COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

fixado pelo calor. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-). enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). com os reagentes cristal violeta. etanol-acetona e fucsina básica. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática 3 .bacteriano. iodo. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Gram positiva Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Complexo de membrana externa. frente ao Gram.

tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento 4 . Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. o uso de material fresco é importante. Por outro lado.Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. que não consegue reter o complexo. porosidade e integridade. o lugol. quando corretamente realizada e interpretada. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Células de bactérias Gram-positivas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. a amostra é tratada com um corante secundário. tornando-as impermeáveis ao complexo. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. decorando as células. portanto. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. seguido de tratamento com um fixador. A retenção ou não do corante primário é. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. com um corante primário. o etanol-acetona (1:1 v:v). em seus citoplasmas. células velhas. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Por outro lado. Portanto. A etapa da descoloração é crítica. a fucsina básica. insolúvel. podendo produzir resultados falsos. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. o cristal violeta. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano. Em seguida. Ao microscópio. densidade.

8. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2. Espalhar o material sobre a lâmina. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. 5. com os mesmos resultados. 3. O corante cristal violeta pode ser substituído. 6. 2. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. Secar a lâmina por exposição ao ar. OBS. 4.com etanol-acetona for omitido. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. 6. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. 4. 5 . 6. procurando obter um esfregaço fino. Flambar novamente a alça 3. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. Lavar rapidamente em água corrente. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. 4. rapidamente. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 5. Lavar rapidamente em água corrente. 5. Homogeneizar este material com a gota de água. COLORAÇÃO 1. já flambada. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Lavar uma ou duas vezes. Secar à temperatura ambiente. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Flambar a alça corretamente 2. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. Fixar o esfregaço. uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. Realizar a coloração. 7. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. 7. Colocar com a própria alça. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. Lavar rapidamente em água corrente. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto.

tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 9. 10. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Evitar estas culturas! Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. Secar a lâmina.  Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. 8. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. com bactérias G (+) apresentando-se como fracamente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados.   A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Ela deve ser efetuada rapidamente. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. Lavar novamente em água corrente. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Porém. Os esfregaços não devem ser muito espessos. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. podendo inclusive levar a erros? G(-) e bactérias G(-) corando-se   6 .7. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x).

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful