Você está na página 1de 100

Faculdade de Medicina de Lisboa Módulo I.

Biologia Molecular
da Célula
In Cooper 2ª Edição

2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Índice
Índice ............................................................................................................................... 2

Capitulo Um (pág. 27 – 44) – Uma Visão Geral das Células e Pesquisa Celular ..... 8
Origem e Evolução ....................................................................................................... 8
Evolução de Metabolismos ........................................................................................... 9
Procariontes Actuais ..................................................................................................... 9
Células Eucarióticas ..................................................................................................... 9
Evolução dos Eucariontes .......................................................................................... 10
Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares...................................................... 10

Capítulo Um (pág. 52-57) ............................................................................................. 12


Crescimento de Células Animais em Cultura ............................................................. 12
Cultura de Células Vegetais ....................................................................................... 13
Vírus ........................................................................................................................... 13

Capítulo Dois – A Química das Células ..................................................................... 14


A composição Molecular das Células ........................................................................ 14
Glícidos ....................................................................................................................... 14
Lípidos ........................................................................................................................ 15
Ácidos Nucleicos ........................................................................................................ 16
Proteínas .................................................................................................................... 17
Enzimas ...................................................................................................................... 18
Mecanismo de Catálise Enzimática ........................................................................... 18
Coenzimas .................................................................................................................. 19
Regulação da Actividade Enzimática ......................................................................... 19
Energia Metabólica ..................................................................................................... 19
Membranas Celulares ................................................................................................ 19
Transporte Através das Membranas Celulares .......................................................... 20

Capítulo Três (pág. 113 – 138) – Fundamentos de Biologia Molecular .................. 22


Hereditariedade, Genes e DNA .................................................................................. 22
Genes e Cromossomas .............................................................................................. 22
Genes e Enzimas ....................................................................................................... 24
Replicação do DNA .................................................................................................... 24
Expressão da Informação Genética ........................................................................... 24
Função do RNA Mensageiro ...................................................................................... 24
O Código Genético ..................................................................................................... 25
Vírus de RNA e Transcrição Reversa ........................................................................ 25
DNA Recombinante .................................................................................................... 25
Endonucleases de Restrição ...................................................................................... 26

2
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Electroforese em Gel .................................................................................................. 26


Gerar Moléculas de DNA Recombinante ................................................................... 27
Vectores para DNA Recombinante ............................................................................ 28
Sequenciação do DNA ............................................................................................... 28
Expressão dos Genes Clonados ................................................................................ 29
Amplificação de DNA pela Reacção em Cadeia de Polimerase (PCR) ..................... 30
Transferência de Genes em Plantas e Animais ......................................................... 30
Mutagénese de DNA Clonados .................................................................................. 31

Capítulo Quatro – A Organização dos Genomas Celulares ..................................... 32


A complexidade dos Genomas Eucariótas ................................................................ 32
Intrões e Exões ........................................................................................................... 32
Famílias Génicas e Pseudogenes .............................................................................. 32
Sequências de DNA Repetitivas ................................................................................ 33
Cromossomas e Cromatina ........................................................................................ 33
Cromatina ................................................................................................................... 33
Centrómeros ............................................................................................................... 34
Telómeros ................................................................................................................... 34
O Genoma Humano ................................................................................................... 34

Capítulo Cinco – Replicação, Manutenção e Rearranjos do DNA Genómico ........ 36


DNA Polimerases ....................................................................................................... 36
A Forquilha de Replicação ......................................................................................... 37
Fidelidade da Replicação ........................................................................................... 38
As Origens e a Iniciação da Replicação ..................................................................... 39
Os Telómeros e a Telomerase ................................................................................... 39
Reparação do DNA .................................................................................................... 40
Reversão Directa de Lesões do DNA ........................................................................ 40
Reparação por Excisão .............................................................................................. 41
Reparação Pós-Replicação ........................................................................................ 41
Recombinação entre Sequências Homólogas de DNA ............................................. 42
Moléculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras e Rejunções .................. 42
Modelos de Recombinação Homóloga ...................................................................... 42
Enzimas Envolvidas na Recombinação Homóloga .................................................... 43
Rearranjos do DNA .................................................................................................... 44
Recombinação Sítio-Especifica .................................................................................. 44
Transposição Através de Intermediários de DNA ...................................................... 44
Transposição Através de Intermediários de RNA ...................................................... 45
Amplificação Génica ................................................................................................... 45

Capítulo Seis – Síntese e Processamento de RNA ................................................... 46


Transcrição em Procariótas ........................................................................................ 46

3
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A RNA Polimerase e a Transcrição ............................................................................ 46


Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrição ............................................. 46
Controlo Positivo da Transcrição................................................................................ 47
Atenuação da Transcrição.......................................................................................... 47
As RNA Polimerases Eucariótas e os Factores Gerais de Transcrição .................... 47
As RNA Polimerases Eucariótas ................................................................................ 47
Os Factores Gerais da Transcrição e a Iniciação da Transcrição pela RNA
Polimerase II............................................................................................................................ 48
A Transcrição pelas RNA Polimerase I e III ............................................................... 49
Regulação da Transcrição em Eucariótas ................................................................. 49
Sequências Regulatórias com Actuação em Cis: Promotores e Enhancers ............. 49
Proteínas Regulatórias Transcricionais ...................................................................... 50
Estrutura e Função dos Activadores Transcricionais ................................................. 50
Repressores Eucariótas ............................................................................................. 51
Relação entre Estrutura da Cromatina e a Transcrição ............................................. 51
Metilação do DNA ....................................................................................................... 51
Processamento e Reciclagem de RNA ...................................................................... 52
Processamento do rRNA e do tRNA .......................................................................... 52
Processamento do mRNA em Eucariótas .................................................................. 52
Mecanismo de splicing ............................................................................................... 53
Splicing Alternativo ..................................................................................................... 54
Edição do RNA ........................................................................................................... 55
Degradação de RNA .................................................................................................. 56

Capítulo Sete (pág. 297 – 325) – Síntese, Procesamento e Regulação Proteicos . 57


Tradução do mRNA .................................................................................................... 57
RNAs de Transporte ................................................................................................... 57
O Ribossoma .............................................................................................................. 57
A Organização de mRNAs e Inicio da Tradução........................................................ 58
O Processo de Tradução ............................................................................................ 58
A Regulação da Tradução .......................................................................................... 59
Dobramento e Processamento Proteicos ................................................................... 59
Chaperonas e Dobramento Proteico .......................................................................... 59
Enzimas e Dobramento Proteico ................................................................................ 59
Clivagem Proteica ...................................................................................................... 60
Glicolização ................................................................................................................ 60
Ligação de Lípidos ..................................................................................................... 60

Capítulo Nove – Selecção e Transporte de Proteínas .............................................. 62


Retículo Endoplasmático ............................................................................................ 62
O Retículo Endoplasmático e a Secreção de Proteínas ............................................ 62
Direccionando Proteínas para o Retículo Endoplasmático ........................................ 62

4
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Inserção de Proteínas na Membrana do Retículo Endoplasmático ........................... 63


Dobramento de Proteínas e Processamento no Retículo Endoplasmático ............... 63
O Reticulo Endoplasmático ........................................................................................ 64
Exportação de Proteínas e Lípidos do Retículo Endoplasmático .............................. 64
O Complexo de Golgi ................................................................................................. 64
Organização do Complexo de Golgi .......................................................................... 64
Distribuição de Proteínas e Exportação do Complexo de Golgi ................................ 65
Proteínas de Revestimento e de formação de Vesículas .......................................... 65
Fusão Vesicular .......................................................................................................... 65
Lisossomas ................................................................................................................. 66
Hidrolases Lisossomais Ácidas .................................................................................. 66

Capítulo Dez (pág. 411-415) – Bioenergética e Metabolismo: Mitocondrias .......... 67


Mitocôndrias ............................................................................................................... 67
Organização e Função das Mitocôndrias ................................................................... 67
O Sistema Genético das Mitocôndrias ....................................................................... 67

Capítulo Dez (pág. 437-441) – Bioenergética e Metabolismo: Peroxissomas ........ 68


Peroxissomas ............................................................................................................. 68
Funções do Peroxissomas ......................................................................................... 68

Capítulo Onze – O Citoesqueleto e o Movimento Celular ........................................ 69


O Citoesqueleto .......................................................................................................... 69
Microtúbulos ............................................................................................................... 69
Constituição dos Microtúbulos.................................................................................... 69
Transporte Celular e Proteínas Motoras .................................................................... 70
Proteínas Associadas aos Microtúbulos .................................................................... 70
Drogas que Intreferem com os Microtúbulos ............................................................. 71
Filamentos Intermédios .............................................................................................. 71
Diferentes Tipos de Filamentos Intermédios .............................................................. 72
Formação dos Filamentos Intermédios ...................................................................... 72
Filamentos de Actina .................................................................................................. 73
Polimerização/Despolimerização ............................................................................... 73
Proteínas que Regulam a Polimerização e Despolimerização da Actina .................. 73
Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina........................................................... 74
Organização do Citoesqueleto de Actina ................................................................... 74
Miosina ....................................................................................................................... 75
Contracção Muscular .................................................................................................. 75

Capítulo Treze – Sinalização Celular .......................................................................... 76


Sinalização de Moléculas e seus Receptores ............................................................ 76
Modelos de Sinalização Célula-Célula ....................................................................... 76

5
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Hormonas Esteróides e Superfamília de Receptores Esteróides .............................. 76


Hormonas Peptídeas e Factores de Crescimento ..................................................... 76
Funções dos Receptores de Superfície Celular ......................................................... 77
Receptores Acoplados à Proteína G .......................................................................... 77
Receptores de Proteína-Tirosina Cinase ................................................................... 77
Vias de Transdução de Sinal Intracelular................................................................... 78
A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilação de Proteínas .......................... 78
GMP Cíclico ................................................................................................................ 79
A Via das Ras, Raf e MAP Cinase ............................................................................. 79
Regulação da Morte Celular Programada .................................................................. 79
Caspases e Apoptose ................................................................................................ 80
Receptores de Morte Celular e Activação de Caspases ............................................ 81
Sinalização de Sobrevivência Celular ........................................................................ 81

Capítulo Catorze (pág. 596-617) – O Ciclo Celular .................................................... 83


O Ciclo Celular dos Eucariótas................................................................................... 83
Fases do Ciclo Celular ............................................................................................... 83
Regulação do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e Sinais Extracelulares ........ 84
Pontos de Verificação do Ciclo Celular ...................................................................... 84
Ligação da Fase S para a Fase M ............................................................................. 85
Reguladores do Curso do Ciclo Celular ..................................................................... 85
MPF: Um Dímero de Cdc2 e Ciclina .......................................................................... 85
Família das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas ......................................... 85
Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D .......................................................... 86
Inibidores do Curso do Ciclo Celular .......................................................................... 87

Correlações Clínicas ............................................................................................. 88


Índice ............................................................................................................................. 89

Vírus e Cancro .............................................................................................................. 90


A Doença .................................................................................................................... 90
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 90
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 90

Fenilcetonúria ............................................................................................................... 91
A Doença .................................................................................................................... 91
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 91
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 91

HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92


A Doença .................................................................................................................... 92
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 92
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 92

6
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Terapia Génica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93


A Doença .................................................................................................................... 93
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 93
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 93

Cancro do Cólon e Reparação do DNA ...................................................................... 94


A Doença .................................................................................................................... 94
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 94
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 94

Factor de Transcrição Pit-1 e a Deficiência da Hormona do Crescimento ............ 95


A Doença .................................................................................................................... 95
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 95
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 95

Antibióticos e Síntese Proteica ................................................................................... 96


A Doença .................................................................................................................... 96
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 96
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 96

Doença de Gaucher ...................................................................................................... 97


A Doença .................................................................................................................... 97
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 97
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 97

Doenças das Mitocôndrias: Neurapatias Ópticas Hereditátia de Leber ................. 98


A Doença .................................................................................................................... 98
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 98
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 98

Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99


A Doença .................................................................................................................... 99
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 99
Prevenção e Tratamento ............................................................................................ 99

Fibrose Cística ............................................................................................................ 100


A Doença .................................................................................................................. 100
Bases Celulares e Moleculares ................................................................................ 100
Prevenção e Tratamento .......................................................................................... 100

7
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina
edicina de Lisboa

Capitulo Um (pág. 27 – 44)

Origem e Evolução

Eucarióticas (com núcleo que “armazena” o DNA)


Células
Procarióticas (menores, sem núcleo, organitos
citoplasmáticos
icos e citoesqueleto)

Os mecanismos moleculares básicos que controlam a vida de ambas as


células são os mesmo, o que nos sugere a existência de um ancestral comum.
Em seguida a sequência de acontecimentos que levaram à 1ª célula:

•Atmosfera
Atmosfera Primitiva

• Macromoléculas

• Polimeros

•Capacidade
Capacidade de Auto-Replicarem-se
Auto
• Proteinas ou Acidos Nuncleicos ?
•Apenas
Apenas os acidos Nucleicos são capazes de controlar a sua autoreplicação

•RNA
RNA (Sistema Genético Inicial)

•1ª Célula

8
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A formação da primeira célula apenas foi possível devido à formação de


membranas de fosfolípidos, que permitiram isolar do restante meio ambiente as
moléculas com a capacidade de se auto-replicar e assim ter um metabolismo
independete, devido ás suas propriedade físicas e químicas. Os fosfolípidos
são compostos por uma cabeça hidrófila e uma cauda hidrofóbica:

Evolução de Metabolismos
A capacidade de obter alimentos e energia directamente do meio
ambiente é um dos factores limitadores para as células primordiais, foi assim
necessário criar mecanismos de desenvolvimento próprio. Houve assim uma
evolução da glicólise que permitiu a existência de energia química (ATP),
surgiram os primeiros organismos fotossintéticos o que levou a um grande
aumento da quantidade de oxigénio na atmosfera e desencadeou a evolução
dos mecanismos oxidativos (Respiração Aeróbia).

Procariontes Actuais
Os procariontes actuais podem dividir-se em:
- Arqueobactérias (Bactérias em Ambientes Extremos)
- Eubactérias (Bactérias Actuais)
Os procariontes são constituídos pela membrana celular, alguns por uma
parede celular rígida, pelo nucloide (agregado de DNA) e pelos ribossomas.

Células Eucarióticas

São mais complexas, possuem núcleo limitado por uma membrana


porosa, vários organitos citoplasmáticos e citoesqueleto.

Complexo de Golgi:
organização e transporte
de proteínas, sintese de Mitocôndrias: respiração
lípidos e alguns aeróbia
polissacarideos (em
plantas)
Retículo
Endoplasmático:
organização e
Cloroplasto: fotossíntese
transporte de
proteinas, sintese de
lípidos

Citoesqueleto: rede de
Lisossomas e
Célula filamentos proteicos que
Peroxissomas: digestão
Eucariótica se estende pelo
e reacções oxidativas
citoplasma

9
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina
edicina de Lisboa

O citoesqueleto,, apesar de não ser um organito propriamente dito


desempenha uma importante função, fornece estrutura à célula, determina o
seu formato, gera organização celular, responsável pelos movimentos,
responsável pelo transporte
nsporte intracelular e pelo posicionamento dos organitos e
outras estruturas.

Evolução dos Eucariontes


A Hipótese Endossimbiótica é a que melhor explica plica o aparecimento
das células eucariótas,s, e que se baseia na relação endossimbiótica entre
bactérias aeróbias
óbias que vieram a originar as mitocôndrias e cianobactérias que
originaram cloroplastos quando “ingeridas” por outras células. Esta hipótese é
apoiada pelos seguintes factos:
- Mitocôndrias e Cloroplastos são similares a bactérias;
- Estes reproduzem-se
reproduzem por divisão binárias;
- Contêm o seu próprio DNA;
- Têm ribossomas próprios;
- O seu código genético é “diferente” do usado pelo genoma celular
nuclear;
- Os seus Ribossomas e rRNA são mais próximo do das bactérias do
que dos eucarióticas.

Estas relações endossimbióticas


endossimbióticas foram vantajosas e positivamente
seleccionadas e por isso perduraram,
perduraram permitindo assim que houvesse
evolução, originando-se
se células eucarióticas.

Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares

Com uma cada da vez maior necessidade de nutrientes e consequente


aumento da área de contacto com o exterior, tornou-se
tornou se evidente que o simples
aumento da célula não era eficaz, iniciou-se
iniciou se assim uma série de associações
entre células de organismos idênticos, de forma a permitir uma maior área sem
10
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

que para isso aumentassem o seu volume. Desta associação surgiram as


colónias que apesar de serem células independentes eram favorecidas pelo
facto de estarem agrupadas. Progressivamente começou a existir uma
diferenciação e especialização de determinados grupos de células e que mais
tarde viriam a originar os seres pluricelulares. Nestes existem grupos de células
com diferente funções, mas todos eles interdependentes e fazendo parte do
mesmo organismos.

11
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Um (pág. 52-57)


O microscópio electrónico não permite estudar as várias funções dos
inúmeros componentes da célula eucariótica e por isso é necessário isolar os
organelos (por tamanho e densidade) através da centrifugação diferencial.
Inicialmente é feita a ruptura da membrana plasmática que pode ser feita
por exposição a ultra-sons, trituração com homogeneizadores mecânicos ou
através de liquidificadores; de seguida a “suspensão de células rompidas”,
lisado ou homogenato, é sujeita a uma série de centrifugações de velocidade
crescente, em cada uma é possível separarmos determinado componente.

Existem outros métodos para obter de forma isolada os organelos:


- Centrifugação em gradiente de concentração: separados por
sedimentação através de uma substância densa (ex. sacarose);
- Centrifugação por velocidade: o material é colocado no topo do
gradiente de sacarose, partículas de tamanhos diferentes sedimentam através
do gradiente em taxas diferentes, permitindo separar organitos com tamanhos
semelhantes;
- Centrifugação de Equilíbrio: pode ser usada para separar organitos
com base nas suas densidades de flutuação, independentemente do seu
tamanho ou forma.

Crescimento de Células Animais em Cultura

Este processo é mais complexo do que em bactérias e leveduras, no


entanto é através dele que podemos estudar o crescimento e a diferenciação
celular. Permite-nos ainda manipulações genéticas necessárias para a
compreensão da estrutura e função dos genes.
O processo consiste em retirar uma célula de um tecido, coloca-la num
meio de cultura nutritivo numa placa de cultivo, algumas das células aderem e
crescem formando “colónias”, a placa de cultivo é assim preenchida dando
origem a uma cultura primária, desta é retirado um conjunto de células que são
colocadas noutra placa de cultivo, dando origem a uma cultura secundária, este
processo repete-se até cerca de 50 a 100 vezes, após isto as células perdem a
capacidade de se duplicarem.

É frequente o uso de tumores ou células de embriões como material de


partida, já que contêm células de crescimento rápido, e no caso dos tumores
não possuem limitações quanto ao número de duplicações que é possível
realizar. Um dos inconvenientes deste processo é que ele é muito mais
demorado, cerca de 10x, do que quando realizado em bactérias e leveduras.

Meio de Cultura Nutritivo – no caso da cultura de células animais é


bastante mais complexo do que para as bactérias e leveduras, pois é
necessário incluir factores de crescimento e de regulação, aminoácidos
essenciais não sintetizados pelo organismo, e os habituais nutrientes.

12
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Cultura de Células Vegetais

As células vegetais podem ser cultivadas desde que no seu Meio de


Cultura Nutritivo sejam adicionados os factores de crescimento adequados.
O processo é iniciado com a recolha de uma célula que por divisões
mitóticas irá originar um conjunto de célula, o calo; contrariamente ao que
ocorre nos animais, as células restauram a totipotência, sendo assim possível
originar de uma só célula toda uma planta nova.

Vírus
Os vírus não considerados seres-vivos, são parasitas intracelulares que
necessitam de uma célula hospedeira para originarem descendência, fazendo
uso dos mecanismos dessa mesma célula.

Existem retrovírus cujo material genético não é, como seria de esperar,


o DNA, mas sim o RNA. Este vírus fazem uso da transcriptase reversa para
originarem cDNA que possa ser incorporado no genoma da célula hospedeira,
visto que esta enzima é menos eficiente, os vírus têm elevadas taxas de
mutação.

Os bacteriófagos são altamente eficientes chegando em apenas 20 a 30


minutos, infectada apenas uma célula, a originarem cerca de 200 novas
partículas virais.

13
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Dois
A composição Molecular das Células
As células são genericamente compostas por água, iões inorgânicos e
moléculas orgânicas, sendo a molécula de água a mais abundante (cerca de
70% da massa da célula).

A interacção entre a água e as restantes moléculas é de elevada


importância: destaca-se o facto de ser uma molécula polar, podendo formar
pontes de hidrogénio e interagir com iões carregados electricamente. Assim
sendo as moléculas polares (hidrófilas) são muito solúveis em água, enquanto
as moléculas apolares (hidrofóbicas) são fracamente solúveis em água.
Devido ao facto de serem fracamente solúveis, as moléculas apolares
tendem a associar-se entre si de modo a minimizar o contacto com a água –
efeito hidrofo.

