Relatório de Aula Prática 2 de Toxicologia – VPT 316:

Intoxicação por plantas que contém glicosídeos cianogênicos (Holocalyx glaziovii),

teste do picrato e coleta de amostragem para avaliação de micotoxinas.

Autores: Cintia Maria Monteiro de Araújo, Jaqueline de Oliveira Sena, Mariana Ramos Queiroz e Thiago Luis Santos
Gonçalves

1. INTRODUÇÃO

Plantas cianogênicas são aquelas que contêm como princípio ativo o ácido cianídrico (HCN).
O HCN encontra-se ligado a carboidratos denominados glicosídeos cianogênicos, sendo liberado
sob a forma de cianeto (CNˉ) durante a mastigação ou processamento destas plantas; este
produto é muito volátil e é resultado da ação de enzimas liberadas de vesículas no momento do
rompimento celular (β-glicosidade e hidroxinitrila-liase). Os glicosídeos cianogênicos têm sido
constatados em plantas de muitas famílias, entre elas: as Rosaceae, Leguminoseae, Gramíneae,
Araceae, Passifloraceae e Euforbiceae. Além das plantas, o HCN também é encontrado em
cogumelos, fungos e bactérias.

Plantas cianogênicas

Dentre as plantas cianogênicas mais importantes do Brasil estão as do gênero Manihot

(Euphorbeaceae). A mais conhecida é Manihot esculenta - mandioca brava. Os tubérculos da M.
esculenta são comestíveis e a intoxicação ocorre quando administrados aos ruminantes
imediatamente após a colheita ou durante a fabricação da farinha e outros produtos. O
tratamento dos tubérculos mediante a moagem ou a ralação faz com que percam a toxicidade.

A intoxicação por essa espécie ocorre quando animais famintos invadem culturas, quando as
primeiras chuvas são seguidas de uma estiagem de vários dias e os animais ingerem as plantas
em brotação ou secas, também quando são alimentados com as folhas frescas e/ou tubérculos
sem os devidos cuidados quanto à eliminação do princípio ativo (CANELLA et al., 1968 apud
AMORIM, 2006). Experimentos realizados por AMORIM et al. só conseguiram reproduzir a
intoxicação em bovinos com M. glaziovii a partir de 5g/kg/PV. Já a intoxicação cianídrica em
caprinos com M. glaziovii foi obtida a partir de 6,7 g/kg/pv. A Holocalix glaziovii, uma árvore da
família Leguminoseae-Mimosoideae é, também, cianogênica, mas a intoxicação espontânea por
esta planta nunca foi descrita (ARMIEN et al. 1995 apud AMORIM, 2006).

Glicosídeos cianogênicos: características

O ácido cianídrico responsável pela toxicidade de tais plantas é resultante do

desdobramento dos glicosídeos cianogênicos. Os glicosídeos são produtos secundários do
metabolismo das plantas e fazem parte do sistema de defesa contra insetos, moluscos e
herbívoros. A concentração dos glicosídeos cianogênicos é variável nas diferentes espécies de
plantas, e dentro de uma mesma espécie varia dependendo do clima e outras condições que
influenciam o crescimento da planta como adubação nitrogenada, deficiência de água e idade da
planta, pois quanto mais nova e de crescimento rápido, maior será o seu teor em glicosídeos

1
cianogênicos. Isto se deve a intensa atividade celular, principalmente observada nas folhas e
sementes em germinação (EGEKEZE & OEHME 1980 apud AMORIM, 2006).

