEPARAÇÃO
ADSORÇÃO:
• Fase móvel – líquida
• Fase estacionária – sólida
• Óxido de alumínio: utilizado como fase estacionária, pode apresentar as seguintes
características (ácida, básica e neutra).
MÉTODOS DE REVELAÇÃO:
1. FÍSICO: lâmina de UV.
Câmara de iodo
2. QUÍMICO: Interage com a solução.
3. BIOLÓGICO:
ANÁLISE QUALITATIVA:
• Comparação de cor ou RF das substâncias com os padrões.
ANÁLISE QUANTITATIVA:
1. Raspar;
2. Extrair;
3. Filtrar;
4. Evaporar;
5. Pesar.
EXERCÍCIO: Calcule os Rfs das substâncias abaixo.
Dra= 2,5cm RFa= 2,5= 0,36
Drb= 6cm 7
Dm= 7cm RFb= 6 = 0,86
7
SINTESE DA ACETANILINA
PROCEDIMENTO:
1. Preparar a fase móvel hexanoacetato de etila 30%( de acetato)
2. Preparar as seguintes soluções:
• anilina em acetato de etila;
• produto obtido em acetato de etila;
• padrão acetanilina em acetato de etila
• cortar uma placa 4x7cm;
• marcar as linhas de partida e chegada;
• aplicar as três soluções, uma separada da outra;
• correr a placa (eluir) e depois revelar.
• Fase móvel;
• Areia;
• Fase estacionária “adsorvente”;
• Torneira de Teflon;
• Algodão
Neste tipo de cromatografia, o mecanismo de separação é adsorção. Neste caso a fase estacionária
é um sólido (adsorvente) e a fase móvel é líquida (mistura de dois ou mais solventes).
• PROCESSO DE FLUIÇÃO:
OBSERVAÇÕES:
1. Uma amostra líquida volátil ou gasosa é injetada através de um septo para dentro de
uma câmara de vaporização aquecida, no qual ela se evapora rapidamente. O vapor é
arrastado na coluna pelo gás de arraste (fase móvel) H2, N2, He ou Argônio; os
constituintes fluem após serem separados. Depois disso, chegam ao detector, cuja
resposta é mostrada no registrador.
2. A CG também realiza análises de amostras sólidas, no entanto essas amostras devem
ser solubilizadas em um solvente volátil (alta pressão de vapor).
3. A coluna deve estar aquecida o bastante para proporcionar uma pressão de vapor
suficiente para que os constituintes eluidos num tempo razoável. O detector é mantido
numa temperatura superior a da coluna, logo todos os constituintes serão gasosos.
ESQUEMA DE UM
CROMATÓGRAFO
A GÁS:
1. O maior pico é o solvente. Os outros 4 são outras substâncias;
2. O requisito mais importante para uma amostra ser analisada por CG é a sua volatilidade;
sendo assim, esta é a grande limitação da CG.
3. Se o forno não estiver aquecido a coluna estará fria. Com isso, a amostra condensará. A
temperatura desse forno pode variar desde a temperatura ambiente até 400ºC;
4. A CG tem este nome porque a fase móvel é um gás.
• Forno de colunas: As colunas estão num forno com controle termostático de modo que a
sua temperatura seja reprodutível.
• Tipos de análises:
EX: Ti = 50ºC Tf =
50ºC →10ºC/min→ 150ºC →5ºC/min→250ºC
OBS: Este tipo de análise é utilizada quando se tem numa mistura substâncias leves e mais
pesadas. Em temperatura mais baixas, os componentes mais voláteis irão separar e, depois, em
temperatura mais altas os componentes mais pesados serão separados.
DETECTORES:
Situados na saída da coluna, a sua função é medir quantidades pequenas dos componentes
separados, presentes na corrente do gás de arraste que elui da coluna. O sinal de saída do detector
é enviado a um registrador, integrador ou computador que, finalmente traça o cromatograma.
A temperatura do detector deve ser 50ºC acima da temperatura final da coluna para que os
componentes, não condensem.
TIPOS DE DETECTORES:
1. RETENÇÃO:
Retenção na CG, é definido como o tempo transcorrido entre a injeção da amostra e o
máximo do pico cromatográfico.
TM= tempo morto
TR= tempo de retenção
Tr’= tempo de retenção ajustada (corrigido)
OBS: Mesmo que uma substância não interaja com a fase estacionária o seu tempo de
retenção não será nulo. Este tempo que o gás de arraste demora para percorrer a coluna é
chamado de tempo morto.
OBS TR’= Sendo assim, o parâmetro que realmente reflete as características físico-químicas
de retenção é chamado de tempo ajustado.
TR’=tr-tm α= t’r2
T’r1
SELETIVIDADE:
α=4/3,5 = 1,14(seletividade é
boa).
OBS: Nesse caso, os picos apresentaram uma boa seletividade, mas não separaram na linha
base. Portanto a coluna utilizada é seletiva para os dois componentes apesar de não
apresentar uma boa resolução. Sendo assim, deve-se mudar as condições de análise e, caso
não dê certo, trocar a coluna.
RESOLUÇÃO DA COLUNA:
Rs= 2(t’r1+t’r2)
Wb1 + wb2
Wb= largura do pico na linha da base.
N = 16 (t’r)2
(wb)
ANÁLISE QUALITATIVA:
O parâmetro utilizado é o tempo de retensão que é o tempo transcorrido desde a injeção do analito
ao máximo do pico gerado: Como fazer isso:
a) Comparação com padrões puros;
b) Adição de padrão ( coluição)
ANÁLISE QUANTITATIVA:
• INTEGRAÇÃO DO SINAL: Transforma a intensidade do sinal fornecida pelo detector em uma
medida relacionada com a quantidade de substância analisada na amostra.
ÁREA DO PICO:
A= a
Wb x 2 a= altura do pico
Wb= largura do pico
CALIBRAÇÃO INTERNA:
Faz-se uma solução mãe de um padrão e dilui-se em 10 concentrações conhecidas e diferentes.
Depois injeta-se cada uma destas amostras. Para cada concentração terá uma integração podendo
então traçar uma curva de calibração.
PADRONIZAÇÃO INTERNA:
Adiciona-se uma quantidade de uma substância conhecida à amostra a ser analisada e compara as
duas áreas.
FATOR CG HPLC
1) REQUISITOS PARA VOLÁTIL SOLÚVEL
AMOSTRA
2) TIPOS DE AMOSTRAS G,L,S , PM = 2 A 1200 L,S , PM = 32 A 400.000
Existem 5 mecanismos:
1. cromatografia por adsorção:
fase estacionária: sólida (sílica gel)
fase móvel: liquida (mistura de até 4 solventes)
2. cromatografia por partição:
fase estacionária: líquida
fase móvel: líquida
3. cromatografia fase ligada ou fase reversa:
Fase estacionária: sílica gel + C18Cl ou + C8Cl
Fase móvel:
4. cromatografia por exclusão:
Fase estacionária contendo poros de tamanhos controlados. As moléculas pequenas
podem entrar nos poros aumentando o tempo de retenção. Este tipo é específico para
a separação de polímeros. Muito utilizado na fabricação de vacinas.
5. cromatografia por troca iônica:
Fase estacionária: sólida (resinas catiônicas ou aniônicas)
Fase móvel: líquida
Este tipo de cromatografia é usada para separar compostos (espécies) contendo carga
positiva ou negativa.