Os iões inorgânicos (sódio, potássio, magnésio, cálcio, cloro e


bicarbonato) constituem 1% ou menos da massa da célula e estão envolvidos
em vários aspectos do metabolismo e funções da célula.

As moléculas orgânicas podem ser na sua maioria divididas da seguinte


forma:
- Proteínas (Aminoácidos);
- Glícidos (Oses);
- Lípidos (Ácidos Gordos);
- Ácidos Nucleicos (Nucleótidos).

São macromoléculas formadas por polimerização dos seus monómeros


e que constituem entre 80% a 90% da massa restante da célula, de seguida
iremos falar individualmente de cada um dos grupos anteriormente referidos.

Glícidos
Os seus monómeros são as oses, a mais conhecida é a glicose, e têm
como “função” o consumo no organismo, enquanto os polímeros, como é o
caso do glicogénio, têm uma “função” de armazenamento.

Os glícidos associados a outras macromoléculas, como é exemplo as


proteínas, podem funcionar como marcadores em vários processos de
reconhecimento celular.

Dentro dos glícidos destaca-se a glicose pois é a principal fonte


energética das nossas células, esta pode ocorrer na sua forma linear ou na sou
forma cíclica. Quando se encontra na sua forma cíclica pode encontrar-se em
conformações diferente – α ou β (respectivamente trans ou cis) – que
dependem da conformação do carbono um. Estas diferentes conformações vão

14
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

ter implicações ao nível da sua interacção com outras moléculas,


nomeadamente nos metabolismos celulares.

Os vários monossacarídeos são unidos por intermédio de uma reacção


de desidratação e ficam unidos por uma ligação glicosídica. Quando o
número de monossacarídeos unidos é reduzido denomina-se oligassacarídeos,
se forem cadeias muito longas denominam-se polissacarídeos. A ligação
ocorre geralmente entre C1---C4, mas pode ocorrer esporadicamente entre C1-
--C6; a ligação denomina-se α ou β dependendo da conformação do carbono
anumérico que intervém na ligação.

Lípidos

As principais funções dos lípidos são:


- Armazenamento de Energia;
- Sinalização Celular (Hormonas);
- Principais componentes das membranas.

Os lípidos mais simples são os ácidos gordos, mais frequentes as


cadeias com 16 ou 18 carbonos, estes podem ser insaturados (uma ou mais
ligações duplas entre carbonos) ou saturados (sem ligações duplas entre
carbonos).

A natureza hidrofóbica das cadeias de ácidos gordos é responsável pelo


comportamento dos lípidos mais complexos, nomeadamente na formação de

15
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

membranas, como é o caso das membranas plasmáticas formadas por uma


bicamada fosfolipídica.
Os lípidos são armazenados sob a forma de triacilglicerois e constituem
a forma mais eficiente de armazenar energia pois quando degradados, pela β
oxidação, originam mais do dobro de energia (ATP) do que os glícidos.

Os fosfolípidos são os principais componentes da membrana, no entanto


encontramos ainda glicolípidos e colesterol.

Ao grupo fosfato de um fosfolípido pode estar ligada outra molécula


polar, como é o caso da colina, em cima na imagem, que pode ser um glícido e
funcionar como receptor de membrana ou marcador. Existe ainda uma
excepção em que o fosfolípido não contêm glicerol, a esfingomielina.

Ácidos Nucleicos
Existem dois tipos de ácidos nucleicos, o DNA (desoxirribonucleico) e o
RNA (ribonucleico), que diferem entre si apenas no açúcar (ose), que num caso
é a desoxiribose e noutro a ribose, respectivamente.
Existem vários tipo de RNA:
- mRNA (RNA mensageiro)
- rRNA (RNA ribossómico)
- tRNA (RNA transferência)
- RNAs envolvidos no processamento e transporte de proteínas

Os monómeros dos ácidos nucleicos são o nucleótidos, que são


constituídos por uma base purina ou pirimidina, um açúcar (ose) e um fosfato.

As bases purinas são a:


Adenina e a Guanina; e as pirimidinas
a: Citosina e a Timina/Uracilo. É
importante referir que a Adenina e a
Timina/Uracilo se ligam por apenas
duas pontes de hidrogénio, enquanto
a Guanina e a Citosina se ligam por
três pontes de hidrogénio.

A polimerização é feito por


intermédio de ligações fosfodiéster
entre o grupo fosfato no C5 e grupo
hidroxilo no C3 da base que se segue,
não esquecer que este processo

16
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

ocorre sempre no sentido 5’ 3’ e por isso mesmo, por convenção, se escreve
sempre nesse mesmo sentido.

Os nucleótidos são importantes para a formação os ácidos nucleicos, no


entanto eles intervêm noutros processos de elevada importância, como é o
caso do ATP (adenosina 5’ – trifosfato), é usada como energia química da
célula, ou do AMPc, que é um dos sinalizadores intracelulares.

Proteínas

Os ácidos nucleicos guardam a informação, as proteínas têm como


principal função executar as tarefas contidas nessa informação, e ainda
funções de estrutura, de transporte e armazenamento de pequenas moléculas,
transmissão de informação, defesa e em situações extremas podem ser
utilizadas para produzir energia.
A principal capacidade das proteínas é a de agirem como enzimas,
catalisando as reacções nos sistemas
biológicos.

As proteínas são polímeros de


aminoácidos, existem cerca de 20
aminoácidos, e cada um deles possui
características especiais. Os
aminoácidos podem ter diversas
conformações, dependendo da posição
relativa do grupo amina em relação ao
carbono α, como verificamos na imagem

ao lado. Estando a
cadeia lateral
localizada inferiormente
e o grupo amina e
hidroxilo no mesmo
plano, se o grupo
amina estiver á
esquerda, temos um L
aminoácido, são os
únicos encontrados nas
proteínas humanas; se
o grupo amina estiver á
direita do carbono α,
temos um D
aminoácido (ter em
conta que este
raciocínio é apenas é
viável se o radical se
encontrar representado
inferiormente).
O aminoácido cisteína é importante
pois através do seu grupo lateral, mais
especificamente do grupo SH conseguem
com outro resíduo do mesmo aminoácido
formam pontes dissulfeto.
17
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Os aminoácidos podem ser divididos quanto às suas características


químicas, como sendo ácidos/básicos ou polares/apolares, estas estão
dependentes da sua cadeia lateral.

Os aminoácidos formam proteínas ligando-se entre si por intermédio de


ligações peptídicas, e são sempre sintetizados no sentido de um grupo amina
para um grupo hidroxilo.

A sequência de aminoácidos é apenas o primeiro elemento da estrutura


das proteínas, estas adaptam estruturas tridimensionais que são críticas para a
sua função. Assim sendo existe uma estrutura primária que consiste numa
sequencia linear de aminoácidos; a estrutura secundária pode dividir-se em
duas estruturas:
- Folha β – Pregueada, quando duas cadeias estão lado a lado formam-
se pontes de hidrogénio entre elas, geram-se fitas paralelas ou anti-paralelas;
- α Hélice, a cadeia de aminoácidos gira em torno de si mesma e o
grupo carboxilo de um resíduo de aminoácido liga-se por ponte de hidrogénio
ao grupo amina do resíduo de aminoácido localizado 4 posições abaixo na
cadeia.
A associação de estrutura α-hélice e β-pregueada, conectados pela
cadeia lateral dos seus resíduos de aminoácidos, leva à formação de estruturas
globulares, denominadas de domínios, formando a unidade básica da
estrutura terciária. Na estrutura terciária os aminoácidos hidrofóbicos
encontram-se no interior. Por fim temos a estrutura mais complexa,
denominada por estrutura quaternária, que consiste na interacção de cadeias
polipeptídicas de diferentes proteínas, originando proteínas constituídas por
diversos domínios.

Enzimas

As enzimas catalisam,
aumentam a velocidade, das
reacções que ocorrem no interior
das nossas células. Estas
possuem duas características
que as tornam adequadas para a
sua função, aumentam a
velocidade da reacção sem se
consumirem e sem alterar o
equilíbrio químico da mesma.

O princípio de funcionamento das enzimas consiste em diminuir a


energia de activação, aumento a velocidade da reacção tanto no sentido
directo como no sentido inverso.

Mecanismo de Catálise Enzimática

A ligação Enzima + Substrato é muito especifica, existindo para explicar


esta especificidade dois modelos:

18
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

- Modelo Chave-Fechadura, onde o substrato encaixa perfeitamente


com o centro activo da enzima que catalisa a reacção;
- Encaixe Induzido, a conformação da enzima e do substrato são
modificados pela ligação do substrato, a conformação é de tal forma alterada
que é idêntica à do estado de transição, o que pode facilitar a sua conversão
no produto final.

Coenzimas
Para que o complexo enzima e substrato posso estar activo é necessária
a ligação de um grupo prostético à enzima, que pode ser uma vitamina ou
iões metálicos. Uma das diferenças das coenzimas é que estas são alteradas
durante a reacção, no entanto são recicladas de modo a poderem ser
utilizadas de novo.

Regulação da Actividade Enzimática


Existem diversos tipos de regulação enzimática, destacando-se os
seguintes:
- Inibição por retroalimentação, o produto de uma das reacção da via
metabólica, geralmente o produto final, vai se ligar á enzima que catalisa a
primeira reacção desta via de forma a que esta fique inibida. É assim possível
que haja um controlo dos gastos energéticos e de substrato, pois havendo
muito produto não é necessário que haja continuação da produção, podendo o
substrato ser utilizado para outra via;
- Regulação Alostérica, a enzima é regulada pela ligação de pequenas
moléculas ao seu centro alostérico, inibindo-a ou activando-a, no entanto esta
substância pode ou não ser um produto da via metabólica em questão;
- Fosforilação, a adição de grupos fosfato activa ou inibe a actividade
enzimática.

Energia Metabólica

Este tema é referido no nosso programa de bioquímica e por isso não o


vou referir aqui devido à sua extensão e não ser muito relevante para a
Biologia Molecular da Célula, mas aqui ficam algumas palavras-chaves centrais
deste tema:
- ATP
- Glicólise
- Respiração Aeróbia
- Fotossíntese
- β Oxidação
- Síntese de Proteínas, Glícidos e Lípidos

Membranas Celulares

As membranas são barreiras entre o meio intracelular e o extracelular;


dentro da célula definem os diversos compartimentos existentes. A sua origem

19
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

e estrutura deriva das propriedades dos


lípidos, em grande parte dos fosfolípidos.
Todas as membranas possuem uma
estrutura comum composta por uma
bicamada fosfolipídica e proteínas, que
podem desempenhar função de transporte,
receptoras e de controlo. A percentagem de
lípidos e de proteínas é aproximadamente
equitativa, dentro dos lípidos destaca-se
ainda a presença de colesterol e de
glicolípidos. Esta estrutura em bicamada
permite que moléculas individuais estejam
livres para girarem e se moverem em
direcções laterais, é pois uma estrutura
fluida.

A fluidez depende da temperatura, mas também da composição lipídica


da membrana. As cadeias de ácidos gordos insaturados juntamente com
cadeias curtas de ácidos curtos contribuem para uma maior fluidez, por sua vez
o colesterol torna-a menos fluida, no entanto permite que a fluidez seja mantida
mesmo a temperaturas baixas.

As proteínas de membrana têm um papel diminuto na estrutura da


membrana, sendo a sua actividade executar funções específicas de cada
membrana. Podemos distinguir dois tipos de proteínas nas membranas:
- Proteínas Transmembranares ou Integrais, que estão incluídas
dentro da bicamada fosfolipídica;
- Proteínas Periféricas, não estão inseridas na membrana, mas
associadas à bicamada fosfolipídica perifericamente, geralmente ligadas a
proteínas integrais.

As porções que atravessam a bicamada são geralmente de estrutura em


α-hélice de 20 a 25 aminoácidos não polares e estão geralmente associadas a
glícidos, permitindo a interacção entre células. É importante referir que existem
ainda estruturas denominadas de Barris β, que consistem em várias proteínas
com estrutura de folha β-pregueada de forma a formarem um “poro” na
membrana permitindo a entrada de diversas moléculas.

Transporte Através das Membranas Celulares

As membranas possuem permeabilidade


selectiva, o que permite á célula manter e controlar
a sua composição interna. Apenas as moléculas
pequenas e apolares atravessam prontamente a
membrana; as que não o conseguem por si só
fazem-no por intermédio de proteínas
transmembranares especificas que agem como
transportadores, o que origina a permeabilidade
selectiva das membranas.

20
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

As proteínas de transporte podem ser divididas em proteínas de canal,


consistem em poroso abertos selectivamente, ou em proteínas transportadoras,
que se ligam e transportam selectivamente, facilitam a passagem por elas
mudando a sua conformação.

O transporte pode ser feito de forma passiva, a favor do gradiente de


concentração, ou de forma activa, com gasto energético e contra o gradiente
de concentração, permitindo o controlo da composição interno da célula.

21
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Três (pág. 113 – 138)


Hereditariedade, Genes e DNA
Todos os organismos herdam dos seus progenitores a informação
genética especificando estrutura e função das suas células. Visto que todas as
células são originadas de outras pré-existentes, o material genético é replicado
e passado da célula parental para a descendente em cada divisão.

Genes e Cromossomas

Os princípios básicos genéticos foram deduzidos por Gergor Mendel em


1865:
Alelo – cópia de um gene, que especifica uma determinada
característica. Existem dois alelos para cada gene, sendo que um é herdado do
pai e outro da mãe.
Dominante – “demonstra-se” sempre, quer em homozigotia, quer em
heterozigotia.
Recessivo – expressa-se apenas quando em homozigotia.
Genótipo – constituição de um indivíduo em genes.
Fenótipo – características físicas que advêm do seu genótipo.
Cromossomas – são como que “carregadores de genes”.
Diploide (2n) – existem no organismo duas cópias do genoma, existem
cromossomas homólogos.
Haploides (n) – apenas existe uma cópia do genoma.

Existem dois tipos de divisão celular, sendo que uma é a mitose e outra
a meiose. Na mitose existe uma conservação numérica do material genético

22
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

da célula, onde uma célula diploide origina duas igualmente diploides. Na


meiose encontramos duas divisões, sendo que a primeira é reducional, ou seja,
de uma célula diploide originam-se duas haploides, que por sua vez se irão
dividir, mantendo a quantidade de genoma, originando-se assim quatro células
haploides. Apenas na formação dos gâmetas existe a divisão meiótica, pois é
necessário que estes sejam haploides, para que a quando da fecundação se
possa formar uma célula diploide e por divisões mitóticas, que conservarão o
número de cromossomas, surgir um individuo diploide.

Durante a meiose ocorrer recombinação entre os genes, sendo mais


frequente entre genes distantes do que próximos.

Ao longo da nossa vida ocorrem


alterações nosso genoma, que podem ser
chamadas num contexto biológico de
mutações, no entanto no ponto de vista
clínico apenas as que originam uma
patologia, e se encontram sob uma
pressão selectiva negativa e por isso ocorrem numa percentagem menor da
população, são designadas de mutações; as restantes e que ocorrem
geralmente numa percentagem entre 1% a 3% da população, não sendo
prejudiciais, não sofrem uma pressão selectiva negativa e por isso são
transmitidas à descendência, designam-se por polimorfismos. Através do
estudo dos polimorfismos é possível estudar migrações, e relações entre
pessoas ao longo de muitas gerações, como identificar corpos ou realizar
testes de paternidade.

23
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Genes e Enzimas
Através de várias experiencias chegou-se à conclusão que uma
determinada mutação alterava uma determinada via metabólica, logo alterava
uma enzima, e que diferentes mutações em genes diferentes afectavam
diferentes vias ou diferentes “pontos” de uma mesma via e dai conclui-se que
cada gene correspondia a uma proteína.
Este princípio de que a cada gene corresponde uma proteína é um
dos grandes pilares da actual genética.

Replicação do DNA
A descoberta das cadeias duplas de DNA originou uma solução para a
questão de como o material genético se replicaria, as duas cadeias poderiam
separar-se e servir de molde para a síntese de uma nova cadeia através da
complementaridade de bases – hipótese semiconservativa.
A replicação do DNA na célula é mediada pela enzima DNA polimerase
e ocorre sempre no sentido de 5’ para 3’.

Expressão da Informação Genética

Os genes determinam a estrutura (sequência de aminoácidos) das


proteínas, as quais são responsáveis por direccionar o metabolismo; estas
actuam como enzimas e tornam as reacções na célula possíveis, no sentido
em que aumentam a sua velocidade. As proteínas são polímeros de
aminoácidos, cuja sequência determina a sua estrutura e função.

Função do RNA Mensageiro

Apesar de ser o DNA que determina a sequencia de aminoácidos, não o


faz directamente, o que se prova pelo facto do DNA se localizar no núcleo e a
síntese proteica se realizar no citoplasma, logo é preciso uma molécula que
transporte a informação para os ribossomas – mRNA.
O RNA é similar ao DNA, apenas difere no facto de ser uma cadeia
simples, o seu açúcar ser a ribose e possuir uracilo no lugar de timina. Apesar
das diferenças é possível sintetizar uma molécula de RNA a partir de um molde
de DNA, logo o RNA mensageiro é originado tendo como molde o DNA num

24
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

processo denominado transcrição. A transcrição é catalisada pelo RNA


polimerase, no entanto para a síntese proteica é ainda importante o RNA
ribossomal e o RNA de transferência.

O Código Genético

Como é que a sequência de nucleótidos do mRNA é traduzida numa


sequência de aminoácidos?
Visto que os aminoácidos e nucleótidos não são estruturalmente
relacionados, não é possível o emparelhamento directo entre o mRNA e os
aminoácidos. Assim sendo o tRNA serve de adaptador, permitindo a relação
entre o mRNA e os aminoácidos.
Cada aminoácidos é ligado a um tRNA específico, que tem uma
sequência (anticodão) que emparelha com uma sequência do mRNA (codão),
permitindo desta forma direccionar correctamente a síntese de proteínas.

Através da determinação da sequência de nucleótidos que origina


determinado aminoácido foi criado o código genético. Todos os organismos
têm o mesmo código genético, sendo que os dois primeiros nucleótidos
iniciais são mais específicos do que o 3º, ou seja, uma alteração no 3º
nucleótido é menos propícia a provocar uma mutação patogénica. UAA, UAG e
UCGA são codões de finalização, indicam ao ribossoma que a tradução deve
terminar. Existem apenas 4 nucleótidos, que se agrupam 3 a 3 (tripletos), o que
origina 43 combinações possíveis, temos assim 64 codões possíveis. Visto que
apenas existem 20 aminoácidos, e temos 64 codões, indica-nos que o código
genético é redundante, sendo um aminoácido codificado por mais do que
um codão.

Vírus de RNA e Transcrição Reversa

Apesar do DNA ser o material genético de eleição para quase todas os


organismos, devido à sua maior estabilidade, existem alguns vírus cujo
genoma é constituído apenas por RNA – Retrovírus.
Surgiu então a questão de como poderia este vírus incluir o seu genoma
no da célula, assim sendo, estes vírus possuem uma enzima, a transcriptase
reversa, que faz o inverso da transcrição, sintetizando uma molécula de
DNA tendo como molde uma de RNA.
A transcrição reversa não ocorre apenas nestes vírus, mas também nas
nossas células e é responsável pela transposição de sequências de DNA de
uma localização cromossómica para outra.
Este processo, a transcrição reversa, permite ainda aos investigadores
originar de qualquer molécula de RNA uma de DNA, o que facilita o estudo das
células eucarióticas.

DNA Recombinante
A técnica de DNA recombinante permitiu aos cientistas isolar,
sequenciar e manipular os genes individuais de qualquer célula,
revolucionando assim a Biologia Molecular e Celular. Esta técnica inclui alguns
25
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

conceitos como as endonucleases de restrição, vectores recombinantes,


sequenciamento, entre outras que abordaremos de seguida.

Endonucleases de Restrição

São enzimas que clivam o


DNA em sequencias especificas,
de quatro a oito pares de bases, e
que foram pela primeira vez
identificadas em bactérias, onde
clivam o DNA estranho como modo
de defesa contra vírus.
Existe uma enorme variedade
de endonucleases de restrição, mais
de uma centena, cada um
reconhece apenas uma sequência
especifica, sendo esta uma das
suas características.

Após a clivagem num ponto desta determinada sequencia, no maior


parte dos casos, originam-se extremidades coesivas, que são
complementares; porém existem excepções, em que ao clivarem, estas
enzimas, não originam extremidades com cadeia simples, , que surgem neste
caso, são complementares com qualquer outra extremidade cega, no entanto é
mais difícil fazer com que estas se unam.

Electroforese em Gel
O método mais comum em que as
moléculas são separadas com base na
razão da sua migração num campo eléctrico,
tendo em conta que se usam géis de
agarose ou de policrilamida. Este gel é
colocado num compartimento contendo uma
solução tampão e eléctrodos, a amostra é
pipetada em poços abertos no gele o campo
eléctrico é ligado. Os ácidos nucleicos,
carregados negativamente, devido ao grupo
fosfato, migram em direcção ao pólo
positivo. O gel funciona como que uma
peneira, retardando o movimento das
moléculas maiores e facilitando a passagem
de moléculas menores, o que permite a sua
separação pelo seu tamanho e peso
molecular.

