COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. iodo. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo).bacteriano. fixado pelo calor. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 . Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-). com os reagentes cristal violeta. Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa. frente ao Gram. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). Essa maneira de reagir diferentemente. etanol-acetona e fucsina básica.

A retenção ou não do corante primário é. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. quando corretamente realizada e interpretada. o uso de material fresco é importante. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. o lugol. Em seguida. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Portanto. decorando as células. portanto. A etapa da descoloração é crítica. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. células velhas. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. seguido de tratamento com um fixador. tornando-as impermeáveis ao complexo. o cristal violeta. densidade. o etanol-acetona (1:1 v:v). mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. em seus citoplasmas.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. que não consegue reter o complexo. a amostra é tratada com um corante secundário. Por outro lado. Ao microscópio. Por outro lado. com um corante primário. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Células de bactérias Gram-positivas. podendo produzir resultados falsos. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. insolúvel. a fucsina básica. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. porosidade e integridade.

Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 4. Espalhar o material sobre a lâmina.com etanol-acetona for omitido. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. procurando obter um esfregaço fino. Flambar a alça corretamente 2. Fixar o esfregaço. 2. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Flambar novamente a alça 3. 6. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. O corante cristal violeta pode ser substituído. 6. 5. Colocar com a própria alça. 8. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. 5 . 5. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. já flambada. Lavar rapidamente em água corrente. 5. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Lavar rapidamente em água corrente. 7. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 6. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. OBS. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. Lavar uma ou duas vezes. 7. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. rapidamente. Secar à temperatura ambiente. 3. 4. Realizar a coloração. Homogeneizar este material com a gota de água. COLORAÇÃO 1. Lavar rapidamente em água corrente. Secar a lâmina por exposição ao ar. com os mesmos resultados. 4. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2.

10. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. Porém. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 . devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 9. Lavar novamente em água corrente. 8. Secar a lâmina. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram.7.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Os esfregaços não devem ser muito espessos. Ela deve ser efetuada rapidamente. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.

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