COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). etanol-acetona e fucsina básica. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-). com os reagentes cristal violeta. frente ao Gram. iodo. Essa maneira de reagir diferentemente. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 . Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). fixado pelo calor.bacteriano.

o corante primário é retido e as células permanecem coradas. com um corante primário. O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. tornando-as impermeáveis ao complexo. podendo produzir resultados falsos. A etapa da descoloração é crítica. o cristal violeta. Em seguida. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. A retenção ou não do corante primário é.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. células velhas. Portanto. decorando as células. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. porosidade e integridade. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Ao microscópio. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . o lugol. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. o etanol-acetona (1:1 v:v). as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. a fucsina básica. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. em seus citoplasmas. o uso de material fresco é importante. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. portanto. seguido de tratamento com um fixador. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. que não consegue reter o complexo. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. densidade. Por outro lado. insolúvel. quando corretamente realizada e interpretada. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Células de bactérias Gram-positivas. Por outro lado. a amostra é tratada com um corante secundário.

cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. procurando obter um esfregaço fino. 6. Flambar a alça corretamente 2. 6. 6. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 4. Flambar novamente a alça 3. 4. 5. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Lavar rapidamente em água corrente. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. COLORAÇÃO 1. 5 . Esfriá-la nas paredes do tubo 3. 7. Homogeneizar este material com a gota de água. Lavar rapidamente em água corrente. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. 3. Espalhar o material sobre a lâmina. rapidamente. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. 8. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. Realizar a coloração. Secar a lâmina por exposição ao ar. Colocar com a própria alça. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2. Fixar o esfregaço. Lavar rapidamente em água corrente. 5. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. com os mesmos resultados. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. já flambada.com etanol-acetona for omitido. 5. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Lavar uma ou duas vezes. 4. 7. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Secar à temperatura ambiente. O corante cristal violeta pode ser substituído. OBS. 2. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1.

Ela deve ser efetuada rapidamente. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. Secar a lâmina. 10. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). Porém. Os esfregaços não devem ser muito espessos. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados.7. Lavar novamente em água corrente. 9. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 . 8.

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