26
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Gerar Moléculas de DNA


Recombinante

A estratégia básica da clonagem de


moléculas é inserir o DNA de interesse num
vector, que é consiste numa molécula de DNA
com a capacidade de se auto-replicar,
independentemente do DNA da célula
hospedeira. Resulta então uma molécula
recombinante que é composta pelo insert de
DNA (molécula de interesse) ligado à sequencia
de DNA do vector. Este vector pode ser inserido
numa célula hospedeira e originar inúmeras
cópias.

Os fragmentos de DNA usados para


criar moléculas recombinantes são
normalmente gerados por digestão com
enzimas de restrição, deixando
extremidade coesivas que podem ligar-se
a outras por complementaridade. O
restabelecer entre estas extremidades
pode ser mediado pelas DNA ligases,
assim sendo dois fragmentos de DNA
clivados pelo mesma enzima de restrição
podem ser unidos, originando uma
molécula de DNA recombinante.

As sequencia de RNA também


podem ser clonadas, primeiro através da
transcriptase reversa, que origina cDNA
(DNA complementar), podendo assim ser
ligada a um vector como já foi descrito
anteriormente. Este método permite um
melhor estudo da estrutura e função
genética dos eucariótas, viste que permite
estudar as sequencias de DNA sem os
seus intrões, sequencias não codificantes
e que são removidas na célula por
splicing, visto que originamos cDNA a
partir de mRNAs maduros (já sem os seus
intrões).

27
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Vectores para DNA Recombinante


Existem diversos tipos de vectores, como
é o caso dos vectros bacteriófagos λ,
cosmídeos, cromossomas artificiais de leveduras
(YAC), no entanto os que mais amplamente
utilizados são os plasmídeos. Os plasmídeos
permitem uma mais fácil manipulação, sendo
moléculas circulares de DNA com capacidade
de ser auto-replicarem.
Para um vector de clonagem é
necessário:
- Origem de Replicação: local onde se liga a DNA polimerase e que
permite a replicação;
- Gene de Resistência a Antibióticos: permite seleccionar as células
hospedeiras onde foi ou não incorporada o vector;
- Local de Policlonagem: local onde existem sequencias de corte para
várias enzimas de restrição, é o único local onde estas clivam, e na maior parte
dos casos clivam neste local apenas uma vez;
- Promotor: permite a expressão, pois é aqui que se irá ligar a RNA
polimerase, e a sua presença distingue um vector de expressão de um de
clonagem.

Nota: É importante ter em conta que a ligação entre o insert de DNA


e o vector de clonagem não é um processo muito eficaz, por isso coloca-
se o insert de DNA em excesso. Mesmo que este processo ocorra, e haja
uma recirculação da molécula de DNA, existem três situação possíveis e
apenas uma delas é a pretendida: plasmideo não-recombinante,
plasmideo recombinante com o insert na posição correcta (5’  3’) ou na
posição incorrecta (3’  5’). Esta situação é solucionável com a análise
das colónias que se formam, podendo assim determinar qual a que tem o
plasmídeo recombinante com o insert na posição correcta. Esta situação
é analisada com a digestão dos plasmideo de várias colónias, com a
mesma enzima de restrição, e posterior electroforese, que através do
tamanho dos fragmentos nos permite saber qual é o correcto.

Sequenciação do DNA

A clonagem de DNA permite o isolamento de sequências de DNA em


quantidades suficientes para a sua caracterização detalhada, incluindo a
determinação da sua sequencia. O método mais utilizado é o baseado na
terminação prematura da síntese de DNA resultante da inclusão de
didesoxinucleotídeos (não contêm o grupo hidroxilo no carbono 3’).

28
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A síntese de DNA
começa com um primer, pois a
DNA polimerase não é capaz
de iniciar a síntese a partir de
uma cadeia simples de DNA,
este primer é marcado com um
radioisótopo. São feitas quatro
reacções separadas, cada uma
delas contento um
didesoxinucleotídeo, além dos
restantes componentes comuns
(primers, DNA de interesse,
nucleotídeos e DNA
polimerase). A incorporação de
um didesoxinucleotídeo
bloqueia a síntese da restante
cadeia, existem assim em cada
reacção diversos fragmentos
com diversos tamanhos, no entanto todos eles terminam num
didesoxinucleotídeo (A,G,C ou T). Estes fragmento são separados por
electroforese, em gel de policrilamida (que permite uma maior resolução), o gel
é exposto a um filme raio-X. visto que o tamanho de cada fragmento é
determinado pelo didesoxinucleotídeo terminal, a sequencia do DNA
corresponde à ordem dos fragmentos lidos a partir do gel.

Actualmente a sequenciação em grande escala é feito por sistemas


automáticos que contendo primers ou didesoxinucleotídeos florescentes, são
submetidos à electroforese e ao passarem num laser são excitados e emitem
luz, que é detectada por um fotomultiplicador e analisada por um computador, é
assim feita a sequencia do DNA (em fluorogramas de sequenciação). Se forem
utilizados didesoxinucleotídeos florescentes, desde que cada um emita uma luz
distinta, a reacção pode ser toda efectuada num mesmo microtubo.

Expressão dos Genes Clonados

A clonagem molecular além de permitir sequenciar os genes, permite


ainda a obtenção de grandes quantidades de proteína, tanto para o seu estudo,
como para o uso terapêutico.

Para expressar um gene eucariótico em E.Coli, o cDNA de interesse é


clonado dentro de um vector plasmidial ou fago que contenha sequência que
dirijam a transcrição, promotor, o que origina um vector de expressão. Visto
que se trata de uma proteína eucariotica é útil expressa-la num organismo
eucariotico, para que as modificações pós-traducionais possam ocorrer de
forma normal.

Por norma, nos vectores de expressão, existe uma sequência de


reguladora, para que a expressão de determinada proteína possa ser
controlada, de modo a preservar a célula hospedeira. Podemos ainda adicionar
ao vector determinadas sequências, como é o caso da sequencia de Shine

29
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Delgarno, onde se liga a RNA polimerase procariótica, de modo a aumentar a


produção de uma determinada proteína.

Amplificação de DNA pela


Reacção em Cadeia de Polimerase
(PCR)

Para realizarmos a PCR, que consiste


numa DNA polimerase usada repetidas vezes,
produzindo de forma exponencial; no entanto é
necessário conhecer alguma sequencia da
molécula de DNA que desejamos amplificar.
São usados primers de DNA, de 15 a 20
nucleótidos, que flanqueiam a região em ambos os
lados e que hibridem apenas uma vez na molécula
de DNA presente. A solução contendo DNA, DNA
polimerase, nucleótidos e primers é aquecida
(95ºC) para que haja a separação das cadeias
duplas de DNA. A temperatura é diminuída para
permitir a hibridação dos primers, permitindo
assim que a DNA polímeras inicie a síntese de
novas cadeias, o que é feito a uma temperatura
óptima (75ºC). Estes ciclos são repetidos cercas
de 30 vezes e permitem originar de uma única
molécula de DNA inúmeras moléculas de DNA,
cerca de 230.

Transferência de Genes em
Plantas e Animais
Apesar de o estudo em células eucariótas
ser complexo é possível, recorrendo à
transferência génica, estudar os mecanismos de regulação da expressão
genica e processamento proteico.
O DNA é introduzido nas células animais juntamente com um co-
precepitado de fosfato de cálcio. Inicialmente o processo era feito através de
DNA infecciosos virais e por isso este processo é muitas vezes designado
como transfecção. Este DNA é absorvido e transportado até ao núcleo onde é
transcrito por vários dias, no entanto numa pequena fracção das células o DNA
é integrado no seu genoma e transmitido aos seus descendentes. As células
que contem este gene podem ser isoladas se este conferir resistência a
determinados antibióticos, podendo assim ser estudado o efeito destes genes
no comportamento celular.

Existem outros métodos para a incorporação de DNA em células de


mamíferos:
- Microinjecção directa de DNA no núcleo;
- Incorporação de DNA em vesículas lipídicas;

30
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

- Impulso eléctrico que abre os poros transientes na membrana


(electroporação);
- Vírus usados como vectores, especialmente retrovírus, pois no seu
ciclo está incluída a integração estável do DNA viral no genoma das células
hospedeiras.

Mutagénese de DNA Clonados

Os genes mutados são detectados porque resultam em mudanças


fenotípicas observáveis.

O isolamento de genes pelo DNA recombinante tem aberto novas


fronteiras, é agora possível introduzir qualquer alteração desejada num gene,
clona-lo e determinar o efeito dessa mutação, esta técnica designa-se por
genética reversa.
A mutagénese in vitro tem permitido a caracterização detalhada das
actividades funcionais de sequencias regulatórias e codificantes para proteínas
dos genes clonados.

31
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Quatro
A complexidade dos Genomas Eucariótas
Os genomas eucariótas são maiores e mais complexos do que os
procariótas, o tamanho pode estar relacionado com uma maior complexidade,
no entanto não parece que assim seja, pois organismos menos complexos
possuem mais DNA que outros mais complexos.
Este paradoxo foi solucionado pela descoberta que no genoma
eucariótico não existe somente genes funcionais, mas sim uma grande
quantidade de sequencias de DNA que não codificam proteínas. Apenas cerca
de 3% do DNA codifica proteínas. Isto deve-se ao facto de existirem intrões e
exões, juntamente com as família de genes e as sequencias repetitivas, que
aprofundaremos de seguida.

Intrões e Exões
Parte do DNA não-codificante situa-
se entres os genes e denomina-se por
sequências espaçadoras. No entanto
sequencias não codificantes são
encontradas nos genes, assim sendo temos
os exões, que codificam realmente as
proteínas, e os intrões, que não codificam
as proteínas e são removidos do mRNA
após o seu processamento.
O gene inteiro é transcrito, e
seguidamente através de splicing os intrões
são removidos. Os intrões no entanto estão
em grande quantidade, e são geralmente
maiores que os exões, o que ajuda a
manter uma baixa taxa de mutações; pois é
mais provável que esta ocorra em sequências não codificantes. Apesar de a
real função dos intrões ainda não ser conhecidos, alguns deles codificam
pequenos RNAs. Em todos os genes existem ainda sequencias que os
flanqueiam, e que são transcritas, no entanto não são traduzidas, as UTR 5’ e
3’.

Famílias Génicas e Pseudogenes

Outro factor que contribui para o grande tamanho dos genomas


eucariótas é a presença de alguns genes repetidos muitas vezes, a estas
múltiplas cópias de uma mesmo gene chamamos famílias génicas. Este facto
é justificado pela necessidade de grandes quantidades de determinada
proteínas ou RNAs, existem ainda diferentes membros da família que podem
ser transcritos em células diferentes ou em estágios diferentes do
desenvolvimento. O último acontecimento pensa-se que deriva da existência de
mutações que surgiram em diferentes membros da família, originados por

32
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

duplicação de um gene, que se podem ter tornado optimizados em diferentes


tecidos ou estágios de desenvolvimento. No entanto como era de esperar nem
todas as mutações melhoram a função dos genes, outras tornam-nos inactivos,
originando pseudogenes.

Sequências de DNA Repetitivas

Uma parte substancial do genoma é constituído por sequencias


repetitivas de DNA não-codificante. Sequencias simples de DNA contendo
milhares de cópias de sequencias curtas, de 5 a 20 nucleótidos, ordenados em
série, designam-se por DNAs Satélites e são responsáveis por 10% a 20% do
genoma.
Outras sequências encontram-se espalhadas pelo DNA genómico, em
vez de estarem agrupadas. Se forem elementos curtos dispersos repetidos,
designam-se SINEs e temos como exemplo os elementos Alu; se forem
elementos longos dispersos repetidos, designam-se LINEs.

Cromossomas e Cromatina

O genoma dos eucariótas é muito mais complexo do que o dos


procariótas, mas também é organizado de forma diferente. O genoma dos
procariótas está contido num único cromossoma e que é usualmente circular.
Nos eucariótas o genoma é composto por vários cromossomas, contendo cada
um uma molécula linear de DNA, que se encontra associado a proteínas, as
histonas, que o empacotam de modo ordenado.

Cromatina
A cromatina é composta
pelo DNA eucariótico juntamente
com as proteínas associadas a
este, sendo que estas se
encontram numa proporção de
1:2, existindo na cromatina uma
maior proporção de proteínas do
que de DNA. Além das histonas
existem outras proteínas que
contribuem para o
empacotamento do DNA nuclear
e ainda as que participam nos
processos de replicação e de expressão do DNA.
A unidade estrutural básica da cromatina é o nucleossoma, cuja parte
central é constituída pela cromotossoma e uma histona. Fazem ainda parte do
nucleossoma proteínas não histónicas que estão flanqueando a parte central
deste, sendo duas, e que estão separadas por cerca de 200 pb.
Os nucleossomas são empacotados em fibras com cerca de 30 nm, cuja
estrutura ainda não foi determinada, no entanto sabe-se que o grau de
condensação da cromatina varia ao longo do ciclo celular; podemos assim
distinguir a eurocromatina, quando esta se encontra descondensada, e a
heterocromatina, quando esta se encontra condensada.
33
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Centrómeros
Os centrómeros são uma região
especializada do cromossoma que assegura a
distribuição correcta dos cromossomas
duplicados durante a mitose, é aqui que se
ligam os microtúbulos do fuso acromático, e
garantem ainda que os cromatídeos estão
unidos.
Os centrómeros são compostos por
sequencias altamente repetitivas e outras não
repetitivas, nos seres humanos é composto
por DNA satélites e proteínas associadas.
Os centrómeros humanos formam
grande cinetocoros que se ligam entre 30 a 40
microtúbulos durante a mitose.

Telómeros

Os telómeros são as sequências nas extremidades dos cromossomas,


que desempenham um papel crucial na replicação e manutenção do
cromossoma, sendo compostos por repetições de uma única sequência do
DNA que contem em uma das cadeias um agrupamento de guanina. Estas
sequências são repetidas milhares de vezes e terminam com uma extremidade
de cadeia simples.

A DNA polimerase não é capaz de iniciar a sua função numa cadeia


simples, sendo a sequencia dos telómeros replicada usando a actividade de
uma transcriptase reversa, que juntamente com outras proteínas constitui um
complexo, a telomerase. Esta enzima apenas se encontra activa na fase
embrionária e inicio da vida

A manutenção dos telómeros é importante na determinação do tempo de


vida e capacidade de reprodução das células. Pensa-se que, a fim de evitar
que as extremidades dos cromossomas de degradem, a extremidade do
telómero se dobra sobre si mesmo de forma a forma uma estrutura circular.

O Genoma Humano
O genoma humano é constituído por cerca de 3 x 109 pares de bases, e
estima-se que existam cerca de 100.000 genes humanos. Existem 24
cromossomas (2n), sendo que 22 são autossomas e 2 são cromossomas
sexuais. Todos as nossas células são diploides, ou sejam possuem 12 pares
de cromossomas, com excepção dos gâmetas que apenas possuem 12
cromossomas, são por isso haploides.
No nosso genoma existem polimorfismos, que são sequências diferente
de individuo para individuo, que se originaram por alteração no DNA, mas que
ocorreram em zonas não codificantes ou não originaram nenhuma patologia.
Existem diversos tipos de polimorfismos:

34
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

- STRs – existem a repetição de uma sequencia curta, varia de individuo


para individuo o número de repetições que existem;
- VNTRs – repetição de uma sequencia de tamanho variável, mas maior
do que em STRs, e que varia igualmente entre os indivíduos;
- SNPs – polimorfismos que são originados devido a uma alteração em
um único nucleótido.

Os genes humanos podem ser mapeados por hibridação de células


somáticas, hibridação in situ fluorescente e análise de ligação genética. Têm
sido usados clones de YAC para construir mapas do genoma humano. O
sequenciamento aleatório de genes de cDNA tem fornecido marcadores para
sequencias presentes nos mRNAs. Marcadores de DNA de mais de 30000
genes humanos têm sido usados para construir um mapa físico e genético
integrado do genoma humano.

35
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Cinco
DNA Polimerases
A capacidade desta enzima de copiar um molde de DNA prova a base
bioquímica para a hipótese de replicação proposta inicialmente, hipótese semi-
conservativa. Existem várias DNA polimerases que desempenham diferentes
papeis na replicação e reparação do DNA. Conclui-se após várias experiencias
que a DNA polimerase I e III são necessárias, e de grande importância, para a
replicação na E.Coli.
As células eucariótas contêm as DNA polimerases α,β,γ,δ e ε.

A DNA polimerase γ localiza-se na mitocôndria e é responsável pela


replicação do seu DNA. As restantes localizam-se no núcleo e são possíveis
intervenientes na replicação do genoma nuclear.

As polimerases β encontram-se activas tanto em células que estão


divisão como em células que não estão, o que nos sugere que pode
primariamente estar envolvida em mecanismos de reparação.

O papel das polimerases α, δ e ε na replicação foi comprovada em


várias experiencias, como é exemplo a replicação do vírus SV40 em células
livres, que nos mostrou a importância a importância das polimerases α e δ; e o
facto das α, δ e ε serem encontradas em leveduras e células de mamíferos
demonstrou que sem qualquer uma delas não ocorre replicação em leveduras,
mas foi igualmente demonstrado que as polimerases ε possuem um papel
especifico nas leveduras, concluindo que as polimerases α e δ são as
grandes responsáveis pela replicação nas células eucariótas em geral.

Todas as polimerases possuem duas características indispensáveis para


a replicação do DNA:
- Sintetizam DNA somente na direcção de 5’  3’, adicionando um dNTP
no grupo hidroxilo da cadeia nascente;
- Apenas conseguem adicionar um novo desoxirribonucleico a uma
cadeia de DNA dupla; assim sendo as DNA polimerases não são capazes de
iniciar, por si só, a replicação sem a existência prévia de uma cadeia dupla; é
um dos aspectos em que difere da RNA polímeras, pois esta consegue ligar-se
a uma cadeia simples e iniciar a sua função.
Estas características parecem ser criticas na manutenção da alta
fidelidade da replicação do DNA para a reprodução celular.

Nota: O facto de a DNA polimerase apenas sintetizar no sentido de 5’ 


3’ deve-se ao facto de o grupo fosfato que é clivado, de modo a fornecer
energia para a formação da ligação é do nucleótido que se irá juntar de novo.
Se fosse sintetizada no sentido 3’  5’, o grupo fosfato clivado seria o do
nucleótido na extremidade na cadeia que está a ser sintetizado, assim sendo
se houver um erro e for necessário substituir este nucleótido não existe já o
grupo fosfato que permita a formação de uma nova ligação, se a síntese for

36
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

feita no sentido 5’  3’, a energia para a formação da nova ligação provem do


novo nucleótido, o que nos permite a reparação do DNA.

A Forquilha de Replicação

Durante a replicação das moléculas circulares de DNA podiam ser


observadas duas forquilhas de replicação, que representam as regiões
activas na síntese de DNA e são constituídas por duas cadeias de DNA
parental separadas e duas filhas sendo sintetizadas. Surgiu então um problema
devido ao facto de as cadeias terem que ser sintetizadas em sentidos opostos,
no entanto a DNA polimerase apenas consegue sintetizar na direcção 5’  3’,
como poderiam duas cadeias ser sintetizadas em simultâneo?
Ficou então demonstrado que apenas uma das cadeias é sintetizada de
forma contínua, no sentido da forquilha, a outra cadeia é sintetizada de forma
descontinua, sendo composta por fragmentos descontínuos que são
sintetizados no sentido oposto ao da forquilha, permitindo que sejam
sintetizados no sentido de 5’  3’. Estes fragmentos são denominados por
fragmentos de Okazaki e são posteriormente unidos por uma DNA ligase.

A cadeia que é sintetizada no sentido da forquilha designa-se por cadeia


de síntese continua, enquanto que a outra cadeia de síntese descontinua.
Outro dos problemas que surgiu foi: como conseguiria a DNA polimerase
sintetizar os fragmentos de Okazaki, se esta necessita de primers?
Existem pequenos fragmentos de RNA que actuam como primers e são
sintetizados (fragmentos de 3 a 10 nucleótidos) por uma enzima especifica –
primase.

É então necessário remover os fragmentos de RNA que existem nos


fragmentos de Okazaki, esta acção é realizada pela DNA polimerase I na
E.Coli, que tem o papel de uma exonuclease, nas células eucariótas é
desempenhada por outras exonucleases e o espaço que surge preenchido pela
DNA polimerase δ.

Função Eucariótas Procariótas


Síntese de cadeias DNA Polimerase δ DNA Polimerase III
continua e alongamento
da descontinua
Remoção de Primers Exonucleases RNase H + DNA
Polimerase I
Síntese de pequenos DNA Polimerase α + DNA Polimerase II
fragmentos DNA-RNA Primase
União dos Fragmentos DNA Ligases DNA Ligases
de DNA

Além da DNA polimerase e das primases existem mais proteínas


envolvidas na replicação do DNA; um grupo de proteínas liga-se à DNA
polimerase aumentando a sua actividade e fazendo que permaneçam ligados à
cadeia de modo a que continuem a sintetizar; existem então dois tipos de

37
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

proteínas acessórias, as de carregamento do “grampo” (RFC em mamíferos) e


as de deslizamento do “grampo” (PCNA em mamíferos):
- RFC, complexo C no eucariótas, reconhecem e ligam-se
especificamente ao DNA no local do primer;
- PCNA, antigénio nuclear de células em proliferação nos eucariótas,
ligam-se às adjacências das proteínas de carregamento de “grampo” (RFC),
formando um anel em torno da cadeia molde do DNA, este anel mantém a
associação entre a cadeia de DNA e o complexo da DNA polimerase e as
proteínas acessórias, permitindo a síntese ininterrupta de milhares de
nucleotídeos.

