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NEUROBIOLOGÍA
UNIVERSITAT DE VALENCIA
Servei de Publicacions
2008
Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 19 de
Decembre de 2007 davant un tribunal format per:
Depòsit legal:
I.S.B.N.:978-84-370-7057-5
Edita: Universitat de València
Servei de Publicacions
C/ Artes Gráficas, 13 bajo
46010 València
Spain
Telèfon: 963864115
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esentada por: Bla
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Dirigida p
por: Drr. Vicente
e Felipo Orts
O
Valencia,
V 2007
I
El Drr.Vicente F
Felipo Ortss, Investiga
ador y Je
efe del
La
aboratorio de
d Neurobiollogía del Ce
entro de Invvestigación Príncipe
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Fe
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CERTIF
FICA:
Que la
a memoria de Tesis Do
octoral realizzada por Dª Blanca
Piedrafita Baudín, titulada “Efectoss de la exp
posición prenatal a
ontaminantes presentes en los alim
co mentos (PCB
Bs y metilme
ercurio)
so
obre la capacidad de
e aprendiza as. Papel de las
aje en rata
alteraciones en
e la funció
ón de la vía glutamato
o-óxido nítriico-GMP
cícclico en el cerebelo”,
c h sido realizada bajo su
ha u dirección y reúne
to
odos los requ
uisitos necesa
arios para su
u juicio y callificación.
En Valenccia, a 27 de Septiembre
S de 2007
III
A mis padres y a mi hermana Marta
V
AGR
RADECIM
MIENTOS
S
Esta tesis es ell resultado de una “avventura” cieentífica,
prrofesional y personal
p quee no habría podido
p ser llevada
ll a cabbo sin la
innestimable ayyuda de un gran númerro de personnas a las quee quiero
aggradecer su tiempo
t y apooyo… y hay mucho que agradecer.
a
Graciaas a mi direcctor, el doctoor Vicente Felipo,
F por offrecerme
laa oportunidaad de trabajjar en su eqquipo y por su guía. Grracias a
toodos mis com mpañeros, loos que estánn, los que marcharon
m y los que
lle
legaron recienntemente: Carmina,
Ca Maarta, Nisrin, Pili, Omar, Regina,
Sllaven, Gennnaro, Amparro y Jordi. A nuestras estupendas técnicos: t
Issa, Mar, Maaribel, Mari Carmen, Paaqui y Rosa. Sin duda ell trabajo
seería imposiblle sin todos vosotros,
v vueestras risas y vuestras manos.
m
También quiero dar d las graccias al doctoor Paco Oluucha, mi
tuutor, por darrme ese pequueño empujónn que me saccó de un graan bache
cuuando hizo falta, y a tantas personas que q diariam mente u
occasionalmentte han comppartido su esppacio y su tiiempo para echar e un
caable, comenttar un chasccarrillo por los l pasillos y conseguir hacerte
soonreír cuanddo las cosas se
s ponen fasttidiosas.
Graciaas a toda mi m familia: mis padres, hermana, abuelos, a
prrimos y tíoos por su fe f en mí, su s apoyo inncondicionall y sus
frrecuentes coonsejos. Grracias a PascualPa por toda su ilusión,
opptimismo y esa
e sonrisa maravillosa;
m a mi “panddi” de Jaca por
p estar
siiempre que he
h necesitadoo desconectarr y reírme unn buen rato… … y por
paagar mis caffés cuando me m despisto; también a essos amigos que, q aun
esstando lejos, siguen tan cerca, y a la l tribu de
K
Kendo, con quienes comparto
c a
actividades
“kkendokiles” y otras máás surrealisttas. Todos
soois estupendo
dos y no seríaa nadie sin voosotros.
Y poor último, aunque no n menos
immportante, gracias
g a lass ratitas. Ellas saben
biien por qué.
