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S.

Mendo
08/09

3ª Aula:
Cultivo e Crescimento de MO
Conceitos/conhecimentos chave a
S.Mendo
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apreender
• Diferentes tipos nutricionais dos microrganismos
• Crescimento e manutenção de microrganismos em
laboratório (culturas puras e contagem de bactérias- UFC, tipos de
meios de cultura; técnicas de inoculação)
• Curva de crescimento bacteriano e taxa específica de
crescimento
• Influência de alguns factores no crescimento microbiano
(pH, temperatura, nutrientes, oxigénio)
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NUTRIÇÃO MICROBIANA

Nutrientes – substâncias utilizadas na biossíntese e


produção de energia (necessárias ao crescimento dos
microrganismos).

95% composição da célula microbiana-


Macronutrientes: C, O, S, H, N, P (constituintes de
hidratos de carbono, lípidos proteínas, ác. nucleicos); e
outros (Mg2+, Ca2+, Fe2+/3+)

as células também necessitam de elementos vestigiais-


Micronutrientes: Mn, Co, Zn, Mo (em pequenas
quantidades- )
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FONTES DE C, ENERGIA, H e e-
FONTE DE CARBONO
faz parte do esqueleto de todos as células
Microganismos

Autotróficos: utilizam o CO2 como única fonte de Carbono

Heterotróficos: utilizam moléculas orgânicas reduzidas como


fonte de C (geralmente produzidas por outros organismos)

Conceito de Auxotrofia vs Prototrofia


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FONTE DE ENERGIA DE H OU e-

ENERGIA

Fototróficos: luz
Quimiotróficos: Oxidação de compostos orgânicos e
inorgânicos

H ou e-
Litotróficos: moléculas inorgânicas reduzidas
Organotróficos: moléculas orgânicas reduzidas
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Tipos nutricionais
Fontes de E, H/electrões e C
dos microrganismos

Fotolitotróficos autotróficos Luz; Mol. Inorgânica dadora de H e e- ; CO2

Fotoorganotróficos heterotróficos Luz; Mol. orgânica dadora de H e e-; Mol.


orgânica como fonte de C (CO2 pode ser
usado)
Química (Mol. Inorg.); Mol. Inorg dadora de
Quimiolitotrófico autotrófico H e e- ; CO2 como fonte de C

Quimiolitotrófico heterotróficos Química (Mol. org.); Mol. Orgânica; Mol.


Orgânica como fonte de C
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OUTROS REQUISITOS NUTRICIONAIS

Azoto: Fósforo: Enxofre:

Aminoácidos Proteínas Cys, Met


Purinas Ácidos nucleicos Alguns hidr. de
Pirimidinas fosfolípidos carbono
Lípidos Biotina
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FACTORES DE CRESCIMENTO
compostos orgânicos, componentes essenciais da célula,
sintetizados por MO

aminoácidos

purinas e pirimidinas

vitaminas (pequenas mol. orgânicas que fazem parte de cofactores


enzimáticos)

Biotina
Niacina
Riboflavina-B2-
Ácido fólico Ex. Lactobacillus: várias mutações acumuladas
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CRESCIMENTO E MANUTENÇÃO DE
MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO

DEFINIDOS OU SINTÉTICOS
Meios de cultura

COMPLEXOS
(peptona, extracto de carne e extracto de
levedura)
ex: NB e TSB
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TIPOS DE MEIOS DE CULTURA

• MEIOS DE USO GERAL

• SELECTIVOS

• DIFERENCIAIS

Meios sólidos: 1,5-2% de Agar (agente solidificante)

Meios semi- sólidos: 0,7% de Agar (“soft agar”)


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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

Em habitas naturais os MO crescem em populações


mistas contendo diferentes espécies

Estudos de MO implica o seu isolamento em culturas


puras

Espalhamento em placa de Petri contendo meio


agarizado

Diluições da cultura mista inoculadas em placa de


agar
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Método de isolamento de colónias bactérianas: riscado por exaustão


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MORFOLOGIA DAS COLÓNIAS BACTERIANAS

figura
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ESTERILIZAÇÃO
“Processo pelo qual todas as células vivas, esporos viáveis,
vírus e viróides são destruídos”

Calor húmido: autoclave, 121ºC, 1atm, 15-20 min.

Calor seco: estufa seca, 180ºC, 2h; chama.