Os glicosídeos cianogênicos são hidrosolúveis e potencialmente liberam CNˉ. Quando o

material vegetal é dilacerado, por exemplo, mediante a mastigação, o glicosídeo é hidrolisado por
ß-glicosidases, que se encontram separadas dos glicosídeos no tecido vegetal intacto. Essa
situação não faz diferença para os ruminantes, uma vez que as bactérias ruminais podem
hidrolisar os glicosídeos cianogênicos com rapidez, liberando o CNˉ. Por outro lado, o pH ácido do
estômago nos monogástricos faz com que as ß-glicosidases não atuem e a liberação do cianeto
seja lenta, o que dá tempo para a sua eliminação, sem alcançar a dose letal (TOKARNIA et al.,
2000, RADOSTITS et al., 2000, CEREDA 2003 apud AMORIM, 2006). Sabe-se que cerca de 80% do
cianeto absorvido é biotransformado pela rodanase (tiossulfato sulfurtransferase) a um
metabólito atóxico - o tiocianato (SPINOSA, 2008); entretanto, os casos de intoxicação ocorrem
quando a quantidade ingerida e absorvida ultrapassa esta capacidade de metabolização do CNˉ. A
rodanase converte o íon cianeto em tiocianato na presença de cisteína, um aminoácido doador de
enxofre, sendo este metabólito eliminado pela urina.

Glicosídeos cianogênicos: intoxicação

A intoxicação aguda por cianeto leva o animal a um quadro de hipóxia e anóxia citotóxica.
Seu mecanismo primário de ação relaciona-se com a inibição da enzima citocromo-oxidase e seu
local de ação é o ferro da metalo-porfirina. O CNˉ reage com o ferro trivalente da citocromo
oxidase e forma um complexo relativamente estável, o citocromo-oxidase-CN, interrompendo o
transporte de elétrons ao longo da cadeia respiratória, inibindo, desse modo, a cadeia de
fosforilação oxidativa (sistema de transporte de elétrons da cadeia respiratória) (SPINOSA, 2008).
Como a oxihemoglobina não pode liberar o oxigênio para o transporte de elétrons, o sangue
apresenta uma coloração vermelho-brilhante (RADOSTITS et al., 2000). A absorção do cianeto é
rápida, sendo amplamente distribuído no organismo; os sinais de intoxicação cianídrica aparecem
logo após ou mesmo durante a ingestão da planta e caracterizam-se por sialorréia, paresia,
espasmos musculares generalizados, e convulsões do tipo tônico-clônicas. As membranas
apresentam-se, inicialmente, vermelho-vivas, depois cianóticas. Em relação ao quadro
respiratório, o animal apresenta polipnéia e dispnéia, podendo posteriormente sofrer parada
respiratória (SPINOSA, 2008). Além disso, o animal apresenta taquicardia, andar cambaleante a
ponto de o animal cair, nistagmo e opistótono. Nos casos mais graves, ocorre queda seguida de
decúbito lateral, dispnéia cada vez mais acentuada e coma.

Glicosídeos cianogênicos: tratamento da intoxicação

Se feito a tempo, o tratamento é muito eficiente. Ele é composto por associação de

tiossulfato de sódio (200 mg/mL) com nitrito de sódio (150 mg/mL). Para cada 45 kg de peso vivo,
deve-se administrar 3 mL de tiossulfato de sódio e 1 mL de nitrito de sódio, por via intravenosa. O
tiossulfato se combina com o CNˉ livre para formar o tiocianato, enquanto que o nitrito de sódio
induz a formação de metahemoglobina, que tem alta afinidade pelo cianeto, deslocando-o da
citocromo oxidase. A administração de tiossulfato pode ser repetida posteriormente; entretanto, o
nitrito não deve ser associado, uma vez que há a possibilidade de esta substância produzir doses
2
excessivas de metahemoglobina, o que acarreta um quadro de cianose – insuficiência de
oxihemoglobina para o aporte de oxigênio (SPINOSA, 2008).