VII
ÍNDICES
INDICE
ÍNDICE DE ABREVIATURAS ...................................... XVII
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................... XIX
ÍNDICE DE TABLAS............................................... XXIII
1. INTRODUCCIÓN ................................................. 3
1.1. Los humanos estamos expuestos a sustancias
tóxicas a través de la comida y la bebida. ............. 3
1.2. Los PCBs y el metilmercurio, contaminantes
habituales en los alimentos. .............................. 7
1.2.1 El metilmercurio ......................................7
1.2.2 Los bifenilos policlorados (PCBs)................. 10
1.3. Vulnerabilidad del sistema nervioso en
desarrollo a los contaminantes ambientales. ......... 13
1.4. Memoria y aprendizaje ............................... 16
1.4.1 Bases neurofisiológicas de la memoria y el
aprendizaje ............................................... 16
1.4.1.1. Papel del cerebelo en los procesos de
aprendizaje y memoria..................................... 18
1.4.1.2. Estructura del cerebelo ........................... 18
IX
ÍNDICES
X
ÍNDICES
XI
ÍNDICES
XII
ÍNDICES
XIII
ÍNDICES
XIV
ÍNDICES
XV
ÍNDICES
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
APS Persulfato de Amonio
BCIP Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
CM Calmodulina
DTT Ditiotreitol
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EGTA Ácido etilenglicol-bis-N´,N´,N´,N´-tetraacético
GMP Guanosín 3´, 5´- monofosfato
GCα Guanilato Ciclasa soluble, subunidad alfa
GCβ Guanilato Ciclasa soluble, subunidad beta
GCs Guanilato ciclasa soluble
GD7 Día 7 de gestación
Glu Glutamato
GMPc Guanosín monofosfato cíclico
GTP Guanosín-5´-trifosfato
MeHg Cloruro de Metilmercurio
mGluR Receptores metabotrópicos de glutamato
NBT Nitroblue tetrazolium
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico
nNOS Óxido nítrico sintasa neuronal
NR1 Subunidad NR1 del receptor de NMDA
PBS Tampón fosfato salino
PCB ó PCBs Bifenilo/s policlorados/s
PCB153 2,2’,4,4’,5,5N-hexaclorobifenilo
PCB126 3,3’,4,4’,5-pentaclorobifenilo
PMSF Fenilmetilsulfonilfluoruro
PND Día postnatal (postnatal day)
PVDF Polivinildifluorido
SDS Dodecilsulfato sódico
SNAP S-nitroso-N-acetil-penicilamina
TEMED N´, N´, N´,N´- Tretrametilenetilendiamina
Tris Base Tris-(hidroximetil)-aminometano
XVII
ÍNDICES
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Representación de la bioacumulación de los
bifenilos policlorados (PCBs). ................................. 5
Fig. 2. Evolución de los umbrales tóxicos de mercurio
para los que se han observado efectos adversos por
exposición prenatal. ............................................ 9
Fig. 3. Estructura química de los PCBs 153 y 126 ............ 10
Fig. 4. Clasificación de la memoria.. .......................... 17
Fig. 5. Representación de la composición neuronal de la
corteza del cerebelo ......................................... 19
Fig. 6. Laberinto en Y. ........................................... 23
Fig. 7. El receptor NMDA ........................................ 28
Fig. 8. Vía Glutamato – NO – GMPc.. ........................... 30
Fig. 9. Procedimiento quirúrgico de colocación de la guía
de microdiálisis. ............................................... 57
Fig. 10. Representación del funcionamiento de la sonda
de microdiálisis cerebral CMA/12. ......................... 60
Fig. 11. Evolución de la ganancia de peso de las crías
macho. ......................................................... 73
Fig. 12. Evolución de la ganancia de peso de las crías
hembra. ........................................................ 74
Fig. 13. Las crías expuestas a PCB126 solo o combinado
con MeHg, tenían un peso significativamente menor
que el resto al nacer. ........................................ 75
Fig. 14. La exposición perinatal a MeHg, PCB153 o PCB126
pero no a sus combinaciones disminuye la capacidad
de aprendizaje de las ratas a los 3 meses de edad. ..... 77
Fig. 15. La exposición perinatal a PCB153, PCB126 o
MeHg, pero no a combinaciones de PCB con MeHg,
reduce la función de la vía Glu-NO-GMPc en el
cerebelo de las ratas macho a los 3 meses de edad. .... 80
Fig. 16. La exposición perinatal a PCB153, PCB126 o
MeHg, pero no a combinaciones de PCB con MeHg
XIX
ÍNDICES
XX
ÍNDICES
XXI
ÍNDICES