Existem ainda as helicases que catalisam o desenrolamento da cadeia


dupla do DNA parental, e as proteínas SSB (proteínas de ligação ao DNA de
cadeia simples), que estabilizam a cadeia molde desenrolada, mantendo-a
como cadeia simples para que possa ser copiada.

Á medida que as cadeias vão sendo desenroladas, as região à frente da


forquilha de replicação são obrigada a rodar, o que levaria a um bloqueio da
replicação, devido ao enrolamento excessivo das cadeias. Este problema foi
resolvido por uma enzima, a topoisomerase, que catalisa a reacção reversível
de quebra e junção de cadeias de DNA; existem dois tipos desta enzima:
- Topoisomerase I, que clivam em apenas uma das cadeias;
- Topoisomerase II, que clivam simultaneamente as duas cadeias.
Estas quebras permitem à molécula girar livremente evitando a
supertorção do DNA à frente da forquilha de replicação, permitindo que a
replicação prossiga. Apesar de os cromossomas eucariótas serem lineares,
eles também requerem a intervenção de topoisomerases, de modo a evitar o
continuo girar do cromossoma.
A topoisomerase II está também envolvida na condensação do DNA
mitótico.

As enzimas envolvidas na replicação actuam de forma coordenada


permitindo a síntese simultânea tanto da cadeia continua, como da
descontinua. Esta simultaneidade é conseguida pela formação de dímeros das
DNA polimerases, estando uma envolvida na síntese da cadeia continua e
outra na cadeia descontinua.

Fidelidade da Replicação

A exactidão da replicação do DNA é crucial para a reprodução celular,


as estimativas indicam que apenas existe uma única base incorrecta a cada
109 ou 1010 nucleotídeos incorporados. Esta fidelidade é nos dada pela simples
complementaridade de bases, no entanto ela é tão elevada devido às
actividades da DNA polimerase.

A DNA polimerase não catalisa apenas a incorporação de qualquer


nucleotídeo, mas ela evita a incorporação de uma base erra, mal-pareada,
através de uma presumível adaptação à conformação da base correcta, este
mecanismo permite aumentar em 100x a fidelidade da replicação. Outro
mecanismo é a correcção dos erros pela DNA polimerase, que através das

38
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

suas funções de exonuclease remove a base mal-pareada e substitui-a pela


correcta. Esta actividade está associada às DNA polimerases ε e δ, e
aumenta a fidelidade entre 100 a 1000 vezes. A importância do mecanismo de
correcção explica a existência de primers e do DNA ser apenas sintetizado no
sentido de 5’  3’.

As Origens e a Iniciação da Replicação

A replicação tanto em eucariótas como em procariótas inicia-se em uma


sequencia particular, a origem de replicação. Esta consiste numa sequencia
de nucleótidos onde se ligam proteínas. Inicialmente a proteína iniciadora que
recruta as helicases e a SSB (que desenrolam a cadeia dupla e expõem a
cadeia molde), seguidamente a primase inicia a síntese da cadeia continuam,
surgem assim duas forquilhas de replicação que se movem em sentidos
opostos.

Nas células eucariótas existem milhares de origens de replicação,


contrariamente à E.Coli, onde apenas existe uma, de modo a que apesar do
tamanho do genoma e de uma síntese mais lenta, a replicação em eucariótas
seja feita em poucas horas. Estas diversas origens de replicação nos
eucariótas existem em intervalos de 50 a 300 kb.

Nas leveduras encontram-se sequências que podem sustentar a


replicação de plasmídeos, sem necessidade de incorporação no cromossoma.
Estas sequências de auto-replicação (ARS), existem igualmente no DNA
cromossomal da levedura, e nelas está contida o complexo da origem de
replicação (ORC), onde se vão ligar as proteínas envolvidas na replicação.
Apesar de ainda pouco conhecidas as sequências de iniciação da
replicação nos eucariótas mais complexos, pensa-se que sejam idênticas às
das presentes nas leveduras.

Os Telómeros e a Telomerase

Visto que a DNA polimerase não é capaz de copiar as extremidades dos


cromossomas, visto que apenas sintetiza no sentido 5’  3’ e com inicio numa
cadeia dupla; é por isso necessário a presença de mecanismos especiais para
replicar as sequências dos telómeros.
Os telómeros são sequencias repetidas directas, que são sintetizadas
por intermédio da telomerase, que é capaz de catalisar a síntese de DNA na
ausência de um molde de DNA. A telomerase é uma transcriptase reversa e
que como tal sintetiza DNA apartir de um molde de RNA, que está contido nela
e é complementar às sequencias repetitivas dos telómeros. Este molde permite
que a telomerase estenda a extremidade 3’ do DNA cromossomal uma unidade
de comprimento além do seu tamanho original, podendo assim a cadeia
complementar ser sintetizada pelo complexo DNA polimerase α+ primase. A
remoção do primer de RNA deixa a extremidade 3’ numa cadeia simples, o que
pode levar a formação de laços nos cromossomas eucariótas.

39
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A telomerase, e os telómeros, permitem que haja a replicação do


material genético sem perda de sequências significativas, visto que em cada
replicação existe a perda de uma parte da extremidade da cadeia.

A telomerase não se encontra sempre activa, pensa-se que apenas na


fase embrionária, o que nos leva a pensar que os telómeros determinam o
número de vezes que uma célula se pode replicar e desta forma a nossa
longevidade.

Reparação do DNA

O DNA, como qualquer molécula, pode sofrer reacções químicas, sendo


alterado, o que não deve acontecer pois ela é responsável pelo nosso material
genético.
As mutações vão desde a incorporação incorrecta de base durante a
replicação, à alterações químicas espontâneas ou como resultado de
exposição a agentes mutagénicos.

Os mecanismos de reparação do DNA pode dividir-se em dois grandes


grupos: reversão directa da reacção química responsável pelo dano e
remoção de bases alteradas por substituição com DNA recém-sintetizado.
Onde a reparação do DNA falha, desenvolveram-se mecanismos para que a
célula posso lidar com o dano provocado.

Reversão Directa de Lesões do DNA

Poucos tipos de lesões são reparados por este mecanismo,


particularmente os dímeros de timina devido à exposição a UV e os resíduos
de guanina alquilados, que foram modificados pela adição de grupos metilo
ou etilo na posição O6 do anel purínico.

A radiação UV é das maiores fontes de dano do DNA e na sua maioria


leva á formação de dímeros de pirimidinas, estas formações destorcem a
cadeia de DNA e bloqueiam a transcrição e replicação. A reparação é feita de
forma directa por uma reacção de dimerização, e o processo denomina-se por
fotoreactivação, pois é a energia da luz visível que permite a quebra da
estrutura do anel formado entre dos dois nucleotídeos. É de salientar que este
processo não ocorre nos humanos.

Outra forma directa de reparação lida com os danos resultantes da


reacção de agentes alquilantes do DNA, que transferem grupos metilo e etilo
para bases do DNA, temos o caso especifico da O6-metilguanina, que se
emparelha com a timina em vez da citosina. Esta lesão pode ser reparada por
uma enzima, que remove o grupo metilo para um resíduo de cisteína no seu
centro activo.

40
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Reparação por Excisão


Apesar da reparação directa ser uma forma eficiente de lidar com tipos
particulares de lesões no DNA, a forma mais utilizada é a reparação por
excisão. Esta pode dividir-se em:
- Reparação por excisão de base: uma única base é lesada, é
identificada e removida, sendo depois substituída pela correcta. A excisão do
nucleotídeo é catalisada por enzimas especificas, formando um local AP. As
endonucleases AP clivam as regiões adjacentes ao sitio AP e a falha é
preenchida pela DNA polimerase e pelas DNA ligases.
- Reparação por base de nucleotídeo: as bases lesadas são
removidos como parte de um oligonucleotídeo contendo a lesão. Na E.Coli esta
excisão é catalisada pelo complexo UvrABC, a UvrA idfentifica a lesão e
recruta a UvrB e a UvrC que cliva nas posições 3’e 5’, respectivamente, o local
lesado, excisando um nucleotídeo com 12 ou 13 bases. Este complexo é
geralmente designado por excinucleases. A helicase e a DNA polimerase
completam este processo. Nas células eucariótas existe um modelo básico
para explicar este processo, apesar de este ainda não se encontrar
completamente elucidado. As proteínas XPA identificam a lesão e recrutam as
proteínas XPB e XPD (funcionam como helicases); o complexo XPF/ERCC1 5’
e a proteína XPG 3’, clivam um oligonucleotídeo (com cerca de 30 bases)
contendo a lesão. O restante processo e concluído pela DNA polimerase δ ou ε
juntamente com as proteínas RFC e PCNA.
- Reparação por malpareamento: bases malpareadas durante a
replicação, estes erros são muitas vezes corrigidas pela DNA polimerase.
Existem enzimas que reconhecem na cadeia recém-sintetizada as bases
malpareadas. A reparação é iniciada pela MutS, a qual identifica o
malpareamento e recruta a MutL e a MutH, estas direccionam a remoção do
DNA entre a quebra na cadeia e o malpareamento. O reconhecimento da
cadeia recém-sintetizada é possível devido á existência de quebras nesta.

Mutações nos genes MutS e MutL são responsáveis por uma das
formas cancro do cólon.

Reparação Pós-Replicação

Os mecanismos de reparação referidos anteriormente ocorrem antes da


replicação ser concluída de forma a que esta possa ocorrer de forma correcta.
A replicação é geralmente bloqueada a quando do aparecer de uma
lesão, no entanto esta pode recomeçar logo após a lesão através da síntese de
um fragmento de Okazaki. Este tipo de falhas pode ser reparada por dois
processos:
- Reparação por recombinação: é necessário que uma das cadeias
parentais estivesse integra, originando uma cadeia filha normal. A cadeia
parental pode por recombinação entre sequencias homólogas preencher a
região lesada. A falha localiza-se oposta a uma região integra, podendo ser
preenchida pela DNA polimerase. A outra cadeia apresenta ainda uma lesão,
mas pode ser corrigida por excisão;
- Reparação sujeita a erros: uma falha oposta a uma sitio lesado é
preenchido com DNA recém-sintetizado, este DNA foi sintetizado usando uma

41
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

cadeia lesada como molde, o que pode levar a mutações. É usada apenas em
bactérias e em condições extremas.

Recombinação entre Sequências Homólogas de DNA

É importante a exactidão da replicação e reparação do DNA de modo a


manter a informação genética, no entanto é igualmente importante a
recombinação de forma a que genes sejam rearranjados de diferentes formas,
contribuindo para uma diversidade genética das espécies.

Moléculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras


e Rejunções
Um dos modelos defende que existe uma “escolha de cópia” onde uma
molécula teria como molde uma cadeia parental e que a certo momento essa
molécula molde passaria a ser outra cadeia parental.
Outros modelos dizem-nos que existe uma quebra de uma cadeia
parental que depois se junta com outra igualmente quebrada, diferindo no facto
de não existir síntese de novas cópias.
Após vários estudos conclui-se que o modelo mais aceite seria o da
“quebra e junção”.

Modelos de Recombinação Homóloga


Um dos problemas do modelo de “quebra e junção” era como seria
possível ambas as cadeias serem clivadas no mesmo ponto, de modo a que
não houvesse perdas ou ganhos no ponto de quebra. O alinhamento entre
duas cadeias é conseguido por intermédio de pareamento, estas cadeias
simples de DNA que se sobrepõem são trocadas entre moléculas homólogas,
levando à formação de uma região heteroduplex, onde as duas cadeias da
molécula duplas são oriundas de moléculas parentais diferentes. Caso exista
um mal pareamento nesta região, ele pode ser corrigido pela reparação de
malpareamento.

Após vários estudos reformolou-se este modelo, originando-se o modelo


de Holiday, que é ainda hoje a base dos pensamentos sobre estes
mecanismos. O modelo de Holiday propunha que os cortes eram feitos
posições idênticas das duas moléculas de DNA parental. As cadeias de DNA
cortados sofriam um desenrolamento parcial, e cada uma deles juntava-se à
outra por complementaridade com a cadeia não cortada. Originar-se-ia um
intermediário com cadeias entrecruzadas, conhecido como junção de Holiday.
Para se gerarem moléculas recombinantes é necessário que de seguida
a junção de Holiday seja quebrada e depois haja a rejunção das cadeias
entrecruzadas, o que pode ocorrer de duas formas diferentes: no isómero
resultante da troca inicial de cadeias, as cadeias entrecruzadas são as que
foram clivadas no inicio, no entanto com uma rotação desta estrutura gera-se

42
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

um isómero em que as cadeias cruzadas são aquelas que não foram clivadas.
Cada uma destas formas irá ter consequências genéticas diferentes, na
primeira as moléculas originadas têm região heteroduplex, mas o DNA que a
flanqueia não é recombinante, na segunda resultam moléculas que têm DNA
recombinante flanqueando a região heteroduplex.

A questão de ambas as cadeias serem cortadas no mesmo local foi


resolvida tendo em conta que inicialmente apenas uma cadeia é cortada, esta é
deslocada, permitindo que a outra cadeia simples gerada posso parear por
complementaridade com a outra molécula parental. Este processo produz uma
alça deslocada de DNA , a qual pode ser clivada e reunida com outra molécula
parental, originando-se então a junção de Holiday.

Enzimas Envolvidas na Recombinação Homóloga

São necessárias enzimas especificas além de outras que funcionam em


aspectos múltiplos do metabolismo do DNA. A enzima central no processo de
recombinação homóloga é a RecA, que promove a troca de cadeias entre
DNAs homólogos, levando à formação da região heteroduplex. Na E.Coli a
acção da RecA pode ser dividida em três estágios:
- Liga-se ao DNA de cadeia simples, recobrindo-o e formando um
filamento de DNA com proteína;
- Visto que a RecA tem dois locais de ligação ao DNA, a enzima já ligada
a uma cadeia simples é capaz de se ligar a outra molécula de DNA de cadeia
dupla, formando um complexo entre duas moléculas de DNA;
- Segue-se um pareamento especifico, por complementaridade de
bases, da cadeia simples de DNA com o seu complemento. A enzima catalisa a
troca de cadeias de modo a que a cadeia revestida pela RecA desloca a sua
cadeia homóloga para formar uma região heteroduplex.
Em leveduras, uma das proteínas relacionada com a RecA, a RADS1 é
necessária para a recombinação e para a reparação de quebras duplas de
DNA. Proteínas relacionadas com a RADS1 foram encontradas em eucariótas
complexos, como é o caso do humano.

No entanto existem ainda o complexo RecBCD que é responsável por


fornecer à RecA a cadeia simples à qual esta se liga. Quando o complexo
RecBCD encontra um sitio chi , actua como um nuclease e cliva uma das duas
cadeias de DNA, de seguida desenrola a dupla hélice, permitindo que a RecA
se ligue à cadeia simples.
Após a acção do complexo RecBCD e da enzima RecA forma-se a
junção de Holiday, sobre a qual irão actuar três enzimas (RuvA, B e C). RuvA
e B actuam como um complexo que direcciona a migração do sitio da junção
de Holiday na qual as cadeias se entrecruzam. Por sua vez RuvC actua
clivando as cadeias entrecruzadas, após a junção das cadeias clivadas são
geradas duas moléculas “recombinantes”.
Em leveduras RAD1 e RAD10 desempenham estas funções, enquanto
que em humanos são as proteínas XPF e ERCC1 catalisam o processo, como
de igual modo contribuem para a reparação do DNA.

43
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Rearranjos do DNA
A recombinação homóloga produz rearranjos entre cromossomas
homólogos (crossing-over), no entanto não altera a disposição dos genes ao
longo do genoma. Outro tipo de recombinações levam a rearranjos do DNA
genómico, estes são importantes para a regulação génica ou têm um papel
importante na evolução e contribuem para a biodiversidade.

Recombinação Sítio-Especifica
Em contraste com a recombinação homóloga, que ocorre em qualquer
região com ampla homologia entre as sequências, a recombinação sítio-
especifica ocorre entre sequências especificas do DNA, normalmente
homólogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interacção é
mediada por proteínas e não por complementaridade de bases. É exemplo
desta recombinação sítio-especifica a integração e remoção do DNA viral a
quando a infecção da E.Coli pelo bacteriófago γ.
Esta recombinação é ainda importante para os rearranjos programados
que ocorrem nos genomas celulares, como é o caso do desenvolvimento do
sistema imune. Os anticorpos são resultado da recombinação sítio-especifica
entre os genes para as imunoglobulinas e os receptores de células T, o que
lhes permite identificar um grande número de antigénios.

RAG 1 e RAG 2 estão envolvidos em processos de clivagem e


junção na recombinação sítio-especifica para a formação de anticorpos.

Transposição Através de Intermediários de DNA


A transposição envolve o movimento de sequências através do genoma
e não requer homologia entre estas. Os elementos transponíveis ou
transposões são aqueles que se movem através de transposição e podem ser
de dois tipos: através de intermediários de DNA ou de RNA.

Os transposões mais simples são as sequencias de inserção que


consistem em um gene para a enzima envolvida na transposição (a
transposase), flanqueado por curtas sequências repetias e invertidas, que
correspondem aos locais onde age a transposase.
Os mais complexos são compostos por duas sequências de inserção
flanqueados por outros genes, movendo-se como uma unidade.

As sequências de inserção movem-se de uma localização cromossomal


a outra sem replicar o seu DNA, a transposase introduz uma quebra
assimétrica na molécula alvo de DNA e cliva nas extremidades das repetições
invertidas do transposão. Após clivar a transposase junta as extremidades do
DNA alvo com o elemento transponível. A falha resultante no sitio alvo do DNA
é reparado pela síntese de DNA, seguido de ligação à outra ligação do
transposão. De ambos os lados do elemento transponível ficam como marca
uma curta sequência repetitiva.

44
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

O mecanismo referido faz com que o transposão se mova de sitio um


cromossomal a outro, no entanto existem outro tipo de transposões que se
movem através de mecanismos mais complexos, havendo uma replicação do
transposão em combinação com a sua integração, ficando uma cópia no sítio
original e outra na nova localização.

Transposição Através de Intermediários de RNA

Muitos transposões em células eucariótas movem-se em intermediários


de RNA em vez de DNA, o seu mecanismo de transposição é similar á
replicação dos retrovírus.
LTRs – sequências repetidas em várias centenas de nucleotídeos em
ambas as extremidades do DNA viral.
Retrotransposões classe I são idênticos a retrovírus e possuem LTRs,
enquanto que retrotransposões classe II não possuem LTRs. Nos mamíferos
a principal classe desses retrotransposões consiste em elementos longos
dispersos altamente repetitivos – LINEs.

Outros elementos que não codificam as suas próprias transcriptases


reversas e que também transpõem através de RNA são os elementos
repetitivos dispersos curtos – SINEs. Estes não codificam proteínas, logo
representam pseudogenes que surgem através de transposição mediado por
RNA. Os pseudogenes processados correspondem a pseudogenes que
surgiram, similarmente, por transcrição reversa de pequenos mRNAs.

Amplificação Génica

Os rearranjos até agora discutidos alteram a posição de uma dada


sequencia de DNA dentro do genoma, a amplificação génica modifica a
estrutura do genoma, gerando cópias múltiplas de uma região. As sequências
amplificadas do DNA podem ser encontradas como moléculas
extracromossomais ou como séries repetidas no cromossoma, ambas
contribuem para uma maior expressão do gene amplificado.
A amplificação genica pode ser benéfica ou prejudicial para a célula,
como é o caso de uma amplificação dos genes que codificam o ribossoma no
oócito de modo a que posso existir uma resposta à necessidade de produzir
grandes quantidades de proteína, mas por outro lado pode ocorrer como um
evento anormal em célula cancerosas provocando um aumento da expressão
genica que leva a uma intensa e descontrolada divisão celular.

45
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Seis
Transcrição em Procariótas
Os mecanismos de transcrição foram estudados na E.Coli, tal como os
mecanismos de regulação da mesma, que permitem à célula responder a
variações no meio ambiente.

A RNA Polimerase e a Transcrição


A RNA polimerase catalisa a síntese de RNA a partir de um molde de
DNA, esta age de forma idêntica à DNA polimerase, sintetizando apenas no
sentido 5’  3’, mas não necessita de primers para iniciar a síntese.
A RNA polimerase inicia o processo num local especifico, que
representa o primeiro ponto onde a transcrição pode ser regulada.

A RNA polimerase é constituída por múltiplas cadeias polipeptídicas,


formando as subunidades α, β, β’ e σ, sendo que as três primeiras catalisam
a síntese de RNA e a última reconhece os sítios específicos onde se liga o
complexo.