Glicosídeos cianogênicos: prevenção da intoxicação

Pode-se fazer a prevenção de intoxicação por plantas cianogênicas destinadas à

alimentação animal por meio do teste do picrato. Neste teste, o preparo do papel-reagente é feito
molhando-se tiras de papel filtro em uma solução composta de 5g de carbonato de sódio e 0,5g
de ácido pícrico para 100 mL de solução. Após secas, as tiras de papel assim preparadas
apresentam-se amarelas. O teste é feito a partir de uma amostra do vegetal a ser examinado
acondicionada num pequeno frasco (30 a 50 mL); fixa-se uma tira de papel-reagente na tampa
(não permitir contato com a amostra) e veda-se o frasco, que deve ser aquecido a 30-35°C por 5
minutos (Figura 1). Se a tira ficar vermelho-tijolo, indicará grande quantidade de cianeto na
amostra. Nesse caso, é necessário realizar procedimentos, tais como moer ou secar a planta, para
promover a liberação do cianeto, diminuindo assim a quantidade de glicosídeo cianogênico
disponível ao animal (SPINOSA, 2008).

Figura 1 – Esquema do teste do picrato

2. OBJETIVOS

2.1) Acompanhamento da progressão de uma intoxicação aguda experimental de bovinos

por planta cianogênica, com monitoramento da sintomatologia apresentada e verificação da
eficácia do tratamento.

2.2) Avaliação, por meio do teste do picrato, dos níveis de cianeto presentes em amostras
de mandioca mansa (Manihot utilissima), mandioca brava (Manihot esculenta)e alecrim-de-
campinas (Holocalyx glaziovii).

2.3) Simular coleta de amostragem para avaliação da presença de micotoxinas, fazendo-se

uso de mistura de grãos de arroz (100 pintados de preto).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais e Condições de Alojamento

3
 Três bezerros, pesando 125 Kg, 75 Kg e 130 Kg, foram utilizados por três dias consecutivos,
um em cada dia. Os animais foram mantidos em jejum antes da realização do experimento.

3.2. Soluções, Reagentes e Substâncias Utilizadas

3.2.1. Intoxicação dos bezerros:

 Extrato de Holocalyx glaziovii

 Nitrito de sódio (250 mg/mL)
 Tiossulfato de sódio (200 mg/mL)
 Solução de 10 mL de Blotrol® e água

3.2.2. Teste do Picrato:

 50 mL de água

 5 g de carbonato de sódio
 0,5 g de ácido pícrico.

3.3. Delineamento Experimental

3.3.1. Intoxicação do Bezerros:

Foi feita a mensuração das funções vitais dos bezerros (frequências cardíaca, respiratória e
de movimentos ruminais) antes do início da intoxicação experimental. Após a administração do
extrato de Holocalyx glaziovii através de sonda esofágica (deposição direta no rúmen), novas
avaliações desses mesmos parâmetros foram feitas a cada cinco minutos para o
acompanhamento do quadro. Os animais receberam uma solução de 2,2 g/kg de extrato de
Holocalyx glaziovii, planta cianogênica da família Leguminoseae-Mimosoideae. Quando os alunos
julgaram necessária a administração do tratamento, esta foi feita por via intravenosa (veia jugular
externa) e uma nova mensuração das funções vitais dos animais foi feita para constatação do
restabelecimento da normalidade. O tratamento foi feito com nitrito de sódio na concentração de
250 mg/mL e tiossulfato de sódio na concentração de 200 mg/mL para cada 45 Kg de peso vivo.
Repetiu-se, cerca de dez minutos depois, nova dose de tiossulfato de sódio. Solução de 10 mL de
Blotrol® em água foi administrada (V.O.) ao final do experimento, para eliminação dos gases.

3.3.2. Teste do Picrato

Avaliamos 3 amostras de plantas cianogênicas: Manihot esculenta (mandioca brava),

Manihot utilissima (mandioca mansa) e Holocalyx glaziovii (alecrim-de-campinas). Para isso,
colocamos amostras de cada uma delas em 3 frascos distintos, fixando à tampa uma tira de
papel-reagente preparado anteriormente (embebidos em solução de 50 mL de água, 5 g de
carbonato de sódio, 0,5 g de ácido pícrico). Tais amostras foram aquecidas a 33/35°C por 5
minutos; observando-se a nova coloração da tira.