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Resumen del aumento de GMPc extracelular en
cerebelo inducido por la activación de la vía Glu-NO-
GMPc con NMDA en ratas de 3 meses de edad expuestas
perinatalmente a PCB153, PCB126 o MeHg solos o a
combinaciones de PCB y MeHg. ................................. 84
Tabla 2. Contenido de proteínas de la vía Glu-NO-GMPc en
homogenados de cerebelo de ratas de 3 meses expuestas
perinatalmente a PCB153, PCB126 y/o MeHg................. 86
Tabla 3. La exposición perinatal a los neurotóxicos no afecta
al aumento de GMPc inducido por NMDA en ratas de 8
meses ............................................................... 94
Tabla 4. Comparación de la función de la vía Glu-NO-GMPc en
cerebelo en ratas de 3 y 8 meses de edad. ................... 97
Tabla 5. Efecto de la exposición perinatal a los neurotóxicos
sobre el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-GMPc
en neuronas de cerebelo ex vivo. ............................ 100
Tabla 6. Resumen de los efectos de los tratamientos in vitro
con PCB153, PCB126 o MeHg. ................................. 114
Tabla 7. Efecto de la exposición crónica a MeHg in vitro sobre
el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-GMPc en
neuronas granulares de cerebelo. ............................ 115
Tabla 8. Efecto de la exposición crónica a PCB153 in vitro
sobre el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-GMPc
en neuronas granulares de cerebelo ......................... 116
Tabla 9. Efecto de la exposición crónica a PCB153 + MeHg in
vitro sobre el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-
GMPc en neuronas granulares de cerebelo .................. 117
Tabla 10. Efecto de la exposición crónica a PCB126 in vitro
sobre el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-GMPc
en neuronas granulares de cerebelo ......................... 117
Tabla 11. Efecto de la exposición crónica a PCB126 + MeHg in
vitro sobre el contenido de proteínas de la vía Glu-NO-
GMPc en neuronas granulares de cerebelo .................. 118
Tabla 12. Resumen del contenido de proteína en homogenados
de cerebelo, cultivos celulares ex vivo y tratados in
vitro. .............................................................. 119
XXIII
INTRODUCCIÓN
1
INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
3
INTRODUCCIÓN
4
INTRODUCCIÓN
5
INTRODUCCIÓN
6
INTRODUCCIÓN
1.2.1 El metilmercurio
7
INTRODUCCIÓN
8
INTRODUCCIÓN
Déficits en la
Retraso en caminar capacidad
(2 años de edad, Irak) de atención, memoria
y aprendizaje
FDA
ATSDR (7 años de edad,
Islas Feroe)
1
Reflejos anormales
(varones de 2 años, Quebec) ATSDR
IQ reducido
(7 años, Nueva Zelanda)
Retrasos en el desarrollo Aumento de
(4 años de edad, Nueva Zelanda) EPA la presión arterial
0.1 (Islas Feroe)
Reducción en la actividad
(Varones de 2 años,
Seychelles)
0.01
1970 1980 1990 2000
AÑO
9
INTRODUCCIÓN
Cl Cl Cl
Cl Cl Cl Cl
Cl Cl Cl Cl
3,3’,4,4’,5-Pentachlorobiphenyl 2,2’,4,4’,5,5N-Hexachlorobiphenyl
PCB126 PCB153
CAS No. 57465-28-8 CAS No. 35065-27-1
Chemical Formula: C12H5CL15. MW 326.42 Chemical Formula: C12H4CL16. MW 360.88
10
INTRODUCCIÓN
11
INTRODUCCIÓN
12
INTRODUCCIÓN
13
INTRODUCCIÓN
14
INTRODUCCIÓN
15
INTRODUCCIÓN
16
INTRODUCCIÓN
Memoria
Declarativa No declarativa
(Explícita) (Implícita
Hipocampo
Aprendizaje
Lób. temporal Aprendizaje
Habilidades Priming Asociativo
medio No asociativo
básico
Diencéfalo
Estriado
Respuestas
Eventos Corteza motora Neocorteza Reflejos
emocionales
Cerebelo
Amígdala
Hechos (Hipocampo)
Respuestas
motoras
Cerebelo
(Hipocampo)
17
INTRODUCCIÓN
18
INTRODUCCIÓN
19
INTRODUCCIÓN
20
INTRODUCCIÓN
21
INTRODUCCIÓN
22
INTRODUCCIÓN
23
INTRODUCCIÓN
24
INTRODUCCIÓN
25
INTRODUCCIÓN
26
INTRODUCCIÓN
27
INTRODUCCIÓN
28
INTRODUCCIÓN
29
INTRODUCCIÓN
30
INTRODUCCIÓN
31
INTRODUCCIÓN
32
INTRODUCCIÓN
33
INTRODUCCIÓN
34
.
OBJETIVOS
35
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
37
OBJETIVOS
38
OBJETIVOS
39
MATERIAL Y MÉTODOS
41
MATERIAL Y MÉTODOS
3. MATERIAL Y MÉTODOS
1.7. MATERIAL
• Metilmercurio (Sigma)
• PCB153 (Fluka)
• DMSO (Sigma)
43
MATERIAL Y MÉTODOS
• Glutamina (Gibco)
• Polilisina (Sigma)
44
MATERIAL Y MÉTODOS
• Citosín-β-arabinofuranósido (Sigma)
• Pipetas (Sarstedt)
• Acrilamida (BioRad)
• TEMED (Sigma)
• APS (Biorad)
45
MATERIAL Y MÉTODOS
1.7.2 Aparatos
• Microscopio de cirugía.