Filtração: membrana de acetato de celulose c/


0,22 m de Ø

Radiação: ionizante, UV
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TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO

Riscado em placa - culturas puras

dil. décimais
Sementeira à superfície
(100 l de amostra)

Sementeira por incorporação


(análise quantitativa de uma amostra muito contaminada)

Filtração por membranas


Diluições décimais S.Mendo
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Filtração
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CONTAGEM DE COLÓNIAS BACTERIANAS

Expresso em UFC– Unidade Formadora de Colónias

CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS

placa de agar, 4ºC (2-3 semanas)


glicerol, -20ºC (meses)
glicerol, -80ºC (anos)
liofilizados (alguns anos)
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CRESCIMENTO MICROBIANO
Aumento dos constituintes celulares – pode ser medido
pelo aumento do tamanho das células/ nº de células
(FISSÃO BINÁRIA E GEMULAÇÃO)

Curva de crescimento: gráfico do logaritmo do nº de


células x tempo de incubação, representa o crescimento
de um MO num sistema fechado sem adição de nutrientes.

TEMPO DE DUPLICAÇÃO (td) ou GERAÇÃO (tg): a


população duplica durante um determinado intervalo de tempo (fase
exponencial).
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EXEMPLO: E. coli (em condições adequadas) – td = 20min.


Tempo Nºdivisões 2n População (N 0 x2n)
0 0 n=0 1
20 1 n=1 2
40 2 n=2 4
60 3 n=3 8
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µ = µ máx
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µ=0

µ < µ máx
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CRESCIMENTO MICROBIANO EXPRESSO POR EQUAÇÕES


MATEMÁTICAS:

log N- log N0 + n log2

N = N0 x 2n log N- log N0 = nlog2; n= log N- log N0 / log 2

= log N – log N0 / 0,301 = 3,3 (log N- log N0)

Se a população crescer durante o tempo t


n = t/ td
(n = nºde gerações)

Nt = 2n N0 Equação geral para o crescimento de células


(N = nºde células)

lnNt - lnN0 = nln2 = 0,693 t/ td


Equação expressa em log
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CRESCIMENTO EXPONENCIAL
A representação gráfica dos logaritmos naturais da
densidade populacional em função do tempo traduz-se
numa relação linear (utiliza-se papel logarítmico).

Assumindo que, numa cultura microbiana, em condições de


crescimento equilibrado, a taxa de aumento da população no tempo t
é proporcional à densidade populacional x, então a taxa de específica
crescimento ( ) é dada por:

= 1/x . dx/dt
1 Corresponde ao
declive da recta
Integrando xt= x0 . e t ln xt= ln x0 . t
2 3
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A taxa específica de crescimento ( ) relaciona-se com


o tempo médio de duplicação (td) para a população,
por substituição de xt= 2x0 e t= td na eq. 3:

td= ln2/ = 0.693/

. A taxa específica de crescimento é um indicador da


resposta do MO às condições e ao meio em que estão a
crescer.
Cada MO tem o seu td característico, relacionado com a taxa específica
de crescimento .
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EXEMPLO

(Log nºcél)
LB

E. coli MM

(t)

Meio rico (LB), a 37ºC (td pequeno e maior)

Meio mínimo ou temperaturas superiores/ inferiores


conduzem a uma alteração do td e do

Existe sempre um valor de óptimo para cada espécie


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CRESCIMENTO DIÁUXICO: em meios complexos, contendo por


exemplo dois substratos como fontes de C e energia. (por
exemplo glucose e lactose).

nºde cél

lactose
glucose

t
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AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DO CRESCIMENTO


MICROBIANO

Geralmente são avaliados um de dois parâmetros:


I. massa celular
II. nºde células

I. DETERMINAÇÃO DA MASSA CELULAR


métodos directos pesagem dos MO (peso seco)
métodos indirectos dispersão da luz que atravessa a
suspensão

Medida da diminuição da luz transmitida – densidade óptica (DO) (Absorvência)


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II. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS


(contagem ao microscópio usando câmaras de contagem)

Nem todas as bactérias que se contam vão dar origem a uma


colónia.

Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única


célula, o que nem sempre é verdade. Os resultados são expressos
em U.F.C.
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Câmaras de Neubauer
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FACTORES QUE AFECTAM O CRESCIMENTO


BACTERIANO

CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES
TEMPERATURA
PH
OXIGÉNIO
ACTIVIDADE DA ÁGUA (aw)
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4 GRUPOS:

Psicrófilos: abaixo dos 20 ºC


Mesófilos: entre 20 e 44 ºC
Termófilos: entre 45 e 70 ºC
Hipertermófilos: entre os 70 e 110 ºC
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pH

Acidófilos e Alcalófilos
Tolerância ao oxigénio S.Mendo
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MÉTODOS FÍSICOS E QUÍMICOS DE CONTROLO


E DESTRUIÇÃO DE MICRORGANISMOS

Os MO podem ser necessários ao ser humano e trazer


alguns benefícios
Muitos MO são responsáveis por doenças e putrefacção de
géneros alimentícios

Técnicas de assepsia (microbiologia)


Preservação de alimentos
Prevenção/ tratamento de doenças
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ALGUNS TERMOS IMPORTANTES

Esterilização - eliminar todos os MO de um objecto ou habitat

Desinfecção - inibição, morte ou remoção de MO que podem


causar doenças. Geralmente os desinfectantes são de origem química
e não implicam necessariamente a remoção de esporos.