3.3.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

4
 Para observarmos a importância da coleta correta de amostras para avaliação de
micotoxinas, utilizamos 2 kg de arroz (104712 grãos, estimados pela pesagem de 100 grãos –
1,91 g). Estes 100 grãos foram pintados de preto e misturados aos outros. Visto isso, tem-se que
a proporção entre grãos pretos e brancos é de 1:1047. O recipiente de coleta tem capacidade de
armazenar 32,8 g arroz (cerca de 1717 grãos), sendo esperados 1,63 grãos pretos em cada
amostra.

Foram coletadas 10 amostras de arroz, sendo que a cada coleta foram contados os grãos
pretos presentes; depois disso, devolveu-se o conteúdo do recipiente aos 2 kg, homogeneizando-
se bem antes de cada coleta e tomando-se o cuidado de fossem aleatórias (escolher pontos
diferentes, sem olhar para dentro do pote, que era escuro justamente para evitar que o resultado
fosse tendencioso).

4. RESULTADOS

4.1. Intoxicação dos bezerros

Dia 1 (Grupo 3) – Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas

Freqüência Freqüência Movimentos Mucos
Período
Cardíaca (bpm) Respiratória (mpm) Ruminais (m/3’) a
Antes da
92 50 1 ++
intoxicação
Intoxicação por Holocalyx glaziovii (logo após mensurações)
5 min após
180 34 0 +++
intoxicação
Tratamento – 6 min após a intoxicação
10 min após
81 24 1 ++
intoxicação

OBS.: Após 5 minutos da administração do extrato de H. glaziovii, o bezerro apresentou

fasciculações e recebeu o tratamento no minuto seguinte, via IV, sendo posicionado em decúbito
lateral. Passados 2 minutos da administração do nitrito de sódio + tiossulfato de sódio, o animal
colocou-se em decúbito esternal, sendo que seguidos 3 minutos após o tratamento o animal já
estava em estação.
Peso do bezerro: 125 kg.

Dia 2 (Grupo 1) Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas

Freqüência Freqüência Movimentos Mucosa
Período
Cardíaca (bpm) Respiratória (mpm) Ruminais (m/3’) s
Antes da
90 48 3 ++
intoxicação
Intoxicação por H. glaziovii (logo após mensurações)
5 min após
148 24 0 +
intoxicação
10 min após
130 26 0 +
intoxicação
Tratamento – 12 min após a intoxicação
17 min após
84 28 2 ++
intoxicação

OBS.: 10 minutos após a intoxicação por extrato de H. glaziovii, o animal caiu em decúbito lateral;
em 11 minutos a contar da administração do extrato, o bezerro apresentou convulsão tônico-

5
clônica. O tratamento foi feito 12 minutos após a intoxicação, sendo que passado 1 minuto o
animal estava em decúbito esternal, ficando em estação 4,5 minutos após o tratamento.

Peso do bezerro: 75 Kg

Dia 3 (Grupo 2) Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas

Freqüência
Freqüência Movimentos Mucosa
Período Respiratória
Cardíaca (bpm) Ruminais (m/3’) s
(mpm)
Antes Intoxicação 80 35 1 +
Intoxicação por H. glaziovii (logo após mensurações)
5 min após
196 45 0 ++
intoxicação
1º Tratamento – 7 min após a intoxicação
10 min após
160 70 0 +++
intoxicação
2º Tratamento – em 8,5 min
5 min após 2ª
aplicação do 108 35 1 +
tratamento

OBS.: O bezerro apresentou tremores depois de aproximados 4 minutos após a intoxicação. Foi
mensurada a temperatura antes da intoxicação (38,3 ºC) e após o 2º tratamento (38,2 ºC).
Peso do bezerro: 130 kg.

Os gráficos a seguir ilustram os parâmetros vitais mensurados ao longo dos experimentos.