A sequência que marca o inicio da transcrição é chamada de promotor,


sendo o primeiro nucleotídeo transcrito denominado de nucleótido +1, e a
subunidade σ liga-se na região -35 e -10. Na ausência desta subunidade a
enzima liga-se com baixa afinidade e inespecificamente.

A polimerase à medida que vai avançando desenrola a dupla hélice do


DNA e ao fim de 10 nucleótidos a subunidade σ desprende-se e a polimerase
continua o alongamento da cadeia de RNA. Tal como desenrola a dupla hélice
à medida que vai avançando enrola o que fica para trás, deixando uma região
de cerca de 17 pb desenroladas.

A RNA polimerase prossegue até encontrar um sinal que lhe indique


para terminar, que pode ser uma região repetida e invertida, rica em GC,
seguida de quatro ou mais resíduos de A. A transcrição desta região forma
uma estrutura estável semelhante a um “loop” que rompe a associação entre a
RNA polimerase e o seu molde de DNA. Existem outro tipo de sinais que
consistem na ligação de proteínas em sequencias especificas do DNA que
terminam a transcrição.

Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrição

Estudos pioneiros na E.Coli demonstraram que o gene que expressa a


β-galactosidade, que cliva a lactose, apenas é transcrito quando os níveis de
lactose se encontram elevados, o que permite à célula na ausência de lactose
economizar energia.
Os genes que codificam a β-galactosidade, a permease e a
transacetilase são expressão como uma unidade, denominada de operão e a

46
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

sua transcrição é controlada pelo operador (o) que está adjacente ao sítio de
inicio da transcrição. O gene regulador codifica uma proteína que regula a
transcrição ligando-se ao operador. O produto normal do gene é um repressor
que bloqueia a transcrição quando ligado ao operador (o), por exemplo a
lactose liga-se ao repressor inibidor e impedindo que este se ligue ao operador
e a transcrição posso ocorrer. O operador é chamado de elemento de controlo
em cis, porque apenas afecta a expressão de genes ligados fisicamente na
mesma molécula de DNA, enquanto que o repressor apelidado de elemento de
controlo com actuação em trans afecta a transcrição de genes em outros
cromossomas.

Controlo Positivo da Transcrição

O exemplo mais bem estudado de controlo positivo em E.Coli é o efeito


da glicose na expressão de genes ligados à quebra de outros açucares.
Quando existe glicose, que é preferencialmente usada, os genes que codificam
as enzimas envolvidas no catabolismo de outros açucares não são expressos,
ou seja, a glicose reprime o operão lac m na presença do seu indutor lactose.
A repressão pela glicose é mediada por um sistema positivo de controlo,
que está dependente dos níveis de cAMP. A enzima que converte em ATP em
cAMP é activado quando os níveis de glicose estão baixos, o cAMP liga-se a
uma proteína reguladora da transcrição, a CAP, que por sua vez se liga à sua
sequencia alvo (localizado antes do inicio do operão) e faz com que a
subunidade σ da RNA polimerase se liga mais facilmente ao promotor.

Atenuação da Transcrição

Os mecanismos atrás referidos interagem, activando ou bloqueando, no


inicio da transcrição, no entanto a atenuação da transcrição age impedindo o
alongamento a partir de determinados sítios, que não são mais do que
sequências especificas.

As RNA Polimerases Eucariótas e os Factores Gerais de


Transcrição

Apesar de a transcrição ocorrer de forma idêntica em quase todas as


células, ela é mais complexa em células eucariótas, e tem duas grandes
diferenças:
- Os eucariótas possuem múltiplas RNA polimerases que transcrevem
genes distintos;
- Em vez de se ligarem directamente ao promotor, as RNA polimerases
eucarióticas interagem com uma variedade de proteínas adicionais de modo a
serem mais especificas.

As RNA Polimerases Eucariótas

47
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

As células eucarioticas contêm três RNA polimerases nucleares


distintas:
- RNA polimerase II, transcreve os genes que correspondem a
proteínas;
- RNA polimerase I e III, transcreve os RNAs ribossomais e de
transferência.
Alguns pequenos RNAs, como os envolvidos no splicing e transporte de
proteínas, são transcritos pela RNA polimerase III.
As duas maiores subunidades da RNA polimerase eucarióta estão
relacionadas com a β e a β’ das
procariótas, e existem cinco subunidades
que são comuns às três, o que faz com
tenham um funcionamento muito similar
entre si. Existem ainda RNA polimerases,
idênticas às das bactérias, nos cloroplastos
e mitocôndrias que transcrevem o seu
DNA.

Os Factores Gerais da
Transcrição e a Iniciação da
Transcrição pela RNA Polimerase
II
A RNA polimerase II apenas é capaz
de iniciar a transcrição se as proteínas
adicionais foram adicionas à reacção, estas
proteínas designam-se por factores de
transcrição. Existem dois tipos de factores
de transcrição: os estão envolvidos na
transcrição de todos os promotores de RNA
polimerase II e os factores de transcrição
adicionais, que se ligam às sequencias de
DNA que controlam a expressão dos genes
individuais e são, portanto, responsáveis
pela regulação da expressão génica.
Antes do local de inicio de
transcrição existe uma sequencia, a TATA
box, á qual se vai ligar um factor geral de
transcrição, o TFIIF, sendo composto por
várias subunidades. Uma dessas
subunidades é a proteína de ligação a
TATA, que se liga a TATA box e aos
factores associados da TBP, os últimos
ligam-se a outro factor geral de transcrição,
o TFIIB. É o complexo TBP-TFIIB que
recruta a RNA polimerase II e promove a
sua ligação ao promotor.
Para que se inicie a transcrição é
necessária a ligação de dois factores

48
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

adicionais, o TFIIE e o TFIIH. O TFIIH tem duas subunidades, uma com função
de helicase e outra que fosforila sequencia repetitivas permitindo a quebra de
ligação com o complexo de iniciação e que a RNA polimerase prossiga.

Além da TATA box, os promotores de vários genes que são transcritos


pela RNA polimerase II contêm uma sequência que cobre o sitio de inicio da
transcrição, a Inr; no entanto alguns genes apenas possuem a Inr e não
possuem a TATA box.

A Transcrição pelas RNA Polimerase I e III

As RNA polimerases I e III são responsáveis pela transcrição de rRNAs


e tRNAs, e precisam igualmente de factores de transcrição adicionais.
A RNA polimerase I é responsável pela transcrição do rRNA e existem
dois factores, o UBF e o SL1, que reconhecem a sequencia promotora e
formam o complexo de iniciação.
Na RNA polimerase III, o promotor encontra-se no meio da sequencia a
transcrever, a transcrição inicia-se com a ligação sequencial de TFIIC, TFIIB e
da RNA polimerase III.
Todas as RNA polimerases referidas precisam da interacção do factor
adicional TBP, que permite a ligação do complexo de iniciação à sequencia
sinal.

Regulação da Transcrição em Eucariótas


Embora a regulação seja muito complexa, em eucariótas e procariótas
os mesmos princípios são aplicáveis. Em eucariótas a expressão é controlada
em termos de iniciação da transcrição, em alguns casos pode se atenuada e
regulada em etapas posteriores.

Este controlo é desempenhado primariamente pelas acções combinadas


de múltiplas proteínas transcricionais regulatórias diferentes, mas o
empacotamento do DNA na cromatina e a sua modificação por metilação
acrescentam um nível ainda maior de complexidade ao controlo da expressão
génica eucarióta.

Sequências Regulatórias com Actuação em Cis:


Promotores e Enhancers

Também nos eucariótas a expressão de determinados genes é


controlada pela ligação de proteínas à sequência com actuação em cis, que
são adjacente ao gene que controlam, e geralmente antecedem a sequência
TATA box e Inr. A estas sequências com actuação em cis ligam-se factores
gerais de transcrição que permitem a regulação da expressão de genes
individuais.

49
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Existem sequências regulatórias localizadas mais longe do local de inicio


da transcrição, que funcionam pela ligação de factores transcricionais que
regulam a RNA polimerase, cuja actuação é possível devido à formação de
alças no DNA; estes factores designam-se por Enhancers, e o seu
funcionamento é igual ao dos factores de controlo da transcrição adjacentes ao
promotor. Um aspecto importante dos Enhancers é que eles usualmente
contêm sequências funcionais múltiplas que ligam diferentes proteínas
regulatórias transcricionais.

Proteínas Regulatórias Transcricionais


O isolamento de proteínas regulatórias transcricionais foi baseado na
habilidade destas se ligarem especificamente em sequências de promotores ou
Enhancers. A ligação de proteínas a determinadas sequências é geralmente
analisada por dois processos: footprinting e ensaio de alteração de mobilidade
electroforética.

Footprinting – uma amostra de DNA contendo fragmentos


radioactivamente marcados em uma das extremidades é dividida em duas,
sendo uma delas incubada com a proteína que se liga a uma sequencia
especifica. Ambas são digeridas com DNase, sendo que esta cliva uma vez por
molécula em média e tendo em conta que a região onde se liga a proteína se
encontra protegida, não sendo clivada. Os complexos de DNA-Proteína são
desnaturados e aos fragmentos analisados por electroforese. Na amostra
incubada com a proteína, os fragmentos correspondentes a essa sequencia
estão ausentes.

Ensaio de alteração de mobilidade electroforética – uma amostra


contendo fragmentos de DNA é tratada como no processo anterior, no entanto
não é feita a desnaturação do complexo DNA-Proteína, mantendo-se este
complexo que migra mais lentamente quando analisado por electroforese.

Estrutura e Função dos Activadores Transcricionais

Os factores de transcrição são centrais para a regulação da expressão


génica, os mais bem estudados são os activadores transcricionais.
Geralmente estes activadores, que são proteínas, possuem dois domínios: um
que se liga especificamente a uma sequencia de DNA e outro que activa a
transcrição por interacção e recrutamento de outros factores e da maquinaria
de transcrição. Existem domínios, chamados em dedo de zinco, que se ligam
ao DNA, dos quais se destacam os receptores para as hormonas, que regulam
50
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

a transcrição génica em resposta a hormonas. Outros exemplos de domínios


de ligação ao DNA são o modelo hélice-volta-hélice, o ziper leucina e a hélice-
alça-hélice.

Repressores Eucariótas
A expressão génica é tanto regulado por activadores como por
repressores, que equivale aos inibidores procariótas, inibindo a transcrição.
Alguns repressores intreferem com a ligação de outros factores de transcrição,
outros competem com activadores (alguns apenas diferem deste por não
possuírem o domínio que recruta outros complexos) pela ligação com a
sequência regulatória; existem ainda os repressores activos que inibem a
transcrição através de interacção proteína-proteína, sendo criticas na regulação
do crescimento e diferenciação celular.

Relação entre Estrutura da Cromatina e a Transcrição


O DNA no núcleo encontra-se
empacotado em cromatina, o que tem
consequências importantes em termos
da sua disponibilidade como molde
para a transcrição. Activadores e
Repressores interagem não só com os
factores transcricionais e maquinaria
de transcrição, mas também através
da indução de mudanças de estrutura
da cromatina. Estes facto é confirmado
pelo descondensar das regiões que
são activamente transcritas.

No entanto o descondensar da
cromatina não é suficiente para que os genes possam ser transcritos, pois o
DNA continua ligado às histonas. Existem então proteínas adicionais,
designadas factores de remodelamento dos nucleossomas, que facilitam a
ligação de factores transcricionais à cromatina por alteração da estrutura dos
nucleossomas.

Outro dos processos é a acetilação que reduz a carga liquida positiva


das histonas e diminui a sua afinidade com o DNA, permitindo um mais fácil
acesso ao DNA por parte das proteínas de regulação da transcrição. No
entanto é importante que para a RNA polimerase a compactação do DNA seja
um obstáculo mais facilmente ultrapassado, do que para a DNA polimerase,
mas que é igualmente auxiliado pela acetilação e pela interacção de proteínas
cromossomais não-histónicas.

Metilação do DNA
A metilação é outro mecanismo geral pelo qual o controlo da transcrição
em vertebrados está ligado à estrutura da cromatina. O DNA é especificamente
metilado nos Cs que precedem Gs na cadeia (dinucleotídeos CpG), o que está
51
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

relacionado com uma reduzida actividade transcricional nos genes que contêm
alta frequência de CpG na vizinhança, pois uma proteínas especifica liga-se ao
DNA metilado e inibe a transcrição.
Apesar do seu baixo significado em termos de regulação génica, a
metilação do DNA, no caso da marcação genómica parece adquirir uma
extrema importância. Em muitas células ambos os alelos de uma gene são
transcritos, mas há alguns poucos genes marcados cuja expressão depende se
foram herdados da mãe ou do pai. Apesar do papel da metilação do DNA na
marcação ser incerto, parece distinguir entre os alelos maternos e paternos de
genes marcados.

Processamento e Reciclagem de RNA

Embora a transcrição seja o primeiro, e mais altamente regulado, passo


na expressão génica, é preciso uma série de processos para se produzir um
RNA funcional e maduro.

Os mRNAs bacterianos são uma excepção, pois desde, pois nas células
eucariótas desde os rRNAs, aos tRNAs que sofrem processos de alteração
para serem funcionais; o caso especial do mRNA que sofre diversos
processos, como o splicing, até poder servir de molde para a síntese de
proteínas.

A regulação de todas as etapas brevemente referidas em cima gera um


elevado controlo sobre a expressão génica.

Processamento do rRNA e do tRNA

Todos os RNAs ribossomais e de transferência, á excepção do RNA 5S


eucariótico que é transcrito de um gene separado, provêm de um mesmo pré-
RNA. Este pré-RNA é então processado através de sucessivas clivagens e
adição de grupos metilo nas bases e açucares de nucleotídeos específicos.
Sabe-se que o pré-tRNA é clivado na sua extremidade 5’ pela RNase P.
Na extremidade 3’ a RNase é uma convencional e existe a adição de uma
sequência CCA, que corresponde ao local de ligação do aminoácido.
Alguns pré-tRNAs, e poucos pré-rRNAs, sofrem splicing, havendo
remoção de intrões, e possibilidade de splicing alternativo.

Processamento do mRNA em Eucariótas

O processamento do mRNA tem uma maior distinção entre eucariótas e


procariótas. Nos procariótas após a transcrição o mRNA encontra-se pronto
para ser traduzido, enquanto nos eucariótas o pré-mRNA surge após a
transcrição e é extensamente modificado antes de ser transportado para o
citoplasma e ser traduzido.

O processamento do pré-mRNA dá-se através de modificações em


ambas as extremidades e através da remoção de intrões.

52
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A extremidade 5’ é modificada imediatamente após a síntese pela


adição de uma estrutura chamada de cap 7-metilguanosina. A colocação da
cap é iniciada pela adição de GTP, em orientação inverso, no nucleotídeo 5’
terminal, e de seguida são adicionados grupos metilo a este resíduo de G e às
riboses de um ou dois nucleotídeos da extremidade 5’ da cadeia de pré-mRNA.

A extremidade 3’ de muitos dos mRNAs não é determinada pelo fim da


transcrição, mas sim pela clivagem do transcrito primário e adição de uma
cauda poli-A, numa reação de processamente chamada de poliadenilação.
Esta reacção permite uma maior estabilidade da molécula.

No entanto a modificação mais


marcante do pré-mRNA é a remoção de
intrões pelo mecanismo de splicing.

Mecanismo de splicing
O splicing do pré-mRNA ocorre em duas
fases: primeiro o pré-mRNA é clivado no sitio
5’ de splicing, sendo a extremidade 5’ do intrão
unida a um nucleotídeo de adenina dentro do
intrão; forma-se uma estrutura em laço; de
seguida ocorre em simultâneo a clivagem do
sitio 3’ de splicing e a ligação dos dois exões.

Existem três sequências criticas no pré-


mRNA que estão relacionadas com o splicing:
- Sítio 5’ de Splicing;
- Sítio 3’ de Splicing;
- Ponto de Ramificação.

O splicing ocorre em grandes


complexos denominados spliceossomas,
compostos várias subunidades, que por sua
vez são complexos de proteínas e RNA. Os
RNA que constituem o spliceossoma são
pequenos RNAs nucleares (snRNA)
chamados de U1, U2, U4, U5 e U6; estes
associam-se a pequenas proteínas e formam
particulas de ribonucleoproteinas (snRNPs)
que desempenham um papel central no
splicing. Cada snRNP contem apenas uma
molécula de snRNA, à excepção dos snRNAs
U4 e U6 que estão associados na mesma
snRNP.

A primeira etapa do mecanismo de


splicing é a ligação do complexo U1 ao sítio 5’
de splicing (SS 5’), o seu reconhecimento é feito através de
complementaridade de bases.

53
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

De seguida o complexo U2 liga-se ao ponto de ramificação.


Os complexos U4/U6 e U5 são incorporados no spliceossoma,
dissociando-se U4 e U6, e sendo U1 deslocado do SS 5’.
Será o complexo U5 que irá reconhecer a sequência do SS 3’, havendo
de seguida uma simultaneidade de acontecimentos.
Assim sendo, o complexo U1 e U4 dissociam-se do spliceossoma, sendo
o SS 5’ clivado, a extremidade 5’ do intrão unida ao ponto de ramificação,
formando-se um laço.
Após a formação de uma estrutura em forma de laço, ocorre a clivagem
do SS 3’, e a união dos exões. Estando assim o processo de splicing concluído.

Visto que a complementaridade entre as sequências dos snRNAs e os


SS, ou do ponto de ramificação, não é completa, o que resulta numa baixa
afinidade, existem proteínas auxiliares de splicing. Estas proteínas ligam-se
a sequências perto dos locais SS e recrutam as subunidades do spliceossoma,
o que permite uma regulação do splicing, pois existem proteínas que inibem ou
estimulam a ligação a estes locais. O papel central do splicing no
processamento do mRNA possibilita um controlo da expressão génica
adicional, por acção destas proteínas.
A existência destas proteínas veio ainda abrir caminho para o splicing
alternativo, de que iremos tratar de seguida.

Existem alguns RNA com capacidade de catalisar a sua própria reacção


de splicing, que neste caso se denomina auto-splicing. É importante salientar
ainda que os snRNA por si só possuem a capacidade de catalisar a reacção de
splicing, no entanto de modo a torná-la mais eficiente existe a associação de
proteínas a estes.

Splicing Alternativo

O pré-mRNA contem múltiplos intrões, o que permite através de diversas


combinações entre eles, de um pré-mRNA originar distintas proteínas. É
importante referir que a ordem dos exões nunca é alterada, sendo as
combinações possíveis apenas aquelas que são criadas pela inclusão total ou
parcial de determinados exões.

Existem então as proteínas acessórias de splicing que irão permitir estas


diversas combinações entre os vários exões. Tanto podemos ter uma proteína
que estimule a ligação do spliceossoma ao SS ou uma que o iniba, sendo
assim iremos ter diferentes padrões de splicing. É da competição destas duas
proteínas que irá surgir um determinado padrão, pois se estiver a proteína
indutora em excesso, o intrões poderá ser removido, se esta estiver em menor
quantidade, muito possivelmente este será incluído total ou parcialmente. Estas
proteínas ligam-se a sequências e recrutam geralmente a subunidade U1, pois
é esta que inicia o mecanismo de splicing, sendo a junção das outras um
mecanismo em cascata. No entanto existem outros que estimulam a ligação
das outras subunidades em outros locais, o que permite assim que o inicio do
intrão se mantenha, no entanto este pode terminar precocemente, ou ser
alongado.

54
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

O splicing tem um papel preponderante na maneira como é regulada a


expressão específica de determinadas proteínas consoante o tecido em
questão, sendo que em células diferentes existem mecanismos de splicing com
padrões diferentes.

A existência de mecanismos de splicing alternativo permitiu originar


solução para a existência de tão poucos genes comparativamente com o
número de proteínas existentes no nosso organismo.

Edição do RNA

A edição do RNA consiste num processo de processamento diferente


do splicing, comum em mRNA mitocôndrial, mRNA de cloroplastos e alguns
mRNAs nucleares.
É um mecanismo onde existe a mudança de uma base simples, como é
exemplo a desanimação da citosina em uridina. Este fenómenos, ou um de
substituição, podem originar proteínas com sequencias diferentes, ou um
codão de STOP prematuro, o que irá originar proteínas diferentes com funções
e estrutura que podem ser idênticas, ou diferentes. É exemplo deste
mecanismo a edição do mRNA que codifica uma Apo proteína, que no fígado e
expressa por um determinado mRNA, e que nas outras células por edição do
RNA surge um codão de STOP prematuro, que origina uma proteína truncada,
mas que é funcional e mais especifica para a célula onde se encontra.

55
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Degradação de RNA
A nível celular a quantidade de RNA é mantida através de equilíbrio
entre a sua síntese e degradação.

Os RNAs ribosomais e de transferência são bastante estáveis e por isso


encontram-se em grande quantidade, em contraste com os mRNAs que são
rapidamente degradados, o que permite à célula responder rapidamente às
mudanças no ambiente, podendo sintetizar novos mRNAs que sejam
necessários.
A degradação dos mRNAs é iniciada pelo encurtamento da caude de
poli-A, segue-se a remoção do cap 5’ e posterior degradação do restante RNA
por nucleases.
A estabilidade de alguns mRNAs pode ser determinada por factores
exteriores de modo a que a célula pode responder ás necessidades consoante
o meio extracelular.

