High Performance Liquid Chromatography

一、目的：
Reverse phase HPLC is used to determine the concentration
of caffeine in mixture

二、原理：
Reverse phase HPLC is used to determine the concentration
of caffeine in coffee, tea, coca-cola, and Pepsi-Cola. The
traditional method for determination of caffeine is through
extraction with spectrometric quantitation. Use of the liquid
chromatography system permits a fast and easy separation of
caffeine from other substances such as tannic acid, caffeine
acid, and sucrose found in these drinks. Five standard
solutions of caffeine are prepared and injected into the HPLC.
In addition, the mixture is prepared and injected into the
HPLC. From the resulting chromatograms, measurements of
retention time t R and peak areas are made if the flow rate and
pump pressure are held constant throughout the experiment, t R
may be used as a qualitative measure and the peak area as a
qualitative measurement. A calibration curve for peak area vs.
concentration of caffeine standards can then be employed to
determine the concentration of caffeine in the unknown.

三、儀器設備及藥品
1. HPLC with UV detector(254nm)
2. Reverse phase C 1 8 column
3. Syringe, 25μL
4. Caffeine, reagent grade for standards
5. Mobile phase:50% Methanol and 50% water
6. Unknown sample

四、實驗步驟：
A.溶液之製備
1. 緩衝液：
a. 將體積比為 1：1 之 methanol 及 HPLC 级 H 2 0 混合，配
成 1 公升之移動相。(若有現成已配好的移動相，省略此
步驟)
b. 按下圖裝好過濾器，將已配好的移動相由上倒入過濾漏
 斗中，抽氣過濾。

c. 倒出 300 毫升移動相，將剩餘之已過濾移動相(約 500 毫

升)放入裝有去離子水之超音波震盪器中，震盪，直到無
氣泡冒出為止。

d. 將已過濾、震盪除氣之移動相倒入移動相儲存罐中。
2. 標準溶液：
e. 在五個 50 毫升定量瓶中，分別裝入 10mg, 20mg, 30mg,
40mg, 50mg 之 caffeine(咖啡因)，加入上述特別留下之
移動相(300 毫升)溶液，使其溶解並稀釋至標線。
f. 以注射針筒吸取 10ml 標準溶液，於注射針筒上旋上一個
2μm 小型過濾器，用力壓注射針，使標準溶液自過濾器
尖端流出，收集之。
 g. 將分別集得之標準溶液置於超音波震盪器中，震盪，備用

B. 開機：
1. 打開電腦開關，待出現 windows 桌面後，打開右方 pump 系
統開關及 MWD 系統開關。

2. 5 分鐘後，選取桌面上的”Instrument 1 online”。

3. 按[View]之”Method and Run Control”，然後出現下圖

4. 按 (表 pump)右下角的 ，打開 pump，再按 (表

MWD 偵測器)右下角的 ，打開偵測器光源，待 1 分鐘後，

出現下圖。

C. purge 管路：
5. 將 HPLC 裝置上的動相吸引口由甲醇罐取出，改放入一動相
溶液儲存罐中，並確認內裝移動相蓋過吸引口。

6. 按 ，選”Solvent bottles Filling”，出現下圖，於

”Actual Volume”下方，輸入實際移動相之體積。

7. 見 1-c 圖，將 purge valve 逆時針旋轉 5 圈，打開該閥。

8. 按 ，選取”set up pump”，出現下圖，將”Flow”設

為 0.5，然後按[OK]。
9. 待從移液相儲存罐至 column 之管路中，不見氣泡時，按
，選取”set up pump”，將”Flow”設為 0。

10. 順時針關閉 purge valve 的開關。

D. column 之 condition：
11. 按 ，將”Flow”設為 0.2。

12. 按 ，查看”online plot”，調整”adjust”，見 baseline 穩

定後，將”Flow”改為 0.4。然後依此方式，將流速逐漸增加
至 1.0。
13. 讓 column 在此流率下 run 數十分鐘，直到獲得穩定
baseline。

E. 標準溶液之測定：
14. 按 ，選”set up MWD signals”，出現下圖，選取偵測

波長為 254nm 之訊號(B)，然後按[OK]。

15. 按[Runcontrol]”的”Sample Information”(如下圖)。

16. 如下圖般設定，將標準溶液分別儲存
C:\Chem32\1\DATA\CH211B 之”STD000001”至
”STD000005”中，再按[OK]。

17. 準備進行標準溶液之注射。
18. 打開螢幕下方的”online plot”，待輸出訊號穩定後，以
25l 針筒吸取 25l 已過濾、除氣之標準溶液#1(濃度最低者，
儲存在”STD000001”中)(注意：此為定量實驗，故針孔中
不可含有空氣)。
19. 當注射閥處於”LOAD”位置時，如下圖般一次 注入注射孔
中，並馬上將注射閥處於順時針轉至”INJECT”位置。
20. 螢幕出現類似下圖

21. 待出現標準溶液#1 之波峰並回到基準線，確定無其他波峰

出現後，按[F8]，停止測量，出現如下圖般之報告(實際圖
形應只出現 1 個 Sig=254 的波峰)，此報內容已存檔。

22. 按報告下方的[Close]，回到主螢幕。
23. 重複步驟 18-22，依序測量所有標準溶液。

F. 檢量線之製定：
24. 按[View]，選擇”Data Analysis”，出現下列畫面。
25. 按[File]，選擇”Load Signal”，叫出標準溶液#1(儲存名稱
為”STD000001”)之檔案。
26. 按[Calibration]，”Calibration settings”，將”Sample
Defaults”中的”Amount Units”(濃度單位)設為
”mg/50ml”。

27. 按[Calibration]，”New Calibration Table”，將”Level”設

為”1”(表示標準溶液之編號為 1)，中的”Default
Amount”(標準溶液#1 的濃度)設為”5.0”。

28. 按[File]，選擇”Load Signal”，叫出標準溶液#2(儲存名稱

為”STD000002”)之檔案。
29. 按[Calibration]，”Add level”，將”Level”設為”2”(表示
標準溶液之編號為 2)，中的”Default Amount”(標準溶液#2
 的濃度)設為”10.0”。

30. 重複步驟 28-29，得到一由 5 個標準溶液構成的檢量線。

31. 按[Report]，選擇”Specify Report”，將”Quantitative

results”中的”calculate”改為”ESTD”。

32. 按[File]，選擇”Save as”中之”method”成”caffeine”，此

即為涵蓋操作參數及檢量線之測定方法。
G. 未知物之測定：
33. 按[File]，選擇”Load Signal”，叫出標準溶液#3 之檔案當
作未知物之檔案。
34. 按[Report]，選擇”print Report”，即顯示未知樣品的濃度。
35. 按右下角之[Print]，印出未知樣品之分析結果。
36. 按 ，將”Flow”减為 0。

H. Column 之保存：
37. 將已過濾、震盪除氣之甲醇倒入移動相儲存罐中。
38. 按 ，將”Flow”由 0 逐漸增加至 0.5。

39. 讓 column 在此流率下 run 十五分鐘，使 column 保存在甲醇

溶液中。
40. 按 ，將”Flow”减為 0。

五、參考文獻
1. Advances in chromatography and Lab Automation,
“chromatography Review,”Spectra-physics,”june 1978.
2. L. C. Column Report,”Nonaqueous Reversed-phase
chromatography”,DuPont Instruments,1978.
3. Altex High-Performance Chromatography Catalogue, Altex
Instruments, 1978.