Frequência Cardíaca (bpm )

220

200 196
180 180
160
160 148
140
130
FC (bpm)

120
108
100
92
90 81 84
80
80
60

40

20

0
antes da intoxicação 5' após intoxicação 10' após intoxicação ≈ 15' após intoxicação
B ezerro 1t (min)
Bezerro 2 B ezerro 3

6
 Frequência Respiratória (m pm )

80

70

60

50
48
FR (mpm)

45
40

34 35
35
26 28
24 24
20

0
antes da intoxicação 5' após intoxicação 10' após intoxicação ≈ 15' após intoxicação

Bezerro 1 t (min)
Bezerro 2 Bezerro 3

Movim entos Rum inais (m/3min)

3
3
MR (m/3min)

2 2

1 1 1 1
1

0 0
0 0 0 0
antes da intoxicação 5' após intoxicação 10' após intoxicação ≈ 15' após intoxicação
Bezerro 1t (min)
Bezerro 2 Bezerro 3

4.2. Teste do Picrato

Após decorridos os 5 minutos necessários para a volatilização do cianeto e reação com a

fita-reagente, as colorações de cada fita foi observada (Figura 2): a fita correspondente à
mandioca mansa apresentou-se amarela, com discreta tonalidade laranja, a fita da mandioca
brava apresentou-se alaranjada, tendendo ao marrom e a correspondente ao alecrim-de-
campinas mostrou-se escurecida (vermelho/marrom tijolo).

Figura 2 – Resultados das reações do teste do picrato (as fitas apresentam colorações
menos intensas do que as citadas, visto que a reação cessa à medida que o tempo passa).

4.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

7
 A contagem dos grãos pretos em cada amostra encontra-se na seguinte tabela:

Amostragem de Arroz (32,8 g/amostra)

1 Médi
Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 a
Grãos
4 0 0 2 2 1 1 3 2 1 1,6
Pretos

Obtivemos, portanto, a média de 1,6 grãos pretos por amostra coletada.

5. DISCUSSÃO

5.1. Intoxicação dos bezerros

O primeiro animal apresentou o quadro de intoxicação apenas três minutos após a

administração do extrato de Holocalyx glaziovii, sendo que um minuto depois o animal cambaleou
e foi colocado em decúbito lateral e, apenas cinco minutos após a exposição, houve a
necessidade de realização do tratamento para que o animal não apresentasse convulsões. Essa
resposta tão rápida se deve a dois fatores evidentes: 1) o jejum ao qual o bezerro foi submetido, o
que aumentou a velocidade de absorção do princípio ativo tóxico; 2) a quantidade de extrato
administrada ao animal. Isso confirma que a resposta é dose dependente.

Taquicardia, bradipnéia, atonia ruminal, espasmos musculares, andar cambaleante e

membranas avermelhadas apresentados pelo bezerro são devidos à maior ocorrência da enzima
citocromo-oxidase estar nos tecidos que apresentam elevado metabolismo oxidativo, como o
sistema nervoso central e a musculatura cardíaca. O cianeto liberado quando a integridade da
planta é quebrada se liga a essa enzima, fazendo com que o sistema de transporte da cadeia de
elétrons seja paralisado, causando hipóxia e anóxia citotóxica e ocasionando a sintomatologia
apresentada.

O animal 2 apresentou, num tempo parecido, os mesmos sinais de intoxicação vistos no

animal 1 acrescidos de convulsões do tipo tônico-clônicas. Pode-se supor duas razões para a
ocorrência dessas convulsões: o reduzido peso do animal e a demora na realização do tratamento
(cerca de doze minutos após a administração da planta).

Já o animal 3 apresentou aumento da frequência respiratória ao invés da queda observada

nos demais, o que pode ser proveniente de uma variação individual ou de um erro no momento
da captação do dado. Os demais sintomas também foram observados: taquicardia, atonia do
rúmen, espasmos musculares e membranas avermelhadas. O tratamento foi feito antes que o
animal apresentasse convulsão (cerca de sete minutos após a administração do agente tóxico).