56
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Sete (pág. 297 – 325)


Tradução do mRNA
Todos os mRNAs são lidos de 5´ 3’ e as cadeias polipeptídicas são
sintetizadas da extremidade amina para o carboxilo terminal, sendo cada
aminoácido especificado por três bases, tripleto (codão), no mRNA.
A tradução é realizada nos ribossomas, com os tRNAs servindo de
adaptadores entre o molde de RNA e os aminoácidos. No entanto a síntese de
uma proteína envolve a interacção de muitas outras proteínas.

RNAs de Transporte

Os tRNAs possuem aproximadamente 70 a 80 nucleotídeos e têm uma


estrutura de trevo devido ao pareamento de bases complementares em
diferentes regiões da molécula.

Os tRNAs têm duas regiões distintas, uma sequencia CCA na


extremidade 3’, onde os aminoácidos se liga covalentemente à ribose do A
terminal, e uma sequência de 3 bases, que irá reconhecer o condão, localizada
na alça, sendo chamada de anticodão.

A ligação entre o aminoácido e o tRNA é catalisada por um conjunto de


enzimas designadas tRNA aminoacil sintetases. Em caso de existir um
aminoácido incorrectamente ligado, existe uma revisão, que hidrolisa em vez
de serem ligados definitivamente no segundo passo deste reacção; este
processo torna o reconhecimento do aminoácido altamente fiável.

Os aminoácidos são alinhados no molde através da complementaridade


entre o codão e o anticodão, no entanto existem tRNAs capazes de reconhecer
mais do que um codão, através de um pareamento atípico entre o anticodão e
a terceira posição de alguns codãos complementares.

O Ribossoma

Tantos os ribossomas eucariótas, como os procariótas, são compostos


por duas subunidades, uma subunidade grande e outra pequena, que por sua
vez são constituídas por proteínas características e RNAs ribossomais
(rRNAs). Os ribossomas eucariótas e procariótas são similares no seu
funcionamento, a sua grande diferença reside no seu tamanho.

Uma das características a destacar é que estes podem ser formados in


vitro espontaneamente da junção do seu RNA com os constituintes proteicos.
Através de sucessivas experiencias, que consistiam na omissão sucessiva de
proteínas que constituem o ribossoma, constatou-se que apenas havia um
decréscimo da actividade do ribossoma; conclui-se então que a reacção é
catalisada pelos rRNAs e que as proteínas facilitam o dobramento do rRNA e
posicionam-no correctamente.

57
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A Organização de mRNAs e Inicio da Tradução


Embora os mecanismos de síntese proteica sejam idênticos em
eucariótas e procariótas, estes diferem principalmente nos sinais que
determinam as posições onde se inicia a tradução.

A tradução não se inicia na extremidade 5’, como era de esperar,


existem sítios específicos de iniciação, pois na extremidade 5’ temos a região
5’ não-traduzida (5’ UTR), que existe igualmente na extremidade 3’ (3’ UTR). O
codão que indica a iniciação é o AUG, que codifica uma metionina, que nos
procariótas é modificada.

Nos procariótas a sequencial sinal, que determina a ligação do


ribossoma ao mRNA, é a sequencia de Shine-Delgarno, enquanto que nos
eucariótas o ribossoma se liga ao cap 7-metilguanosina da extremidade 5’.

O Processo de Tradução
A tradução é geralmente dividida em três etapas: iniciação, alongamento
e terminação.

Um iniciador específico de tRNA metionil e o mRNA ligam-se à


subunidade ribossomal pequena. A subunidade grande liga-se ao complexo e o
alongamento prossegue.

A iniciação em eucariótas é mais complexa do que em procariótas e


requer no mínimo dez proteínas que são designadas de IFs. Os factores de
iniciação eucariótas reconhecem tanto a extremidade 5’, como a extremidade
3’.
O alongamento é similar tanto em eucariótas, como em procariótas,
tendo o ribossoma 3 sítios para ligação do tRNA, o sitio iniciador (P), segue-se
o sitio A e o sitio E, este ultimo antecede o P. O alongamento continua até que
um codão STOP seja translocado no sitio A do ribossoma, as células não
possuem anticodões complementares para estes codões, tê, antes factores de
libertação que terminam a tradução.

Os mRNAs podem ser traduzidos por vários ribossomas, assim que um


abandona o sitio de iniciação outro pode-se ligar e iniciar a tradução.

Nota: Existe na célula mecanismos que controlam a transcrição de


forma a que, no caso de existir um codão STPO precoce devido a uma
mutação, o mRNA que se forma é degradado. É este fenómeno que
explica que muitas das vezes não são originados proteínas, nem
detectados mRNAs, de genes mutados. Este mecanismo é apenas eficaz
de o codão de STOP for originado no inicio da sequencia, pois os que se
localizam no final são mais dificilmente detectados e dão geralmente
origem a uma proteína truncada.

58
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A Regulação da Tradução
Um dos mecanismos de regulação é a ligação de proteínas repressoras,
que bloqueiam a tradução, em sequências específicas do mRNA. Outro
mecanismo envolve a modulação da actividade dos factores de iniciação,
particularmente o IF-2, no entanto este processo tem efeitos globais na
actividade de tradução, em vez de ser especifico. Contrariamente a estes
processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar á extremidade
5’ dos mRNAs e age como uma proteína reguladora da tradução, estimulando
o inicio da tradução, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma.

Dobramento e Processamento Proteicos

A tradução completa o fluxo de informação genética entro da célula, no


entanto temos agora uma sequencia de aminoácidos que não corresponde a
uma proteína funcional. Para que uma proteína seja funcional a cadeia de
aminoácidos vai-se dobrar sobre si mesmo e adquirir uma conformação
tridimensional, e possivelmente associar-se a outros polipeptídeos formando
complexos funcionais.

Muitas proteínas sofrem ainda outras modificações pós-traducionais,


como a clivagem, ligações covalente a lípidos e glícidos, que vão determinar a
sua função e localização correcta dentro da célula.

Chaperonas e Dobramento Proteico


Toda a informação necessária para uma proteína adaptar a conformação
tridimensional correcta é fornecida pela sua sequência de aminoácidos. No
entanto existem proteínas que facilitam esse dobramento, denominadas de
chaperonas, que apenas catalisam o dobramento de cadeias, pois a forma
como este é feito é determinado unicamente pela sequência de aminoácidos.
Na ausência de chaperonas cadeias polipeptídicas dobradas ou não dobradas
seriam instáveis, dobrando-se incorrectamente ou agregando-se em complexos
insolúveis.

Existem proteínas que funcionam como chaperonas, mas que


inicialmente foram designadas como proteínas de choque térmico, pois
encontram-se em organismos que vivem em condições extremas. Estas
proteínas, da classe das chaperonas, evitam que em meios extremos de acidez
ou basicidade, altas temperaturas e presença de outros factores desnaturantes,
as proteínas destes organismos desnaturem, podendo assim realizar as suas
funções normais.

Enzimas e Dobramento Proteico

A formação de ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteínas é


importante na estabilização de estruturas dobradas de muitas proteínas, a
proteína dissulfeto isomerase catalisa a quebra e a formação destas ligações.

59
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

As ligações dissulfeto são restritas a proteínas destinadas a serem segregadas


ou incorporadas na membrana, porque o citosol contem agentes redutores que
mantêm a cisteína na sua forma reduzida, impedindo que se formem pontes
dissulfeto.

A peptidil prolil isomerase, que catalisa a isomerização entre as formas


cis e trans nas ligações que precedem resíduos de prolina, que de outra forma
dificilmente permitiriam a criação de alteração na conformação desta ligação,
que pode ser fundamental para uma correcta conformação tridimensional e
função da proteína.

Clivagem Proteica

A clivagem proteica da cadeia polipeptídica, designada de proteólise, é


um passo importante na maturação de muitas proteínas. São frequentemente
adicionadas sequências sinalizadoras, que marcam o destino da proteína, é
pois preciso clivar essa sequência para que a proteína se torne madura, é
exemplo a peptidase sinalizadora.

É interessante notar que muitas proteínas de vírus tal como hormonas


humanas, derivam da clivagem de precursores maiores. É exemplo a insulina,
que é sintetizada contendo uma única cadeia, tendo uma sequência sinal.
Inicialmente é clivada essa sequência sinal, a restante cadeia estabelece as
ligações que irão dar origem a sua conformação tridimensional e no sim esta
cadeia é cliva em dois pontos, sendo retirado um segmento intermédio,
originando dois domínios diferentes. A presença daquele segmento não é para
a função da proteína, mas sim para a sua correcta conformação, permitindo
que as ligações se formem entre os resíduos de aminoácidos correctos.

Glicolização

Muitas proteínas são modificadas por adição de glícidos, num processo


denominado de glicolização, e passam a designar-se glicoproteinas. As
porções de glícidos desempenham um papel importante no dobramento no
reticulo endoplasmático, na marcação de proteínas e como sítios de
reconhecimento nas interacções célula-célula.
As glicoproteinas são geralmente segregagas ou incorporadas na
membrana, e o processo de glicolização ocorre no reticulo endoplasmático,
geralmente, durante a tradução.

Existe a N ou O glicolização, dependendo do local onde está ligado o


glícido, e isso faz com que difira o local onde é realizada a glicolização, este
tema será abordado mais afrente.

Ligação de Lípidos
Algumas proteínas são modificadas pela ligação de lípidos à cadeia
polipeptídicas, que geralmente marcam e ancoram essas proteínas á
membrana plasmática.

60
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Existem três tipos gerias de adição de lípidos: N-miristoilação, prenilação


e palmitoilação. Um quarto tipo, a adição de glicolipidos, tem um papel
importante no ancoramento de algumas proteínas na face extracelular da
membrana.
Em baixo iremos descrever brevemente os quatro tipos de ligação de
lípidos referenciados anteriormente:
- N-miristoilação – um ácido gordo é ligado à amina terminal dos
resíduos da cadeia polipeptídica em formação, durante a tradução;
- Prenilação – consiste na ligação de lípidos ás cadeias laterais dos
resíduos de cisteína, serina e treinuna; são lípidos específicos (grupos prenil)
que são ligados ao enxofre da cadeia lateral destes resíduos de aminoácidos;
- Palmitoilação – o ácido palmítico é adicionada ao átomo de enxofre
nas cadeias laterais de resíduos internos de cisteína;
- Os glicolípidos são ligados ao carbono do grupo carboxilo terminal de
algumas proteínas.

61
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Nove
O primeiro passa para a distribuição das proteínas ocorre ainda durante
a tradução, visto que várias proteínas com destino ao reticulo endoplasmático,
ao complexo de Golgi, à membrana ou aos lisossomas são traduzidas em
ribossomas associados ao reticulo endoplasmático, dentro ocorre o seu
processamento.

Retículo Endoplasmático

O retículo endoplasmático (RE) é uma rede de túbulos envolvidos por


uma membrana e vesículas que se estendem desde o membrana nuclear por
todo o citoplasma.

Existem dois tipos de RE, estando cada um envolvido em funções


diferentes:
- Retículo Endoplasmático Rugoso, possui ribossomas associados e
funciona no processamento das proteínas;
- Retículo Endoplasmático Liso, sem ribossomas associados e está
envolvido no metabolismo de lípidos.

O Retículo Endoplasmático e a Secreção de Proteínas


Através de várias experiencias definiu-se a via secretora de proteínas:

RE Rugoso  Complexo de Golgi  Vesículas Secretoras 


Exterior

Esta via não é restricta a proteínas que serão excretadas, mas é


igualmente comum a proteínas da membrana plasmática e lisossomais.
Algumas proteínas iniciam esta via secretoras, no entanto nunca chegam a
conclui-la, ficando retidas no RE Rugoso ou no complexo de Golgi.

A entrada de proteínas no RE Rugoso representa o ponto principal de


ramificação para o tráfego de proteínas dentro da célula. Proteínas que têm
como destino final a excreção ou incorporação nos organitos são inicialmente
direccionadas para o RE Rugoso ou sintetizadas em ribossomas associados a
este. As proteínas restantes são sintetizadas em ribossomas livres e libertadas
no citosol.

Direccionando Proteínas para o Retículo


Endoplasmático

As proteínas podem ser transportadas para dentro do RE durante a sua


síntese nos ribossomas associados ao RE ou após a sua tradução em
ribossomas livres ter sido completada. Nos mamíferos, a maior parte das
proteínas, entram no RE simultaneamente à sua tradução.

62
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Os ribossomas são levados a associarem-se à membrana do RE pela


sequência de aminoácidos que está a ser sintetizados e não pelas
propriedades intrínsecas do ribossoma.

As sequências sinais no terminal amina da proteína que está a ser


sintetizada, são curtas sequências de aminoácidos hidrofóbicas que são
clivadas durante a sua transferência para o lúmen do RE. As sequencias
sinais são reconhecidas pela partícula de reconhecimento de sinal (SRP), que
se ligam a esta e ao ribossoma, sendo de seguida, ligado a um complexo
proteico de transporte na membrana do RE e a sequencia sinal é inserida num
canal de membrana.

Quando o transporte é inicado, após a tradução, a sequencial sinal é


clivada por uma peptidase sinal e o polipéptido libertado no lúmen do RE. No
caso de proteínas que são sintetizadas em ribossomas livres, só depois da
tradução são incorporados no RE, no entanto esta não é mediada por SRP,
mas sim por receptores de proteínas específicos.

Inserção de Proteínas na Membrana do Retículo


Endoplasmático

As proteínas destinadas à incorporação na membrana plasmática são


inicialmente incorporadas na membrana do RE e não libertados no lúmen.
Seguem a via das restantes proteínas secretadas, mas são transportadas
como componentes da membrana e não como proteínas solúveis.

As proteínas podem estar inseridas na membrana de diversas formas,


apenas uma vez ou diversas vezes, podem ter diferentes orientações, tendo o
seu terminal amina para o lado do citosol ou para o interior, o que é
determinado a quando da sua incorporação na membrana do RE.

Visto que o lúmen do RE é, topologicamente, idêntica ao exterior das


células, os domínios das proteínas que estão expostos no exterior da célula
correspondem aos que são transportados no lúmen do RE.

A maneira mais simples de inserção de proteínas nas membrana do RE


resulta da síntese de proteínas transmembranares com o ser terminal carboxilo
exposta para o citosol e a sua sequencia sinal para o lúmen, que é
posteriormente clivada.

Dobramento de Proteínas e Processamento no Retículo


Endoplasmático

O dobramento de cadeias polipeptídicas nas suas conformações


tridimensionais, para proteínas que entram na via secretora, ocorre durante o
transporte através na membrana do RE ou no seu lúmen. Na verdade o
principal papel das proteínas do lúmen do RE é catalisar o dobramento e o
processamento das proteínas que se encontram a ser transportadas.

63
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

O Reticulo Endoplasmático
Os lípidos são sintetizados no RE Liso devida ás suas características,
sendo estes hidrofóbicos, são sintetizados em associação com as membranas
já existentes e não no citosol; são de seguida transportadas por vesículas ou
proteínas para os seus destinos.

Além do seu papel na síntese dos glicerol fosfolipidos, o RE também


serve como principal local de síntese de outros dos lipidos de membrana: o
colesterol e a ceramida. São aqui produzidas igualmente as hormonas
esteroides, a partir do colestrol, são por isso muito desenvolvidos (RE Lisos)
em células secretoras de hormonas esteroides.

Para manter a membrana do RE Liso estável alguns dos lípidos


sintetizados de novo são transferidos para a porção exterior da bicamada, este
processo é catalisado pelas flipases.

Exportação de Proteínas e Lípidos do Retículo


Endoplasmático

As moléculas são exportadas do RE em vesículas que derivam deste e


transportam o conteúdo até ao compartimento intermediário RE – Golgi; e
depois até ao complexo de Golgi. Já no complexo de Golgi são transportados
entre diferentes compartimentos do Golgi e do Golgi para lisossomas ou
membranas plasmáticas, ou para vesículas excretoras.

O primeiro ponto de ramificação que surge nesta via é “exportação para


o Golgi versus retenção no RE”, surgem outros como “exportação para os
lisossomas ou membrana plasmática versus retenção no Golgi”; todos este
pontos de ramificação são regulados por sequencias sinal presentes na cadeia
polipeptídica.
Como exemplo de sequencias que determinam qual o caminho a seguir
pela proteína, temos os sinais KDEL ou KKXX que determinam que as
proteínas sejam recuperadas do intermediário RE – Golgi de novo para o RE.

O Complexo de Golgi

O complexo de Golgi funciona como uma fábrica na qual as proteínas


recebidas do RE são processadas e separadas para que sejam transportadas
para os seus destinos. No entanto é neste que ocorre a síntese de alguns
lípidos, como glicolipidos ou esfingomielinas, ou de polissacarideos.

Organização do Complexo de Golgi

O complexo de Golgi é composto por sacos (cisternas) envoltas por


membranas achatadas e vesículas associadas. Possui uma face cis, que é
convexo e habitualmente orientado na direcção do núcleo, e a outra face trans.
Este encontra-se dividido em quatro regiões funcionalmente distintas: a
rede de Golgi cis, pilha de Golgi medial e trans, rede de Golgi trans. As

64
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

proteínas entram pela rede Golgi cis, sofrem a maior parte das alterações na
pilha de Golgi e saiem pela rede de Golgi trans, sendo distribuídas e
direccionadas para os seus destinos.

Distribuição de Proteínas e Exportação do Complexo de


Golgi
As proteínas, assim como os lípidos e os polissacarideos, são
transportados do complexo de Golgi para os seus destinos pela via secretora, o
que envolve a sua incorporação em diferentes tipos de vesículas
transportadoras, que saiem da rede Golgi trans e entregam os seus conteúdos
nos locais apropriados da célula.

Sinais responsáveis pela retenção de algumas proteínas dentro do Golgi


formam localizadas pelo seu domínio transmembranares, que retêm a proteína
dentro do Golgi.

A via secretora constitutiva leva á secreção continua e descontrolada de


proteínas, no entanto algumas células possuem uma via secretora regulada, na
qual proteínas especificas são secretadas em resposta a sinais do meio;
seguem o processo normal da via secretora constitutiva, mas são armazenadas
em vesículas especializadas.

Proteínas de Revestimento e de formação de Vesículas


O primeiro passo no transporte vesicular é a formação de uma vesícula
por alterações na membrana, que é revestida por proteínas. Existem três tipos
de vesículas recobertas, que parecem funcionar em diferentes tipos de
transporte vesicular:
- Vesículas recobertas por clatrinas, são responsáveis pela captação
de moléculas extracelulares da membrana celular por endocitose;
- Vesículas recobertas por COP, que se dividem em COPI, funcionam
na via de recuperação para reter proteínas no Golgi ou RE, e em COPII, que
saiem do RE e transportam moléculas para o complexo de Golgi.

Fusão Vesicular

A fusão de uma vesícula de transporte com o seu alvo envolve dois tipos
de eventos: a vesícula transportadora deve reconhecer especificamente a
membrana alvo-correcta; e a vesícula e a membrana-alvo devem fundir-se,
libertando assim o conteúdo para o interior do organito-alvo.

A hipótese de SNARE diz-nos que a fusão vesicular é mediada por


interaccções entre pares específicos de proteínas, designados de SNAREs, na
vesícula (v-SNARE) e na membrana alvo (t-SNARE). A interacção entre as v-
SNARE e a t-SNARE leva à fusão das membranas através de mecanismos
ainda não conhecidos.

65
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Existe ainda o complexo NSF/SNAP que actua depois da fusão entre as


membranas para desagrupar o complexo SNARE, para que possa ser
reutilizado.

Lisossomas
São organitos
envolvidos por membranas
que contêm uma variedade
de enzimas capazes de
hidrolizar todos os tipos de
polímeros biológicos. Servem
para digerir tanto o material
captado do exterior como
componentes da célula
absolentos.

Hidrolases
Lisossomais Ácidas

Os lisossomas
possuem cerca de 50
enzimas, que degradam
todos os polímeros
biológicos. Mutações nos
genes que codificam estas
enzimas são responsáveis
por mais de 30 patologias,
que são chamadas de
doenças de armazenamento
dos lisossomas, pois o
material não é degradado e
acumula-se nos lisossomas.
Como exemplo temos a
Doença de Gaucher, que é
originado pela mutação no
gene que codifica uma
enzima responsável pela
degradação de glicolípidos.

Todas as enzimas
lisossomas são activas em
pH baixo, que é mantido
dentro dos lisossomas, mas inactivas em pH neutro. O que permite evitar uma
digestão descontrolada dos componentes da célula, o pH é mantido ácido no
interior dos lisossomas por transporte activo de iões H+ para o interior do
lisossoma.

66
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Dez (pág. 411-415)


Mitocôndrias
A mitocôndrias têm um papel crucial na produção de energia metabólica
das células eucariótas. Estas possuem o seu próprio DNA que codifica tRNAs,
rRNAs e algumas proteínas mitocôndriais; as restantes são sintetizadas em
ribossomas livres e importadas para o interior do organito por sinais
específicos.