Antiséptico - controlo do crescimento de MO em tecidos vivos, por


acção de agentes químicos. Estes compostos inibem temporariamente
o crescimento ou matam MO. Adicionalmente, não podem ser tóxicos
para o hospedeiro.

Germicidas – matam MO patogénicos e não patogénicos


Bactericidas (fungicidas, viricidas,etc) – se matam MO
Bacteriostáticos (fungistáticos) – se inibem o crescimento
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Antisépticos e desinfectantes
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CONDIÇÕES QUE AFECTAM A EFICÁCIA DE


UM AGENTE ANTIMICROBIANO

1. Tamanho da população
2. Composição da população
3. Concentração do agente antimicrobiano
4. Duração da exposição ao agente antimicrobiano
5. Condições do local onde ocorre a exposição
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MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLO DE MO

Calor Filtração Radiação UV e ionizante


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MORTE CELULAR

A morte celular obedece a um padrão e, à semelhança do


que ocorre com o crescimento celular, pode ser exponencial
ou logarítmica.
log nºcéls.

D121

t (min.)
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CALOR HÚMIDO
Autoclave – para destruição de células de endósporos
bacterianos (atmosfera saturada de vapor e sobre
pressão, 1atm)

degradação de ácidos nucleicos


desnaturação de enzimas e outras proteínas

Pasteurização Tindalização

63ºC, 30 min. 90-100ºC, 30 min.


72ºC, 15 seg. (HTST) 3 dias consecutivos
140-150ºC, 1-3 seg. (UHT) Incubações a 37ºC
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FILTRAÇÃO:
Membranas com poro de 0,2 m (de acetato de celulose,
policarbonato, nitrato de celulose, etc).

Filtração do ar:

câmara de fluxo
máscaras cirúrgicas
salas assépticas
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Filtração
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RADIAÇÃO
UV pode ser letal. Não atravessa superfícies de
UV-
forma eficaz, pelo que é utilizada para a sua
esterilização.

Ionizante (radiação Gama do Cobalto 60)- penetra


dentro dos objectos, pelo que é utilizada para
esterilização de material descartável de plástico.
Também é utilizada para esterilização de
antibióticos e hormonas.
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Radiação
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MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLO DE MO

COMPOSTOS FENÓLICOS

poderosos microbicidas
muito tóxicos
alterações na membrana celular dos MO
bactericidas ou bacteriostáticos (depende da concentração)

ALCOÓIS

agentes antisépticos e desinfectantes


coagulação de proteínas
solubilização de lípidos destruição de membranas celulares
bactericidas ou fungicidas
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COMPOSTOS HALOGENADOS

gás ou associado a agentes libertadores de cloro


utilizados como desinfectante de águas de consumo e piscinas
destruição da actividade de proteínas celulares (oxidação dos grupos
sulfidrilo e reacções de N- e C- clorinação e descarboxilação)

IODO

interacção com enzimas essenciais ou proteínas (reacções de


grupos -SH, Iodo -NH aa)
desinfecção de feridas
preparação do campo operatório (Betadine- iodo e
polivinilpirrolidona)
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METAIS PESADOS

inactivação de proteínas celulares


tratamento de pequenas feridas e infecções da pele (mercuriocromo)

DETERGENTES CATIÓNICOS

compostos de amónio quaternário


activos contra a maioria das bactérias (excepto Mycobacterium
tuberculolosis e endósporos)
disrupção das membranas e desnaturação de proteínas
baixa toxicidade
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ALDEÍDOS

Formaldeído
- tóxico e letal para todos os micróbios e esporos
- bactericida, esporocida e virucida

Glutaraldeído
- sol. aq. 2% menos irritante que o Formaldeído
- desinfecção de material hospitalar
- desnaturação de proteínas e ác. nucleicos

ÓXIDO DE ETILENO

gás (temp. ambiente)


microbicida e esporicida
agente alquilante, inactiva enzimas e proteínas
esterilização de material de polietileno ou empacotado em papel