P. 1
Técnicas para Extração de DNA,RNA e Proteínas

Técnicas para Extração de DNA,RNA e Proteínas

|Views: 26.027|Likes:
Publicado porEme Cê

Técnicas Laboratoriais para laboratório de biotecnologias, com especificação de propriedades de soluções e substâncias

Técnicas Laboratoriais para laboratório de biotecnologias, com especificação de propriedades de soluções e substâncias

More info:

Categories:Types, Research, Science
Published by: Eme Cê on Nov 17, 2010
Direitos Autorais:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/06/2015

pdf

text

original

O corante Coomassie Blue reage com a cadeia polipeptídica.
Há poucos agentes interferentes.
Não funciona bem com proteínas básicas e sofre interferência de detergentes como o
Triton X-100, SDS e NP-40 quando estes estão em concentração acima de 0,2%.

Reagente de Bradford:
100 mg de Coomassie Blue G 250
Dissolver em 50 mL de etanol a 95%.
Adicionar 100 mL de ácido fosfórico (H3PO=17M)
Completar com água para volume final de 200 mL. Estável a 4º por até 6 meses.

Tampão PBS
NaCl 150 mM
NaHPO4 10mM pH 7,2
Solução padrão de: Albumina Bovina (BSA) 1mg/mL em tampão PBS
Imunoglobulina G (IgG) 1mg/mL em tampão PBS

Método:

Gurupi/2010

92

UFT

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

1.Montar curva padrão de diluição da solução-padrão de proteína em um volume
final de 100 µL. Cobrir a faixa de 0 a 150 µg de proteína. Fazer cada tubo em
triplicata.
2.Preparar as amostras em volume final de 100 µL para teste diluindo as em PBS,
de modo que a concentração final caia na faixa até 150 µg. Fazer dois ou três
pontos diferentes caso não tenha idéia da concentração da amostra. Testar
diluições de 1: 100, 1; 500 e 1; 1000 é um começo.
3.Diluir a solução de Bradford cinco vezes em água destilada (ex; 10 mL de
reagente de Bradford misturados a 40 mL de água para cerca de 50 tubos).Se
houver precipitado, filtrar em papel de filtro.
4.Misturar 900 µL de solução de Bradford diluída em cada um dos tubos da curva-
padrão e das amostras

TUBOS

REAGENTES

1

2

3

4

5

6

7

8

SOL. PADRÃO
DE PROTEÍNA
(µL)

0

10

20

40

80

100

-

-

AMOSTRA (µL)

-

-

-

-

-

-

10

100

ÀGUA (µL)

100

90

80

60

20

-

90

-

Reagente Bradford
(µL)

900

900

900

900

900

900

900

900

5.Deixar a cor estabilizar por 5’ não mais que 30’.
6.Determinar a A595 para cada um dos pontos experimentais.

Gurupi/2010

93

UFT

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

7.Calcular a curva padrão com papel gráfico linear. Quotar cada ponto da curva de
calibração, determinar a melhor reta e calcular a concentração protéica da
amostra.

8.Para uma maior precisão, calcular a melhor reta matematicamente por regressão

linear.

Referências bibliográficas

Vanzela, L.L. A.; Souza, R. F. Avanços da Biologia Celular e da Genética Molecular.
São Paulo, ed. UNESP, 2009.

Kreuzer, H.; Massey, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre, ed.
Artmed, 2002.

Michel, A.; Cesaro, T. Contribuições da Biotecnologia para a Agricultura.

Azevedo, O. M.; Felipe, S. M.; Brígido, M.M.; Maranhão, Q. A.; Souza, T. M.
Técnicas Básicas em Biologia Molecular. Brasília, ed. Brasília, 2003.

Gurupi/2010

94

You're Reading a Free Preview

Descarregar
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->