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Técnicas para Extração de DNA,RNA e Proteínas

Técnicas para Extração de DNA,RNA e Proteínas

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Técnicas Laboratoriais para laboratório de biotecnologias, com especificação de propriedades de soluções e substâncias

Técnicas Laboratoriais para laboratório de biotecnologias, com especificação de propriedades de soluções e substâncias

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Categories:Types, Research, Science
Published by: Eme Cê on Nov 17, 2010
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O DNA de fita simples absorve mais que o DNA de fita dupla helicoidal por que as
bases estão encontradas no interior das hélices. Essa informação permite monitorar por
espectrofotometria o momento da desnaturação da fita dupla, que é de rápida transição,
que é caracterizada por aumento da absorbância da mistura analisada (efeito
hipercrômico).

Ao contrário dos peptídeos, as bases aminadas nos ácidos nucléicos são cromóforos
fortes. As 5 bases encontradas no DNA ou RNA absorvem entre 250 e 280nm. O padrão
de absorção típico de proteínas é a 280nm. O padrão de absorção típico de DNA é a
260nm.
*Razão ótima entre A260/ A280
DNA 1,8 - 1,9
RNA 1,9 – 2,0
Quando há proteínas, esses valores são diminuídos.
Campos aromáticos (fenóis) também interferem e eles são usados na purificação de
DNA e RNA.
Espectrofotometria para avaliação de pureza, e quantificar a partir do passo 8.

1.Diluir a amostra de DNA 1:500 em 1mM Tris-HCL; pH 7.5
2.Preparar o TE: (10mM tris-HCL; pH 8.0; 1mM EDTA)
3.Adicionar 1mL de TE à cubeta de quartzo e zerar a 260 nm com o branco
(branco=TE)
Não usar cubeta de vidro que é opaca á radiação ultravioleta.
4.Adicionar 1mL da diluição na cubeta (sem o TE)
5.Ler a 260nm
6.Repetir as leituras em 230, 280 e 320 nm

Gurupi/2010

62

UFT

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

Se o aparelho não for de feixe duplo, zerar com o branco em cada comprimento de
onda.

7.*Avaliar a pureza: A260 /A280 >ou igual 1,8
A320< 0,1 . A260
8.Calcular a [DNA] ou [RNA] conforme a fórmula mais conveniente

A estimativa da concentração de DNA depende do tipo e quantidade de amostra
disponível. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nível de contaminação
por proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou outros ácidos nucléicos, a estimativa
por espectrofotômetro, medida pela absorbância das bases a 260 nm consiste num
método simples, rápido e com certa precisão.
Para quantificação de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm até 320 nm. A
leitura a A260nm permite o cálculo da concentração de ácidos nucléicos na amostra.
Uma DO (Densidade óptica) de l corresponde aproximadamente a 50 µg ml-1

para DNA

dupla fita, 40 µg ml-1

para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 µg ml-1

para

oligonucleotídeos.

*A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da pureza dos
ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem valores de DO260/DO280 entre
1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminação com fenol ou proteínas, a relação
DO260/DO280 será muito menor, e a precisão nas quantidades de ácidos nucléicos será
baixa.

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