46
MATERIAL Y MÉTODOS
1.7.3 Animales
47
MATERIAL Y MÉTODOS
1.8. MÉTODOS
48
MATERIAL Y MÉTODOS
49
MATERIAL Y MÉTODOS
50
MATERIAL Y MÉTODOS
51
MATERIAL Y MÉTODOS
52
MATERIAL Y MÉTODOS
53
MATERIAL Y MÉTODOS
54
MATERIAL Y MÉTODOS
55
MATERIAL Y MÉTODOS
56
MATERIAL Y MÉTODOS
57
MATERIAL Y MÉTODOS
58
MATERIAL Y MÉTODOS
59
MATERIIAL Y MÉTODO
OS
1.8
8.2.1. Cultivvos primario
os de neuron
nas granularres
de cerebelo
o
60
MATERIAL Y MÉTODOS
61
MATERIAL Y MÉTODOS
62
MATERIAL Y MÉTODOS
63
MATERIAL Y MÉTODOS
64
MATERIAL Y MÉTODOS
65
MATERIAL Y MÉTODOS
66
MATERIAL Y MÉTODOS
67
MATERIAL Y MÉTODOS
68
MATERIAL Y MÉTODOS
69
MATERIAL Y MÉTODOS
70
RESULTADOS
71
RESULTADOS
4. RESULTADOS
350
50
300 40
30
Peso (g)
250
20
10
200
Peso (g)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Edad (días)
150
Machos
100 Control
MeHg
PCB153
50 PCB126
PCB153+MeHg
PCB126+MeHg
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Edad (días)
73
RESULTADOS
60
55
225
50
45
200 40
35
Peso (g)
30
175 25
20
15
150
10
Peso (g)
5
125 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Edad (días)
100
Hembras
75
Control
MeHg
50
PCB153
PCB126
25
PCB153+MeHg
PCB126+MeHg
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Edad (días)
74
RESULTADOS
9 40
Peso al nacer Peso a los 14 días
8 30
***
Peso (g)
Peso (g)
** *
7 20 **
***
6 10
5 0
Control MeHg PCB153 PCB126 P153Hg P126Hg Control MeHg PCB153 PCB126 P153Hg P126Hg
70
Peso a los 21 días (destete) 400 Peso a los tres meses
60
350
Machos
50 300 Hembras *** ***
*
Peso (g)
Peso (g)
40 *** *** 250
200
30
150
20
100
10 50
0 0
Control MeHg PCB153 PCB126 P153Hg P126Hg Control MeHg PCB153 PCB126 P153Hg P126Hg
Fig. 13. Las crías expuestas a PCB126 solo o combinado con MeHg,
tenían un peso significativamente menor que el resto al nacer.
Estas diferencias se mantuvieron hasta el destete y no son
apreciables en las ratas de 3 meses de edad. Cada barra representa
la Media ± SEM de los pesos de las crías de cada tratamiento. Los datos
han sido analizados mediante ANOVA de un criterio seguido de Tuckey
como post-hoc. (n =10 en cada grupo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
75
RESULTADOS
76
RESULTADOS
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
A
125 Machos
***
para aprender
100 ***
bb
75 * a
HHH
HHH
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
B
125 Total
***
para aprender
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
C
Fig. 14. La exposición perinatal a MeHg, PCB153 o PCB126 pero no a
sus combinaciones disminuye la capacidad de aprendizaje de las
ratas a los 3 meses de edad. Los valores son la media ± SEM del
número de ensayos necesarios para aprender la tarea. Los asteriscos
indican diferencias significativas respecto al grupo control. (* p<0,05; **
p<0,01; *** p<0,001). (H) indica diferencia significativa respecto al
grupo MeHg. (a) indica diferencia significativa respecto al grupo
PCB153. (b) indica diferencia significativa respecto al grupo PCB126.
