COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

com os reagentes cristal violeta. Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). fixado pelo calor. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 . Essa maneira de reagir diferentemente. iodo. etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. frente ao Gram. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo).bacteriano. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-).

A etapa da descoloração é crítica.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. A retenção ou não do corante primário é. Ao microscópio. Em seguida. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. seguido de tratamento com um fixador. em seus citoplasmas. O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . células velhas. o cristal violeta. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. quando corretamente realizada e interpretada. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. que não consegue reter o complexo. o etanol-acetona (1:1 v:v). as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. o uso de material fresco é importante. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. portanto. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. Por outro lado. decorando as células. densidade. podendo produzir resultados falsos. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. porosidade e integridade. insolúvel. Células de bactérias Gram-positivas. Por outro lado. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. com um corante primário. que é maior que a molécula de CV que penetrou. a amostra é tratada com um corante secundário. o lugol. a fucsina básica. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. tornando-as impermeáveis ao complexo. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. Portanto. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos.

com os mesmos resultados. 7. Flambar a alça corretamente 2. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Secar a lâmina por exposição ao ar. 5. OBS. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. Colocar com a própria alça. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. 3.com etanol-acetona for omitido. 6. Lavar rapidamente em água corrente. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Flambar novamente a alça 3. 2. Espalhar o material sobre a lâmina. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. O corante cristal violeta pode ser substituído. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. Lavar rapidamente em água corrente. Lavar uma ou duas vezes. 5 . 7. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. 6. 4. 4. 6. 4. Fixar o esfregaço. COLORAÇÃO 1. procurando obter um esfregaço fino. rapidamente. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Lavar rapidamente em água corrente. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. 8. Homogeneizar este material com a gota de água. já flambada. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. 5. Realizar a coloração. Secar à temperatura ambiente. 5. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2.

tomando o cuidado de não remover o esfregaço. Porém.7. Lavar novamente em água corrente. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 . Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Secar a lâmina. 10. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. Ela deve ser efetuada rapidamente. 8. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Os esfregaços não devem ser muito espessos. com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). 9.