Organização e Função das Mitocôndrias


As mitocôndriais são delimitadas por um sistema de dupla membrana,
composta por uma membrana interna e uma externa, separadas por um
espaço intermembranares. A membrana interna apresenta cristas que se
estendem para o interior, que se designa de matriz. É nesta que encontramos o
genoma mitocôndrial e as enzimas responsáveis pelas reacções centrais do
metabolismo oxidativo.
No entanto é na membrana interna que se localiza o principal local de
geração de ATP, que possui características que tornam este processo mais
eficiente, como é exemplo o aumento da sua superfície devido ás cristas e a
sua impermeabilidade á maioria dos iões e moléculas pequenas.
Contrariamente á membrana interna, a externa, é permeável a algumas
moléculas pequenas, devido a proteínas que formam canais, as porinas.

O Sistema Genético das Mitocôndrias


As mitocondrias possuem o seu próprio genoma, distinto do nuclear.
Considera-se que estas evoluíram de bactérias que desenvolveram um
relacionamente simbiótico com outras células.

O genoma mitocôndrial é constituído por moléculas circulares de DNA,


que estão presentes em múltiplas cópias por organito, o que nos indica que
existe na célula uma muito maior percentagem de genoma mitocôndrial do que
nuclear. É importante realçar que na mitocôndria é usado um código genético,
ligeiramente, diferente do código genético universal.

Tal como o DNA nuclear, o DNA mitocôndrial pode sofrer mutações, no


entanto a mitocôndria não possui mecanismos de correcção, o que origina uma
elevada taxa de mutação do DNA mitocôndrial.

É importante destacar o facto de a quando da fecundação todas a


mitocôndrias derivam o oócito, o que faz com as doenças mitocôndriais
sejam apenas transmitidas por via materna.

67
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Dez (pág. 437-441)


Peroxissomas
Os peroxissomas são organitos pequenos delimitados por uma
membrana e que contêm enzimas envolvidas em uma grande variedade de
reacções metabólicas, incluindo vários aspectos do metabolismo energético.
Apesar de serem idênticos aos lisossomas, diferem na sua formação, sendo
este formados apartir de proteínas sintetizadas nos ribossomas livres. Apesar
de não possuírem genoma são idênticos às mitocôndrias e aos cloroplastos,
pois reproduzem-se por divisão.

Funções do Peroxissomas
Os peroxissomas possuem, pelo menos, 50 enzimas diferentes
envolvidas em uma variedade de metabolismos.
Como o peróxido de hidrogénio é tóxico para as células, os
peroxissomas possuem também a enzima catalase, que decompõe esse
composto, convertendo-o em água, ou utilizando-o para oxidar outros
compostos orgânicos.
Diversos compostos são degradados nos peroxissomas, é um exemplo a
oxidação dos ácidos gordos, que representa a principal fonte energética
metabólica.

Os peroxissomas estão ainda envolvidos na biossintese de lípidos, de


ácidos biliares. Nas plantas desempenham dois papeis importantes , a
conversão dos ácidos gordos em glícidos, através do ciclo do glioxilato; estão
ainda envolvidos na fotorespiração, que serve para metabolizar produtos
secundários formados durante a fotossíntese.

68
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Onze
O Citoesqueleto

Citosqueleto é uma rede complexa, dinâmica e interdependente de


filamentos proteicos que se estendem ao longo do citoplasma. As suas funções
são:
- Suporte de organitos celulares;
- Sustentação da membrana plasmática;
- Importante para a mobilidade celular;
- Mantém a forma e confere elasticidade à célula;
- Permite o transporte de vesículas.

Existem três tipos de filamentos proteicos, dos quais iremos falar em


particular de seguida, os microtúbulos, os filamentos intermédios e os
microfilamentos ou filamentos de activa. A ordem a cima descrita está por
tamanho decrescente.

Microtúbulos
Encontram-se dispersos pelo citoplasma. Podem participar na
constituição de organitos (cílios, flagelos e centríolos), que desempenham um
papel importante nalguns tipos de mobilidade celular. Também estão presentes
nas dendrites e nos axónios. Os microtúbulos desempenham funções de:
- Estabelecem a forma da célula;
- Fornecem força mecânica;
- Locomoção da célula;
- Tráfego intracitoplasmático de vesículas e organelos durante a
interfase;
- Construção do fuso mitótico e movimento dos cromossomas;
- Criação e manutenção de domínios citoplasmáticos.

Constituição dos Microtúbulos

Constituídos pela polimerização de um heterodímero de tubulina α e


tubulina β, originando uma parede de 13 protofilamentos alinhados
longitudinalmente.

Os microtúbulos são estruturas com polaridade, sendo que a


extremidade positiva, onde se encontra a tubulina β, é o local onde ocorre a
associação de novas subunidades; assim sendo é nesta extremidade que
ocorre uma polimerização mais acelerada. Na extremidade oposta, de
polaridade negativa, estando exposta a tubulina α, ocorre uma fraca
polimerização.

Os microtúbulos que entram na constituição de cílios, flagelos e


centríolos são estáveis, já os microtúbulos citoplasmáticos são estruturas

69
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

dinâmicas, que podem formar-se e desmontar-se rapidamente por


polimerização e despolimerização.
Os microtúbulos citoplasmáticos têm um
importante papel na divisão celular, sendo que
é nesta fase que a sua instabilidade é mais
notável.

Os microtúbulos irradiam e crescem a


partir de focos de material denso , situados nas
imediações dos centríolos. Neles encontra-se
tubulina γ, esta é responsável pela função dos
focos de polimerização.

O processo de polimerização dos


microtúbulos é mediado pelo GTP e o GDP,
sendo que um se liga a uma subunidade e
outro a outra. É inibida por baixas
temperaturas e iões Ca2+ e favorecida pela
presença de GTP ou GDP e iões Mg2+.

Transporte Celular e Proteínas Motoras


Os microtúbulos estão não só associados à estrutura e aos movimentos
da células, mas são igualmente responsáveis pelo transporte intracelular.
Existem duas proteínas associadas aos microtúblos e que desempenham essa
função de transporte:
Dineínas – possibilitam o movimento em direcção à extremidade
negativa;
Cinesinas – possibilitam o movimento em direcção à extremidade
positiva.

A produção de força motriz por parte deste sistema também se pode


basear na despolimerização dos microtúbulos, sendo um exemplo a
deslocação dos cromossomas durante a anafase.

Proteínas Associadas aos Microtúbulos

Podem interferir com a ligação dos


microtúbulos a outras estruturas celulares, ou
com a dinâmica de polimerização e
despolimerização, permitindo a modulação das
suas funções.
As MAP baixam a concentração crítica
de tubulina necessária à formação dos MT,
favorecem o seu crescimento e diminuem a
taxa da sua dissociação; como exemplo destas temos as proteínas tau.

70
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Drogas que Intreferem com os Microtúbulos


Existem drogas que intreferem
com a estabilidade, ou os processos
de polimerização e despolimerização
dos microtúbulos, como é exemplo:
Colchicina – inibe in vitro a
polimerização da tubulina e provoca in
vivo a dissociação dos microtúbulos
citoplasmáticos. As suas moléculas
ligam-se com grande afinidade aos
dímeros de tubulina inibindo a sua
polimerização.
Vinblastina – liga-se às
moléculas de tubulina impedindo a sua
polimerização, originando a formação
de agregados paracristalinos desta
proteína.
Taxol – associa-se a polímeros
de tubulina, tendo uma acção
estabilizadora. Baixa a concentração
crítica de tubulina necessária à polimerização, que promove mesmo em
condições desfavoráveis (ausência de MAP e GTP, baixas temperaturas).

Filamentos Intermédios

Os filamentos intermédios têm um diâmetro entre o dos microtúbulos e


o dos microfilamentos. Formam uma rede perinuclear, donde se estendem até
à membrana celular. Ocorrem sob a forma de pequenos feixes ou constituindo
feixes muito compactos nas células epiteliais. Constituídos por proteínas
fibrosas, cujo domínio central é constituído por uma hélice α, com cerca de 310
a 350 aminoácidos e duas porções globulares em ambas as extremidades, de
dimensões e sequência muito variáveis. Podemos assim dividi-a em dois
domínio distintos:
Domínio central – responsável pela idêntica organização estrutural dos
diferentes tipos de filamentos intermédios.
Domínios terminais – muito variáveis em tamanho e nas sequências de
aminoácidos, conferem-lhes especificidades próprias.

As suas principais funções são:


- Desempenham funções estruturais (papel de suporte):
- Reforçam as células (resistência mecânica);
- Participam na organização das células em tecidos;
- Reforçam a membrana celular nos locais de contacto com outras
células;
- Transporte de macromoléculas e vesículas.

71
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Diferentes Tipos de Filamentos Intermédios


Os filamentos intermédios são classificados segundo a estrutura
molecular e a organização dos genes. São agrupados juntamente com as
lâminas nucleares numa grande família multigénica. Consideram-se 5 tipos
diferentes de famílias de proteínas que os constituintes:
- Tipo I – Citoqueratinas acídicas*  epitélios
- Tipo II – Citoqueratinas básicas/neutras*  epitélios
- Tipo III:
Vimentina  mesênquimas
Desmina  músculo
Proteína acídica fibrilar glial  células gliais e astrócitos
Periferina  neurónios do SN periférico
- Tipo IV:
Proteínas dos neurofilamentos
NF-L
NF-M Tecido nervoso periférico maduro; associadas
NF-H aos MT neuronais aumentam o tamanho do axónio.
Nestina  células neuroepiteliais
α internexina  tecido nervoso em crescimento
- Tipo V – Lâminas nucleares A, B e C  constituem o invólucro nuclear,
são exclusivas do núcleo

Formação dos Filamentos Intermédios

A formação dos filamentos pode ser dividida em quatro acontecimentos


sequenciais, que são os seguintes
- Um monómero emparelha com um monómero idêntico para formar um
dímero (estrutura entrelaçada), que conserva as regiões homólogas
emparelhadas paralelamente na forma helicoidal;
- Dois dímeros alinham-se para formar lado a lado um tetrâmero, que
contém 4 cadeias polipeptídicas;
- Cada tetrâmero constitui um protofilamento de 2 a 3 nm. Quatro
Protofilamentos (tetrâmeros) enrolados helicoidalmente formam protofibrilhas
de 4 a 5 nm;
- A associação de 4 protofibrilhas constitui filamentos intermédios de 10
nm.

72
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Filamentos de Actina
Os filamentos de Actina têm aproximadamente 7nm de espessura e
alguns µm de comprimento, a aparência da dupla hélice, são polares e
organizam-se em forma de feixes ou de redes.

Polimerização/Despolimerização

A actina G ou globular forma estruturas com 3 unidades, a união destas


estruturas forma a actina F ou filamentosa.

Os monómeros de actina podem ligar-se a ATP, que facilita a


polimerização e dificulta a despolimerização, e a ADP, que dificulta a
polimerização.

Existe um equilíbrio entre a actina G e a actina F, assim sendo quando a


concentração de actina G é superior, a polimerização é favorecida, quando é
inferior, a despolimerização é favorecida.

Na extremidade positiva existe uma velocidade de polimerização cerca 5


a 10 vezes superior do que na extremidade negativa, sendo que na positiva se
ligam o monómeros associados a ATP e na negativa os associados ao ADP.

Visto que a polimerização numa extremidade favorece a


despolimerização na outra, para que haja uma estabilidade dos filamentos de
actina, existe o efeito treadmilling, que favorece igualmente a adição na
extremidade positiva e a remopção na extremidade negativa.

Proteínas que Regulam a Polimerização e


Despolimerização da Actina

Existem proteínas que regulam a polimerização e a despolimerização da


actina, elas denominam-se por ABPs. Alguns dos exemplos de ABPs são os
seguintes:
- Complexo Arp 2/3 – Conduz à nucleação de actina, criando ramos nos
filamentos ou aumentando a sua taxa de treadmilling;
- Formina – Leva à nucleação de actina, determinando onde são
iniciados e para onde elongam os filamentos;

73
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

- ERM – Promovem a polimerização dos microfilamentos; são


associadas a proteínas da membrana;
- Família ADF/cofilina – Liga-se à actina-F-ADP, aumentando a taxa de
despolimerização na extremidade negativa, mantém a actina-G-ADP formada
nessa forma, impedindo a polimerização
- Profilina – Estimula a passagem de actina-G-ADP para actina-G-ATP,
aumentando a taxa de polimerização
- Gelsolina – Cliva a actina F em partes, pela separação de monómeros
num determinado ponto;
- Timosina β4 – liga-se
individualmente aos monómeros de actina,
reduzindo a sua concentração no citosol,
induzindo a despolimerização de actina F.

Existem ainda proteínas que regulam


a polimerização/despolimerização formando
um cap numa das extremidades, inibem a
polimerização ou a despolimerização
consoante se ligam a extremidade positiva
ou negativa, respectivamente.

Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina

As principais drogas que intreferem com a estabilidade e o equibilibro


entre despolimerização e polimerização dos filamentos de actina são:
- Citocalasinas – Ligam-se à extremidade positiva dos filamentos,
impedindo a sua elongação;
- Lantrunculina – Bloqueia a actina-G, impedindo a polimerização de
actina F;
- Faloidina – Liga-se aos filamentos de actina, impedindo a sua
dissociação em monómeros, bloqueando assim os microfilamentos.

Organização do Citoesqueleto de Actina


Os filamentos de actina podem organizar-se de duas formas distintas:
em rede ou em feixes.

Os feixes de actina podem estar organizados de duas formas distintas:


- Feixes Paralelos, poucos espaços entre os filamentos e é a fimbrina
que une os filamentos;
- Feixes Contrácteis, existe um maior espaçamento entre os feixes de
actina e é a α-actina que une as extremidades de cada filamento.

Os filamentos de actina organizados em redes consistem em arranjos


tridimensionais, onde a ligação entre feixes é realizada por filamina, que liga
os filamentos numa orientação tridimensional, flexível no seu arranjo global.
Esta configuração encontra-se junto à membrana plasmática.

74
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Miosina

A miosina funciona geralmente em


associação com filamentos de actina e
proteínas motoras, estando envolvida no
transporte celular e nos movimentos da
célula. A miosina pode ser divida em dois
domínios:
- Cabeça, liga-se à actina;
- Cauda, liga-se a cargas a transportar ou a outras subunidades de
miosina.

Contracção Muscular
Músculos esqueléticos são constituídos por fibras musculares
compostas por células alongadas, contendo miofibrilas: filamentos de actina e
filamentos de miosina; que se dividem em sarcómeros, ou seja, unidades
contrácteis responsáveis pelo aspecto estriado dos músculos.
As miosinas das células musculares são do tipo miosina II. As fibras de
miosina são constituídas pela união das suas caudas, ficando as suas cabeças,
que se associam a actina, livres para o fazer.

Existem diversas teorias para explicar a contracção muscular, a mais


aceite consiste no seguinte:
- Filamentos de miosina ligados à actina;
- Ligação do ATP;
- Filamentos de miosina desligam-se da actina;
- Hidrólise do ATP;
- Mudança de conformação da cabeça da miosina, permanência do ADP
+ P i;
- Ligação da miosina a um novo local do filamento de actina, mais
próximo da extremidade positiva;
- Libertação do ADP e do Pi;
- Retoma da conformação inicial;
- Avanço do filamento de miosina em direcção á extremidade positiva da
actina;
- Contracção Muscular, ou seja diminuição entre as miofribilas.

75
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Treze
Sinalização de Moléculas e seus Receptores
Diferentes tipos de moléculas transmitem informações entre células de
organismos multicelulares, embora a sua função seja idêntica, a sua estrutura é
variável. Umas transportam sinais a longas distâncias, outras para locais
específicos e outras paras as células vizinhas.

Certas moléculas atravessam a membrana e ligam-se a receptores no


citoplasma ou no núcleo, enquanto a maior parte se liga a receptores
expressos na membrana da célula. Existem diversas formas de sinalização e
de receptores, cujos mais importantes serão abordados de seguida.

Modelos de Sinalização Célula-Célula

A sinalização celular pode resultar tanto da interacção directa de uma


célula com a célula vizinha como da segregação de uma molécula sinalizadora.
Este ultimo caso pode ser divido em três grandes grupos consoante o seu
destino final:
- Sinalização Endócrina, as moléculas sinalizadoras são secretadas
por células endócrinas especializadas e transportadas através da circulação
para actuarem em células alvo localizadas em órgãos distantes;
- Sinalização Parácrina, uma molécula libertada actua sobre as células-
alvo vizinhas;
- Sinalização Autócrina, as células respondem a sinalizações que elas
mesmo produzem, como exemplo temos alguns linfócitos T.

Hormonas Esteróides e Superfamília de Receptores


Esteróides
Todas as moléculas sinalizadoras actuam por meio de ligação a
receptores expressos por células-alvo, em grande parte dos casos eles estão
expressos a superfície celular, no entanto alguns encontram-se no interior do
citoplasma ou núcleo. Visto que as hormonas são pequenas moléculas
hidrófobas, capazes de se difundirem através da membrana plasmática,
elas actuam em receptores expressos no citoplasma ou núcleo.

Temos o exemplo da hormona da tireóide que é sintetizado na


glândula tireóide e desempnha um papel importante no desenvolvimento e
regulação do metabolismo; a vitamina D3 regula o metabolimos do Ca+2 e o
crescimento ósseo; o ácido retióico e composto relacionados, sintetizados
apartir da vitamina A, desempenham um papel importante no desenvolvimento.

Hormonas Peptídeas e Factores de Crescimento

A mais amplas variedade de moléculas sinalizadoras nos animais é


constituída por péptidos. Existem diversos tipos de péptidos sinalizadores dos
76
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

quais se destacam as hormonas peptídeas, os neuropeptídeos e os factores de


crescimento.

Os factores de crescimento controlam o crescimento e a diferenciação


das células, como é exemplo no caso especifico do factor de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF). Este factor é armazenado nas plaquetas e
libertado durante a coagulação sanguínea no local do ferimento. Ele estimula a
proliferação dos fibroblastos nos tecidos periféricos à lesão. Existem ainda os
factores de crescimento ancorados à membrana, que permanecem na
membrana da célula e actuam a quando das interacções célula.

Visto que as moléculas peptídeas sinalizadoras não são capazes de


atravessar a membrana, logo é necessário que existem receptores nas
membranas para que a célula possa captar os sinais por eles transmitidos.

Funções dos Receptores de Superfície Celular


Como já foi referido, as moléculas sinalizadoras, muitas delas não
conseguem atravessar a membrana e precisam por isso de receptores de
membrana.
A maior parte dos receptores actuam controlando a abertura/fecho de
canais iónicos ou através da transmissão de sinais intracelulares que irão
interferir com factores de transcrição e regular a transcrição de determinados
genes.

Receptores Acoplados à Proteína G

A família mais ampla de receptores de superfície celular transmite sinais


para alvos intracelulares por intermédio de proteínas de ligação ao nucleotídeo
guanidina, denominadas de proteínas G.

Os receptores acoplados à proteína G são estrutural e funcionalmente


proteínas, caracterizados por sete α-hélices paralelas atravessando a
membrana.

As proteínas G são compostas por três subunidades, α, β e γ. A primeira


está ligada aos nucleotídeos guanidina, que regulam a actividade desta
proteína; no seu estado de repouso esta subunidade encontra-se ligado ao
GDO em complexo com a subunidade β e γ.
Quando a hormona se liga ao receptor, este altera a sua conformação e
leva a que o GDP ligado à subunidade α seja substituído por GTP. Com a
presença de GTP a subunidade β e γ formam um complexo que irá
desempenhar as suas funções, sendo que todo este ciclo se encerra com a
hidrólise do GTP a GDP, passando a subunidade α a estar de novo ligada a
GDP, ou seja, inactiva, e o complexo β e γ junto a esta.

Receptores de Proteína-Tirosina Cinase


Contrariamente ao receptores acoplados à proteína G, existem outros
que se encontram ligados directamente a enzimas intracelulares. A grande
77
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

família deste grupo é a dos receptores proteína-tirosina cinase. Desta família


fazem parte os receptores para os factores de crescimento polipeptídeos.

A estrutura destes receptores é caracterizada por um domínio N terminal


extracelular de ligação ao ligante, uma única α-hélice transmembranar e um
domínio C no citosol, onde está ligada a enzima com actividade proteína-
tirosina cinase.

A primeira etapa em sinalização de muitos deste receptores é a


dimerização do receptor induzida pelo ligante. Esta dimerização leva a uma
autofosforilação do receptor à medida que as cadeias polipeptídeas
dimerizadas se fosforilam umas às outras. Este processo de autofosforilação
constitui um importante ponto de regulação e permite que se criem sítios
específicos para a ligação de proteínas adicionais, que irão transmitir a cadeia
de sinais intracelulares dos receptores activados. Os mais bem conhecidos
destes domínios são os domínios SH2.

Vias de Transdução de Sinal Intracelular


A maioria dos receptores de superfície celular estimula enzimas-alvo
intracelulares, as quais podem, ou não, estar acopladas aos receptores por
proteínas G. essas enzimas são elementos da cascata de sinalização que
propaga e amplifica o sinal iniciado pela ligação do ligante. Ao conjunto de
reacções que transmitem o sinal desde a superfície até ao seu alvo chamamos
transdução de sinal intracelular.