(ANOVA de un criterio y Tuckey post-hoc)
A. Ratas hembra (Control n=6; MeHg n=6; PCB153 n=6; PCB153 + MeHg
n=6; PCB126 n=12; PCB126 + MeHg n=6)
B. Ratas macho (Control n=13; MeHg n=6; PCB153 n=6; PCB153 + MeHg
n=7; PCB126 n=9; PCB126 + MeHg n=6)
77
RESULTADOS
78
RESULTADOS
79
RESULTADOS
1200
(% de la concentración basal)
1000 PCB 153
PCB153 + MeHg
900
800
700
NMDA 300 uM
600
500
NMDA 300 uM
400
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
A
1300
Concentración de GMPc extracelular
Control Machos
1200
MeHg
(% de la concentración basal)
1100 PCB126
1000 PCB126+MeHg
900
800
700
600
500 NMDA 300 uM
400 NMDA 300 uM
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
B
Fig. 15. La exposición perinatal a PCB153, PCB126 o MeHg, pero no a
combinaciones de PCB con MeHg, reduce la función de la vía Glu-NO-
GMPc en el cerebelo de las ratas macho a los 3 meses de edad. Los
valores se expresan como porcentaje de la concentración basal (media
de las fracciones 1-5) y son la media ± SEM del número de experimentos
indicado en cada caso.
A. Ratas macho: control (n=7), MeHg (n=5), PCB 153 (n=6) and
PCB153 + MeHg (n=6)
B. Ratas macho: control (n=7), MeHg (n=5), PCB 126 (n=9) and
PCB126 + MeHg (n=9).
80
RESULTADOS
1200
(% de la concentración basal)
1000 PCB 153
900 PCB153 + MeHg
800
700
600 NMDA 300 uM
500
400 NMDA 300 uM
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
A
1300
Concentración de GMPc extracelular
Control Hembras
1200 MeHg
(% de la concentración basal)
1100 PCB126
1000 PCB126+MeHg
900
800
700
600 NMDA 300 uM
500
400 NMDA 300 uM
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
B
Fig. 16. La exposición perinatal a PCB153, PCB126 o MeHg, pero no a
combinaciones de PCB con MeHg reduce la función de la vía Glu-NO-
GMPc en el cerebelo de las ratas hembra a los 3 meses de edad. Los
valores se expresan como porcentaje de la concentración basal (media
de las fracciones 1-5 y son la media ± SEM del número de experimentos
indicado en cada caso.
A. Ratas hembra: control (n=6), MeHg (n=6), PCB 153 (n=6) and
PCB153 + MeHg (n=6).
B. Ratas hembra: control (n=6), MeHg (n=6), PCB 126 (n=6) and
PCB126 + MeHg (n=6).
81
RESULTADOS
82
RESULTADOS
1100
(% de la concentración basal)
900 PCB 153
PCB153 + MeHg
800
700
600
NMDA 300 uM
500
400 NMDA 300 uM
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
A
1400
Concentración de GMPc extracelular
1300
Control Total
MeHg
(% de la concentración basal)
1200 PCB126
1100 PCB126+MeHg
1000
900
800
NMDA 300 uM
700
600
500
400 NMDA 300 uM
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracción
B
Fig. 17. La exposición perinatal a PCB153, PCB126 o MeHg, pero no a
combinaciones de PCB con MeHg, reduce la función de la vía Glu-NO-
GMPc en el cerebelo de las ratas a los 3 meses de edad. Los valores
se expresan como porcentaje de la concentración basal (media de las
fracciones 1-5) y son la media ± SEM del número de experimentos
indicado en cada caso:
A. Total: control (n=13), MeHg (n=11), PCB 153 (n=12) and
PCB153 + MeHg (n=12).
B. Total: control (n=13), MeHg (n=11), PCB 126 (n=15) and
PCB126 + MeHg (n=15).
