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Prática - Coloração de Gram

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07/13/2013

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COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

bacteriano. iodo. Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa. com os reagentes cristal violeta. fixado pelo calor. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. frente ao Gram. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 . Essa maneira de reagir diferentemente. etanol-acetona e fucsina básica. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-). enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

insolúvel. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. tornando-as impermeáveis ao complexo. Ao microscópio. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. portanto. Portanto. podendo produzir resultados falsos. o cristal violeta. seguido de tratamento com um fixador. em seus citoplasmas. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. a amostra é tratada com um corante secundário. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. Por outro lado. Por outro lado. que não consegue reter o complexo. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. densidade. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. com um corante primário. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Células de bactérias Gram-positivas. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. porosidade e integridade. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. A retenção ou não do corante primário é. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. o lugol. a fucsina básica. o uso de material fresco é importante. Em seguida. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. células velhas. decorando as células. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. quando corretamente realizada e interpretada. o etanol-acetona (1:1 v:v). A etapa da descoloração é crítica. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante.

Secar a lâmina por exposição ao ar. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 4. 5. Lavar rapidamente em água corrente. 5 . PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. COLORAÇÃO 1. 7. Secar à temperatura ambiente. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. 4. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. com os mesmos resultados. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. OBS. Lavar uma ou duas vezes. 2. 3. Lavar rapidamente em água corrente. Realizar a coloração. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. já flambada. Colocar com a própria alça. Flambar novamente a alça 3. Flambar a alça corretamente 2. Espalhar o material sobre a lâmina. 7. Homogeneizar este material com a gota de água. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. 4. 5. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. 5. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 6. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Fixar o esfregaço. 8.com etanol-acetona for omitido. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. rapidamente. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 6. procurando obter um esfregaço fino. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. Lavar rapidamente em água corrente. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. O corante cristal violeta pode ser substituído. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. 6.

Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. Lavar novamente em água corrente.7. Os esfregaços não devem ser muito espessos. 10. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. 8. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 . Porém. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. tomando o cuidado de não remover o esfregaço.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente. 9. Secar a lâmina. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações.

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