Em todos os casos, ao receber o tratamento, o animal apresentou melhora no tempo de um

a dois minutos, colocando-se de pé e com funções vitais próximas do normal cerca de cinco
minutos após. Tendo em vista o mecanismo de ação pelo qual ocorre a intoxicação por Holocalyx
glaziovii, o tratamento feito com nitrato de sódio e tiossulfato foi eficiente pelo fato de o nitrato
de sódio formar metahemoglobina, que retira o cianeto da citocromo-oxidase, formando
cianometemeglobina, e o tiossulfato de sódio se combinar ao cianeto livre, formando tiocianato,
8
que é atóxico. No entanto, deve-se tomar cuidado com a dose de nitrato de sódio administrada,
pois a metemoglobina possui baixa afinidade por O2 e em altas concentrações pode levar o
animal à morte num quadro de cianose.

5.2. Teste do Picrato

O teste do picrato permite a avaliação qualitativa da quantidade de cianeto presente em

uma amostra de planta cianogênica. Como era esperado, o alecrim-de-campinas (Holocalyx
glaziovii) causou a maior alteração de cor na fita, sendo a planta que possui maior teor de
glicosídeos cianogênicos dentre as amostras analisadas, seguido pela mandioca brava (M.
esculenta) e pela mandioca mansa (M. utilissima), esta última possui quantidades muito baixas de
cianeto. Visto isso, temos que este teste é de essencial importância para a avaliação da
necessidade de se tratar o vegetal antes de introduzi-lo na alimentação dos ruminantes, evitando
as intoxicações por erro no manejo de tais plantas.

5.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

Comparando-se a média obtida pelo experimento (1,6 grãos pretos por amostra) àquela
calculada inicialmente (1,63 grãos pretos por amostra), pode-se inferir que este experimento foi
válido para constatar que a execução correta do método de coleta de amostras (numerosas e
aleatórias) garante um resultado fidedigno para o laudo a ser dado numa avaliação de
micotoxinas. Uma única amostra ou poucas podem superestimar (amostras 1, 4, 5, 8 e 9) ou
subestimar (amostras 2, 3, 6, 7 e 10) o valor verdadeiro de micotoxinas presente num
carregamento de cereais, por exemplo.

6. CONCLUSÃO

Embora a intoxicação por plantas cianogênicas seja uma das poucas intoxicações que tem
tratamento específico, com recuperação imediata, na maioria das vezes os animais acometidos
são encontrados mortos, dado a rapidez com que ocorre a morte. Assim, a prevenção é a medida
mais eficaz de se evitar perdas econômicas, já que muitas plantas cianogênicas são utilizadas na
alimentação animal.

Essa prevenção de intoxicação por plantas cianogênicas pode ser feita realizando-se o teste
do picrato, para a identificação de plantas que possam colocar em risco a saúde dos animais, da
moagem ou secagem das plantas que apresentarem níveis altos de cianeto e da exposição prévia
dos animais a referido tipo de planta para induzir a produção da enzima rodanase, que transforma
o cianeto em tiocianato, aumentando a tolerância do animal à alimentação oferecida.

Quanto à técnica de coleta de amostras para avaliação de micotoxinas, pode-se concluir que
é eficiente para o fim ao qual se destina, pois, como visto, o método permite que uma
amostragem seja coletada e analisada de modo mais fiel à condição real.

6. BIBLIOGRAFIA

9
AMORIM, S. L.; MEDEIROS, R. M. T.; RIETCORREA F. Intoxicações por Plantas Cianogênicas no
Brasil. Ciência Animal, 16(1):17-26, 2006.

SPINOSA, H.S.; GÓRNIAK, S.L.; PALERMO-NETO, J. Toxicologia Aplicada à Medicina

Veterinária. Barueri: Manole, 2008.

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