83
RESULTADOS
84
RESULTADOS
85
RESULTADOS
Machos
MeHg PCB153 PCB153Hg PCB126 PCB126Hg
105 ± 17 110 ± 12 59 ± 4 * ‡ 158 ± 29 * 106 ± 21
nNOS
n=5 n=6 n=7 n=6 n=6
84 ± 13 89 ± 12 78 ± 4 * 92 ± 7 117 ± 6 * ‡
GCα
n=3 n=3 n=3 n=6 n=5
91 ± 5 102 ± 6 102 ± 5 85 ± 7 60 ± 7 * ‡
GCβ
n=3 n=3 n=4 n=8 n=7
104 ± 22 108 ± 19 89 ± 13 93 ± 9 132 ± 11
CM
n=3 n=3 n=3 n=5 n=5
83 ± 3 * 94 ± 7 100 ± 6 73 ± 9 * 82 ± 7 *
NR1
n=5 n=6 n=5 n=6 n=5
Hembras
MeHg PCB153 PCB153Hg PCB126 PCB126Hg
66 ± 6 * 87 ± 17 134 ± 24 145 ± 18 * 111 ± 13
nNOS
n=6 n=7 n=7 n=5 n=5
75 ± 12 * 91 ± 6 71 ± 12 * 92 ± 12 102 ± 13
GCα
n=5 n=5 n=5 n=4 n=5
97 ± 5 103 ± 5 95 ± 2 107 ± 6 100 ± 5
GCβ
n=6 n=6 n=5 n=8 n=7
62 ± 19 * 96 ± 27 118 ± 24 189 ± 42 * 140 ± 17 *
CM
n=4 n=4 n=4 n=5 n=5
98 ±15 114 ± 14 113 ± 15 104 ±12 108 ±13
NR1
n=6 n=6 n=5 n=5 n=5
86
RESU
ULTADOS
El efe
ecto sobre el
e contenido de nNOS desaparece en
e ratas
ex
xpuestas a la combinacción de PCB
B126 + MeH
Hg, pero no
o así el
au
umento del contenido
c de
e calmodulin
na en hembra
as ni la dism
minución
de
e NR1 en machos. Ademá
ás, la exposición perinattal a PCB126 + MeHg
prroduce en machos, pe
ero no en hembras, un
u aumento
o de la
su
ubunidad α y una disminución de la subunidad
d β de la gu
uanilato
cicclasa soluble
e. (Tabla 2)
Fig
g. 18. Imág genes represe
entativas de “Western bllot” de homog
genados
de cerebe
elo de ratass de 3 mese es expuestas perinatalmmente a
PCB153, PC
CB126 y/o MeeHg
87
RESULTADOS
88
RESULTADOS
para aprender
100
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
A
Número de ensayos necesarios
Machos
125
para aprender
100
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
B
Número de ensayos necesarios
125 Total
para aprender
100
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
C
Fig. 19. A los 8 meses de edad, la capacidad de aprendizaje de las
ratas perinatalmente expuestas a PCB153, PCB126 y/o MeHg no es
diferente de la de las ratas control. Ratas de 8 meses de edad
expuestas perinatalmente a los neurotóxicos fueron sometidas al test
del laberinto en Y. Los valores son la media ± SEM del número de
ensayos necesarios para aprender la tarea. (ANOVA de un criterio y
Tuckey post-hoc)
A. Ratas hembra (Control n=8; MeHg n=6; PCB153 n=6; PCB153
+ MeHg n=5; PCB126 n=7; PCB126 + MeHg n=7)
B. Ratas macho (Control n=5; MeHg n=4; PCB153 n=5; PCB153 +
MeHg n=5; PCB126 n=5; PCB126 + MeHg n=6)
C. Total de ratas, machos y hembras (Control n=13; MeHg
n=10; PCB153 n=11; PCB153 + MeHg n=10; PCB126 n=12;
PCB126 + MeHg n=13)
89
RESULTADOS
90
RESULTADOS
una muestra los resultados de las ratas expuestas a cada PCB solo o
en combinación con MeHg, comparándolos con los mismos controles
y ratas expuestas a MeHg en ambas gráficas.
Concentración de GMPc extracelular
700 Control
MeHg
(% de la concentración basal)
PCB 153
600 PCB153 + MeHg
400
300
NMDA 300 uM
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
A
Control
Concentración de GMPc extracelular
700
MeHg
(% de la concentración basal)
PCB126
600 PCB126+MeHg NMDA 300 uM
500
400
300
NMDA 300 uM
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
B
Fig. 20. Las ratas macho control o perinatalmente expuestas a MeHg,
PCB153, PCB126 o sus combinaciones tienen a los 8 meses de edad
una función de la vía Glu-NO-GMPc similar. Los valores se expresan
como porcentaje de la concentración basal de GMPc (media de las
fracciones 1-5) y son la media ± SEM del número de ratas indicado en
cada caso:
A. Ratas macho (control n=8; MeHg n=6; PCB 153 n=6; PCB153 +
MeHg n=7)
