COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 . iodo. Essa maneira de reagir diferentemente. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-). etanol-acetona e fucsina básica. com os reagentes cristal violeta. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.bacteriano. frente ao Gram. fixado pelo calor. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa.

o corante primário é retido e as células permanecem coradas. decorando as células. podendo produzir resultados falsos. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. porosidade e integridade. Células de bactérias Gram-positivas. o cristal violeta. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. em seus citoplasmas. que é maior que a molécula de CV que penetrou. densidade. Por outro lado. a amostra é tratada com um corante secundário. Ao microscópio. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. A retenção ou não do corante primário é. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. insolúvel. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. células velhas. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. que não consegue reter o complexo. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Por outro lado. quando corretamente realizada e interpretada. portanto. tornando-as impermeáveis ao complexo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. A etapa da descoloração é crítica. o uso de material fresco é importante. seguido de tratamento com um fixador. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. o lugol. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. Em seguida. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. com um corante primário. a fucsina básica.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. Portanto. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo.

6. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. 5. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. Flambar novamente a alça 3. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. 7. 2. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 4. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. Homogeneizar este material com a gota de água. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Fixar o esfregaço. Flambar a alça corretamente 2. O corante cristal violeta pode ser substituído. 3. 7. procurando obter um esfregaço fino. 5 . 5. 5. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Realizar a coloração. Lavar rapidamente em água corrente. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2. 8. 6. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Colocar com a própria alça. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. Secar à temperatura ambiente. com os mesmos resultados. Secar a lâmina por exposição ao ar. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. OBS. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 6.com etanol-acetona for omitido. Espalhar o material sobre a lâmina. rapidamente. COLORAÇÃO 1. já flambada. Lavar rapidamente em água corrente. 4. Lavar rapidamente em água corrente. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. Lavar uma ou duas vezes. 4.

com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. 10. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. Os esfregaços não devem ser muito espessos.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. 9. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 . tomando o cuidado de não remover o esfregaço. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. Lavar novamente em água corrente. Porém. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.7.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Ela deve ser efetuada rapidamente. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). 8. Secar a lâmina.

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