B. Ratas macho (control n=8; MeHg n=6; PCB 126 n=8; PCB126 +
MeHg n=9)
91
RESULTADOS
500
(% de la concentración basal)
NMDA 300 uM
PCB 153
400 PCB153 + MeHg
300
NMDA 300 uM
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
A
500
Control
Concentración de GMPc extracelular
MeHg
(% de la concentración basal)
PCB126
400 PCB126+MeHg
NMDA 300 uM
300
NMDA 300 uM
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
B
Fig. 21. Las ratas hembra control o perinatalmente expuestas a
MeHg, PCB153, PCB126 o sus combinaciones tienen a los 8 meses de
edad una función de la vía Glu-NO-GMPc similar. Los valores se
expresan como porcentaje de la concentración basal de GMPc (media de
las fracciones 1-5) y son la media ± SEM del número de ratas indicado
en cada caso:
A. Hembras (control n=7; MeHg n=5; PCB 153 n=6; PCB153 +
MeHg n=7)
B. Hembras (control n=7; MeHg n=5; PCB 126 n=6; PCB126 +
MeHg n=10)
92
RESULTADOS
(% de la concentración basal)
PCB 153
600 PCB153 + MeHg
NMDA 300 uM
500
400
NMDA 300 uM
300
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
A
Concentración de GMPc extracelular
700 Control
MeHg
(% de la concentración basal)
600 PCB126
PCB126+MeHg
500
NMDA 300 uM
400
NMDA 300 uM
300
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fracción
B
Fig. 22. Las ratas control o perinatalmente expuestas a MeHg,
PCB153, PCB126 o sus combinaciones tienen a los 8 meses de edad
una función de la vía Glu-NO-GMPc similar. Los valores se expresan
como porcentaje de la concentración basal de GMPc (media de las
fracciones 1-5) y son la media ± SEM del número de experimentos
indicado en cada caso. Se han combinado los datos de las figuras 20 y
21
A. Machos y hembras (control n=15; MeHg n=11; PCB 153 n=12;
PCB153 + MeHg n=14)
B. Machos y hembras (control n=15; MeHg n=11; PCB 126 n=14;
PCB126 + MeHg n=19)
93
RESULTADOS
94
RESULTADOS
95
RESULTADOS
3 meses 8 meses
para aprender
100
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
A
3 meses 8 meses
Número de ensayos necesarios
150
Machos
125
***
para aprender
100 ***
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
B
3 meses 8 meses
150
Número de ensayos necesarios
Total
125
para aprender
100 *** **
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 P153Hg PCB126 P126Hg
C
96
RESULTADOS
97
RESULTADOS
200
175
***
150
*
125
100
75
50
25
0
Control MeHg PCB153 PCB153Hg PCB126 PCB126Hg
98
RESULTADOS
550
500 NMDA 0,3 mM
inducido por NMDA
Aumento de GMPc
450
400
(% del basal)
350
300 *
250 *
200 **
150
100
50
0
Control MeHg PCB153 PCB153HgPCB126 PCB126Hg
99
RESULTADOS
Exposición perinatal
PCB153 PCB126
Proteína MeHg PCB153 PCB126
+MeHg +MeHg
80 ± 22* 120 ± 21 96 ± 20 90 ± 10 100 ± 26
CM
n = 14 n=4 n=5 n=4 n=6
98 ± 19 103 ± 36 105 ± 77 104 ± 16 58 ± 20 **
nNOS
n = 13 n=2 n=2 n=5 n=6
100 ± 47 86 ± 21 88 ± 17 94 ± 17 144 ± 28 *
GCs-alfa
n=8 n=3 n=3 n=5 n=6
74 ± 11 ** 78 ± 27 82 ± 15 95 ± 10 117 ± 32
GCs-beta
n = 16 n=4 n=4 n=4 n=6
Los valores son la media ± SEM del número de cultivos indicado.
Se expresan como porcentaje del contenido de cada proteína en las
neuronas control. Los valores significativamente diferentes de las neuronas
control se indican mediante asteriscos (*p<0,05, ** p<0,001)
100
RESULTADOS
101
RESULTADOS
100
90 Control
80 * *
Viabilidad neuronal
**
70
(% del total)
60 *
50
**
40
30
20
10 PCB 153
0
10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4
Concentración de PCB (M)
102
RESULTADOS
100
90 Control
80 *
Viabilidad neuronal
* * ** * *
70 * *
(% del total)
60
50 *
40
30 ***
20
**
10
PCB 126
0
10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4
Concentración de PCB (M)
103
RESULTADOS
100
90 Control
80 * * * *
Viabilidad neuronal
** *
70 *
(% de basal)
60
50 **
40
30
20
10
0
MeHg
10 -12 10 -11 10 -10 10 -9 10 -8 10 -7
MeHg (M)
104
RESULTADOS
105
RESULTADOS
150
BASAL
A
GMPc intracelular
125
(% de control)
100
75
50
25
0
(% de basal)
300
* *
200
100
C
inducido por SNAP
Aumento de GMPc
600
(% de basal)
500
400 * * *
300
200
100
0
0 1 3 5 10
MeHg (nM)
106
RESULTADOS
107
RESULTADOS
250
(% del control)
150 * ** **
100
50
0
0 0.1 0.3 1 3 10 30 50 100
600 B
(% del basal)
400 * **
300 **
**
200
100
0
0 0.1 0.3 1 3 10 30 50 100
Aumento de GMPc intracelular
700
C
inducido por SNAP
600
(% del basal)
500
400 * * *
*
300
200
100
0
0 1 3 10 30
PCB 153 μM
108
RESULTADOS
250
* A
**
GMPc intracelular
200
(% del control)
150
100
50
0
0 0.1 0.3 1 3
600
por NMDA (% del basal)
B
intracelular inducido
500
Aumento de GMPc
400
* *
300
**
200
100
0
0 0.1 0.3 1 3
por SNAP (% del basal)
1000
C
intracelular inducido
Aumento de GMPc
800
600
400
200
0
0 0.3 1 3
PCB 126 (μM)
109
RESULTADOS
110
RESULTADOS
111
RESULTADOS
400
intracelular
(% control)
200 *
** ** *
*
100
ntracelular inducido
Aumento de GMPc i 500
400 * *
300 ** ** ** **
* **
200
100
0
C 1 nM 10 nM 1 uM 3 uM 10 uM 1 uM 3 uM 10 uM 1 uM 3 uM 10 uM
Control MeHg PCB153 MeHg 1nM+PCB153 MeHg 10nM+PCB153
112
RESULTADOS
250
A
Contenido basal de
*
GMPc intracelular
200 * *
*
(% de basal)
*
150
100 a
50
0
por NMDA (% de control)
NMDA 0,3 mM B
intracelular inducido
600
Aumento de GMPc
500 a
400 * ** *
* **
300 **
* ** **
200
100
0
0 H 1 nM H 10 nM P 0.3 uM P 1 uM P 3uM P0.3 H1 P1 H1 P3 H1 P0.3 H10 P1 H10 P3 H10
113
RESULTADOS
GMPc intracelular
Compuesto Basal Ï por NMDA Ï por SNAP
PCB153 Ï (50 %) Ð (45 %) Ð (30 %)
PCB126 Ï (45 %) Ð (50 %) Ù
MeHg Ù Ð (50 %) Ð (50 %)
10 nM MeHg previene Potencia el
PCB153 + MeHg el efecto de PCB153 efecto individual
MeHg no previene el MeHg previene el
PCB126 + MeHg efecto de PCB126 efecto de PCB126
114
RESULTADOS
115
RESULTADOS
116
RESULTADOS
MeHg nM +
NR1 CM nNOS GCs-alfa GCs-beta
PCB153 µM
MeHg 1 + 96 ± 8 96 ± 11 99 ± 17 161 ± 67 110 ± 23
PCB153 1 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4
MeHg 1 + 102 ± 18 95 ± 4 120 ± 20 137 ± 68 115 ± 21
PCB153 3 n=4 n=4 n=3 n=4 n=4
MeHg 1 + 78 ± 7* 101 ± 11 108 ± 15 136 ± 27 143 ± 34
PCB153 10 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4
MeHg 10 + 89 ± 18 91 ± 17 94 ± 15 147 ± 25* 149 ± 38*
PCB153 1 n=4 n=4 n=3 n=4 n=4
MeHg 10 + 92 ± 14 97 ± 22 91 ± 22 131 ± 10* 145 ± 18**
PCB153 3 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4
MeHg 10 + 75 ± 6* 86 ± 27 112 ± 40 126 ± 4* 129 ± 10*
PCB153 10 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4
Los valores son la media + SEM de muestras triplicadas del
número de cultivos indicado en cada caso y se expresan como
porcentaje del contenido en neuronas control. Se han resaltado en
negrita y marcado con asteriscos los valores significativamente
diferentes del control. (*p<0,05, **p<0,01. ANOVA de un criterio)
117
RESULTADOS
118
RESULTADOS
119
DISCUSIÓN
121
DISCUSIÓN
5. DISCUSIÓN
123
DISCUSIÓN
124
DISCUSIÓN
125
DISCUSIÓN
126
DISCUSIÓN
127
DISCUSIÓN
128
DISCUSIÓN
129
DISCUSIÓN
130
DISCUSIÓN
131
DISCUSIÓN
132
DISCUSIÓN
133
DISCUSIÓN
134
DISCUSIÓN
135
DISCUSIÓN
136
DISCUSIÓN
137
DISCUSIÓN
138
DISCUSIÓN
139
DISCUSIÓN
140
DISCUSIÓN
guanilato ciclasa por NO) se afectan de modo diferente por los dos
PCBs.
141
CONCLUSIONES
143
CONCLUSIONES
6. CONCLUSIONES
145
CONCLUSIONES
146
CONCLUSIONES
147
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