A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilação de


Proteínas
Após vários estudos conclui-se que a acção de muitas das hormonas era
mediada por um aumento da concentração de AMP Cíclico (cAMP), o que nos
levou a considerar o cAMP como o segundo mensageiro na sinalização
hormonal.

O cAMP é formado apartir do ATP pela acção de adenial ciclase e


degradado a ATP por cAMP fosfodiesterase.

Grande parte dos processos em que o cAMP actua como segundo


mensageiro funcionam de forma a que as proteínas que necessitam de ser
acivadas possuem subunidades regulatórias ligadas a elas, que as inibem, e
que são “removidas” a quando da ligação de cAMP. No caso dos animais este
efeito verifica-se maioritariamente nas proteínas cinases dependentes de
cAMP, ou proteínas cinase A.

Com este mecanismo é possível uma enorme amplificação do sinal


desde o receptr até ao alvo, pois cada molécula ligante activa um único
receptor, que por sua vez pode activar mais de uma centena de molécula G,
que estimulam a actividade da adenil cinase, que por sua vez pode catalisar a
síntese de muitas moléculas de cAMP.

78
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Muitas vezes o cAMP vai interferir directamente na regulação da


transcrição de determinados genes, estes possuem uma sequência regulatória
(CRE), ao qual se irá ligar a proteína CREB após ter sido fosforilada por uma
proteínas cinase A.

GMP Cíclico

O GMP Cíclico é igualmente um segundo mensageiro, no entanto não


se encontra tão bem estudado como o cAMP. A sua síntese é mediada pela
guanilil ciclase e a sua degradação a GMP por uma fosfodiesterase.

Quando existe a ligação do ligante, as guanilil cilcase são estimuladas a


sintetisar cGMP, que por sua vez irá desencadear respostas bio-fisiológicas.

A Via das Ras, Raf e MAP Cinase


A via da MAP cinase refere-se a uma cascata de proteínas cinases que
foram altamente conservadas durante a evolução e desempenham funções
centrais na transdução de sinal em todas as células eucariótas.

As ERK desempenham um papel central na sinalização da proliferação


celular induzida por factores de crescimento que actuam por meio de
receptores proteína-tirosina cinase ou receptores acoplados à proteína G.

A activação da ERK é mediada por duas proteínas cinases contra-


corrente, que são acopladas a receptores de factores de crescimento por uma
proteína de ligação ao à GTP denominada Ras. Por sua vez a activação da
Ras leva á activação da proteina cinase Raf e que vai activar uma outra
proteína cinase a MEK. A MEK vai por sua vez activar membros da família das
ERK.

Receptor + Ligante  Ras  Raf  MEK  ERK  Factores de


Transcrição

Regulação da Morte Celular Programada

A morte celular programada é uma forma fisiológica normal de morte


celular que desempenha um papel-chave tanto na manutenção de tecidos
adultos como no desenvolvimento embrionário.

A morte celular programada permite não só fazer uma renovação dos


tecidos, como evitar que células potencialmente perigosas para o organismos
proliferem. Como exemplo disto temos as células infectadas por vírus ou com
lesões no seu DNA que induzem a sua própria morte para o bem de todo um
organismo. Esta é uma das formas do nosso organismo evitar que células que
possam originar um cancro proliferem, é por isso um importante mecanismo
celular, apesar de a palavras morte estar quase sem associada a uma acção
negativa.

79
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A sobrevivência das células é assegurada, na sua maioria, pelos


factores de crescimento extracelulares, também a morte celular programada é
mediada por um conjunto de várias vias de sinalização.

Caspases e Apoptose
Em contraste com a morte acidental de células,
a morte celular programada é um processo activo
caracterizado por mudanças morfológicas distintas
conhecidas como apoptose.

Durante este processo o DNA cromossomal


normalmente encontra-se muito condensado e é
fragmentado. O núcleo fragmenta-se, sendo de
seguida a célula que diminui de tamanho e se
fragmenta; os fragmentos que dai surgem denominam-
se de corpos apoptóticos. Estes fragmentos são
facilmente reconhecidos e digeridos pelos macrófagos,
o que faz com que a apoptose seja muito diferente da
necrose celular, onde não existe uma eficaz remoção
dos fragmentos de célula que se originam.

São as caspases que são responsáveis por


desencadear todo este processo a nível celular, sendo
elas proteases que têm no seu centro activo resíduos
de cisteína e clivam depois de resíduos de acido
aspártico.

Os principais alvos das caspases são: um inibidor de um DNase, que irá


fragmentar o DNA nuclear; as lâminas nucleares, o que provoca a alteração da
membrana nuclear; e as proteínas do citoesqueleto, levando á sua destruição e
fragmentação celular.

As caspases são sintetizadas sob forma inactiva, a sua activação é feita


por clivagem proteolítica, o que por sua vez é catalisado por outras caspases.
O Apaf-1 é um dos activadores das caspases, promovendo a clivagem de
outras caspases e dos substratos alvo; em contraste temos a Bcl-2 que inibe a
activação de caspases. Nos mamíferos existe a chamada família Bcl-2, onde
se inclui o Bcl-2, no entanto dentro deste grupo existe elementos pró-
apoptóticos e anti-apoptóticos.

Uma das caspases iniciadoras é a Caspase-9, que para ser activada


não basta que existe Apaf-1, é ainda preciso que a este complexo se junto o
citocromo c. O que em condições normais não é possível, pois o citocromo c
encontra-se dentro da mitocôndria. A quando da estimulação pró-apoptótica, ou
na ausência de factores de crescimento, as células induzem danos na
membrana da mitocôndria, sendo o citocromo c libertado.
Forma-se então o complexo caspase-9/Apaf-1/citocromo c que é
activo e inicia a clivam de outras caspases, as efectoras, e dos seus alvos.

80
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Esta situação é evitada pelas Bcl-2 que se vão ligar á membrana da


mitocôndria, mantendo a sua estabilidade, ficando o citocromo c longe da
caspase-9. No entanto existem elementos pró-apoptóticos que induzem danos
na membrana de modo a que haja libertação de citocromo c.

Receptores de Morte Celular e Activação de Caspases


Existem polipeptídeos segregados que activam receptores que induzem
a apoptose – factores de necrose tumoral (TNF) – que irão activar
directamente as caspases.

Neste caso a caspases activa é a Caspase-8,que se auto-cliva, e que


por sua vez vai activar a cadeia das caspases. Uma das acções da caspase-8,
além de clivar outras caspases, é clivar um membro das Bcl-2, o Bid, que é um
elemento pró-apoptótico, e vai induzir a degradação da membrana mitocôndrial
e consequente libertação de citocromo c; com a presença de citocromo c a
capase-9 é igualmente activa.

Sinalização de Sobrevivência Celular


A sinalização referida anteriormente vai induzir a apoptose, no então
existem outras vias que inibem a apoptose e promovem a sobrevivência da
célula. Estas vias são controladas por factores de crescimento – factores de
sobrevivência – ou por interacção célula-célula. Na realidade quase todas as
células estão programadas para induzirem a apoptose caso haja ausência e
factores de sobrevivência.

Uma das principais vias de sinalização intracelular responsável por


promover a sobrevivência celular é iniciada pela enzima PI-3 Cinase, que é
activada por receptores de membrana. A PI-3 cinase é responsável por activar
a proteína Ark que interfere com as proteínas reguladoras da apoptose.

Um dos seus alvos é uma proteína da família da Bcl-2, a Bad, que induz
a libertação de citocromo c, a Ark promove a sua inactivação.
Pode ainda fosforilar a capase-9, impedido que esta fique activa,
mesmo na presença de citocromo c e Apaf-1.
Regula a expressão de factores de transcrição importantes para manter
a sobrevivência celular.

A sobrevivência celular pode ser assegurada não só pelas PI-3


cinases/Ark, mas igualmente pela via Ras/Raf/MAP.

81
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

82
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Capítulo Catorze (pág. 596-617)


O Ciclo Celular dos Eucariótas
O ciclo da divisão da maioria das células consiste em quatro processos
coordenados: crescimento celular, replicação do DNA, distribuição dos
cromossomas duplicação às células-filhas e divisão celular.

Fases do Ciclo Celular


O ciclo celular pode ser dividido em duas fases principais: mitose e
interfase.

A mitose corresponde à separação dos cromatídeos e termina


geralmente a divisão celular, através da citocinese.

No entanto grande parte do ciclo é compreendido na interfase, tanto o


crescimento celular, como a replicação do DNA, ocorrem de forma ordenada e
estritamente reguladas.

Interfase  Mitose  Citocinese  Mitose

G1 Fase S  G2  Mitose  Citocinese

A interfase é caracterizada pelo


crescimento celular e pela replicação
do DNA; na fase G1 a célula encontra-
se metabolicamente muito activa e
cresce continuamente; na fase S
ocorre a replicação do DNA, passando
cada cromossoma a ter dois
cromatídeos; em seguida na fase G2 o
crescimento continua e são
sintetizadas as proteínas necessárias
para o inicio da Mitose.

Contrariamente ao que acontece


nas células embrionárias, no adulto
algumas células cessam
completamente a divisão e outras
apenas se dividem quando necessário.
Estas células passam de um estado G2
para G0, no qual permanecem
metabolicamente activas mas não
proliferam, a não ser que recebam
estímulos para tal.

83
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

As diferentes fases do ciclo celular podem ser distinguidas pelo seu


conteúdo em DNA:
- G1 (2n)
- Fase S (2n-4n)
- G2/M (4n)

Regulação do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e


Sinais Extracelulares
O ponto principal da regulação do ciclo celular ocorre no final de G1 e
controla a passagem de G1 para S – START. Uma vez ultrapassado este ponto
as células estão destinadas a entrar em fase S e consequente divisão celular, a
sua regulação é feita quer por sinais extracelulares, quer pela disponibilidade
de nutrientes no meio. No entanto nas células animais o ponto START é
regulado quase exclusivamente pelos factores de crescimento extracelulares.
Na ausência de estímulos para a proliferação as células passam de G1 para G0,
onde podem permanecer indefinidamente.

Pontos de Verificação do Ciclo Celular

Na maioria das células a coordenação entre as diversas fases do ciclo


celular é dependente de um sistema de controlo de pontos de verificação e
retroalimentação que previnem a entrada na próxima fase do ciclo até que
eventos da fase anterior tenham sido completados

A função de grande parte dos pontos de verificação é assegurar que os


cromossomas incompletos ou danificados não se repliquem e sejam passados
para as células-filhas. Um dos mais bem marcados pontos de verificação
ocorre em G2, evitando que a célula passe para a Mitose sem que todos os
cromossomas estejam replicados.

A continuação do ciclo celular é igualmente bloqueada em G2 caso


existam erros no DNA, quer sejam estes resultantes de agente mutagénicos ou
se erros na replicação, o que previne a passem de DNA mutado para as
células-filhas.

Os danos no DNA não bloqueiam apenas o ciclo em G2, mas também


diminuem a continuação do ciclo em S e evitam que a célula passe de G1 para
S. Assim sendo a célula pode reparar o DNA antes de prosseguir para a
próxima fase.
Em células de mamíferos o ponto de bloqueio em G1 é mediado pela
acção de uma proteínas, a p53, cuja expressão é induzida em respostas ao
DNA danificada (uma não replicação dos cromossomas é encarada como um
dano do DNA). Este é um dos genes que se encontra regularmente mutado em
paciente com cancro, pois permite a proliferação das células mesmo que estas
possuem danos no seu genoma.

Outro ponto de verificação ocorre no final da mitose, este assegura-se


que os cromossomas se encontram correctamente posicionados no fuso

84
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

mitótico, para que estes sejam distribuído de forma exacta para as células-
filhas.

Ligação da Fase S para a Fase M

O ponto de verificação em G2 evita a iniciação da mitose antes da


conclusão da fase S, assegurando-se que todos os cromossomas são
replicados uma única vez e de forma integra. A síntese do DNA no núcleo em
G2 é bloqueada por um mecanismo que evita nova replicação do genoma até
que ocorra uma mitose.
O mecanismo que regula esta replicação do DNA envolve um conjunto
de proteínas designadas MCM que se ligam às origens de replicação.

Reguladores do Curso do Ciclo Celular


Como já nos foi dito anteriormente existem um conjunto de pontos de
verificação, que por sua vez regulam o avanço ou o retardo do ciclo celular.
Esta regulação é feita por um variado conjunto de proteínas que asseguram
que o ciclo ocorra de forma coordenada, que haja uma correcta replicação e
distribuição do DNA; caso isto não se verifique a célula induz a sua própria
morte, por um proceso de apoptose.

MPF: Um Dímero de Cdc2 e Ciclina


A caracterização
molecular de MPF em diversos
laboratórios mostrou então que
este factor conservado de
regulação do ciclo celular é
composto por duas subunidades
Cdc2 e Ciclina B. A actividade
do MPF é controlada pela
periódica acumulação e
degradação da ciclina B durante
o ciclo celular, e ainda pela
fosforilação e desfosforilação de
Cdc2.

A regulação deste
complexo em S e G2 é
conseguida por duas
fosforilações, sendo que uma
delas a inactiva, e por isso leva a
sua acumulação. Na transição para M é causada pela activação do complexo
como resultado da desfosforilação de um resíduo de tirosina que outrora
mantinha o complexo inactivo, este processo é mediado pela Cdc25.

Família das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas

85
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Nos eucariótas a passagem de G1 para a fase S é regulada por Cdk2 e


Cdk4 em associação com as ciclinas D e E. Sendo que a associação de Cdk4
e ciclinas D são necessárias para ultrapassar o ponto STAR, enquanto que a
Cdk2 e ciclinas E são necessárias para a transição para a fase S e o inicio da
replicação do DNA.

Durante a fase S existe uma associação entre a ciclina A e Cdk2,


enquanto que a transição de G2 para M é promovida pela associção de Cdc2
com ciclina B.

Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D

A proliferação das células animais é regulada por uma variedade de


factores de crescimentos extracelulares que controlam as células através do
ponto de restrição no ponto de restrição no final de G1. Na ausência de factores
de crescimento as células são incapazes de ultrapassar o ponto STAR e
entram em G0.

A síntese de ciclina D é induzida em resposta à estimulação dos factores


de crescimento como resultado da sinalização através de Ras/Raf/ERK. As
ciclinas do D são continuamente sintetizadas enquanto existirem factores de
crescimento no meio, no entanto elas degradam-se com facilidade, e na
ausência de factores de crescimento o seus níveis descem rapidamente.

86
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

A proteína Rb actua como um supressor de tumores, pois o complexo


Rb/E2F suprime a transcirção do gene que regula E2F. A fosforilação de Rb
pelo complexo Cdk4/Ciclina D resulta numa dissociação de E2F, que activa a
transcrição dos seus genes-alvo (um deles é o da ciclina E).

Inibidores do Curso do Ciclo Celular

Agentes que danificam o DNA resultam num bloqueio do ciclo celular,


permitindo assim à célula reparar os danos que surgiram. Um bom exemplo
deste processo é o bloqueio do progresso do ciclo celular por inibição dos Cdk,
o que é mediado pelo p53.

O p53 vai regular a transcrição, estimulando a expressão de p21, que é


um inibidor de Cdk. Na presença de p21 muitos dos complexos Cdk/Ciclina não
se conseguem formar, logo existe um bloqueio no ciclo celular.
O p53 além de bloquear o ciclo celular induz ainda a apoptose,
activando a via das caspases, é pois uma forma de assegurar que as mutações
ou possíveis oncogenes não serão transmitidos às células descendentes.

87
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Correlações
Clínicas

88
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Índice
Índice ............................................................................................................................. 89

Vírus e Cancro .............................................................................................................. 90

Fenilcetonúria ............................................................................................................... 91

HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92

Terapia Génica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93

Cancro do Cólon e Reparação do DNA ...................................................................... 94

Factor de Transcrição Pit-1 e a Deficiência da Hormona do Cresc. ....................... 95

Antibiotico e Síntese Proteica ..................................................................................... 96

Doença de Gaucher ...................................................................................................... 97

Doenças das Mitocôndrias: Neurapatias Ópticas Hereditátia de Leber ................. 98

Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99

Fibrose Cistica ............................................................................................................ 100

89
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Vírus e Cancro
A Doença
O cancro é um grupo de doenças caracterizado pela proliferação
incontrolada de células. Em contraste com um crescimento regulado normal, no
cancro as células crescem de forma não-regulada, acabando por invadir e
interferir com a função de tecidos e órgãos normais.
O cancro é uma das maiores causas de morte nos nossos dias, e é por
isso alvo de estudos por parte da Biologia Molecular.

Bases Celulares e Moleculares

Sabe-se que o cancro resulta de mutações nos genes que normalmente


controlam a proliferação celular, podendo estas inibir mecanismos de controlo
ou estimular a divisão celular, actividando factores envolvidos na regulação do
ciclo celular.
O estudo de vírus que provocam cancro, como é o caso do RSV,
permitiram concluir que o cancro é uma doença genética, no entanto ela não
resulta da alteração de um único gene.
Era pois muito mais fácil estudar o genoma do vírus, do que o de
animais, levando á identificação de um gene causador de cancro, um
oncogene.
Encontram-se nas nossas células genes semelhantes a este encontrado
no RSV, estes quando vítimas de alterações, originam então um oncogene.
Que pode causar o cancro, no então são necessárias mais alterações do que
apenas a formação de um único oncogene.

Prevenção e Tratamento
Os cancro humanos que são causados por vírus incluem o cervical e
outros cancros anogenitais, como é exemplo o papilomavírus e os vírus da
Hepatite B e C.
Este cancros podem ser prevenidos através de uma vacina contra o
vírus responsável, como é o caso da vacina eficaz contra o vírus da Hepatite B.
A maior parte das mutações que causam cancro são adquiridas durante
a nossa vida e não herdadas.

90
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Fenilcetonúria
A Doença
A fenilcetonúria, ou PKU, é um erro inato do metabolismo dos
aminoácidos com efeitos devastadores. Se não for tratada resulta em um grave
atraso mental, no entanto é já possível o seu diagnóstico precoce e o seu
tratamento.
Bases Celulares e Moleculares
A fenilcetonúria é causada por uma defeciencia na enzima fenilalanina
hidroxilase que converte fenilalanina em tirosina. Esta deficiência leva ao
acumular de elevados níveis de fenilalanina, que passa por outras reacções
como a conversão para fenilpiruvato. Estes produtos tóxicos para o organismos
são excretados pela urina, devido à sua elevada concentração no sangue.
Embora a causa bioquímica seja desconhecida, o retardo mental é causado por
um acumular anormal deste metabolitos anormais de fenilalanina.

Prevenção e Tratamento

A deficiência da enzima não causa nenhum problema enquanto o feto


está dentro do útero, de modo que crianças com fenilcetonúria são normais ao
nascimento. Se não tratadas tornam-se gravemente e permanentemente
afectados antes de completarem um ano de vida. Felizmente o diagnostico
pode ser feito por testes de rotina, conhecido por teste do pezinho, no entanto
um diagnostico mais especifico deve ser feito através de testes genéticos, para
verificar de outras enzimas foram afectadas igualmente.
O tratamento desta doença baseia-se numa alimentação controlada,
com baixa ingestão de fenilalanina, o que permite manter, os níveis desta,
aceitáveis, abaixo do limite tóxico.

91
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

HIV e SIDA
A Doença
A Sindrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é uma doença
recente, descrita pela primeira vez em 1981. No entanto rapidamente se tornou
numa pandemia mundial, que já provocou vários milhões de mortes.
As manifestações clínicas da SIDA resultam, principalmente, da falha do
sistema imune, o que torna o paciente vulnerável a infecções oportunista, que
de outro modo seria facilmente resistente. Existe ainda uma grande incidência
de cancro nestes pacientes, no entanto a grande causa de morta são as
infecções oportunistas.

Bases Celulares e Moleculares


A SIDA é causada por um retrovírus, o HIV, que infecta
preferencialmente os linfócitos CD4, que é necessário para uma resposta
imune normal. Contrariamente a muitos outros retrovírus, o HIV, não induz as
células a tornarem-se cancerosas. Ele destrói as células que infecta, o que leva
a um redução drástica do linfócitos CD4 e uma deficiente resposta do sistema
imune, o que permite ás infecções oportunistas alojarem-se.

Prevenção e Tratamento

Até ao presente a única forma de prevenir a SIDA é evitando a


contaminação pelo HIV. O HIV é um vírus que no exterior se perde
rapidamente. O HIV pode ser transmitido por contacto sexual, através de
contacto com produtos contaminados com sangues e de mãe para filho durante
a gravidez ou no aleitamento.
Quanto ao seu tratamento, este é pouco eficaz, no entanto actualmente
é já possivel prolongar a vida dos pacientes infectados com a combinação de
diversos fármacos. Um dos mais utilizados é o AZT, que consiste num
nucleotídeo modificado que não possui na extremidade 5’ o grupo OH de modo
a permitir a ligação ao nucleotídeo seguinte, inibindo assim a transcrição do
DNA viral.

92
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Terapia Génica para a Deficiencia


de Adenosina Desaminase
A Doença
A deficiência de adenosina desminase é uma das causas de
imunodeficiência grave combinada (SCID), um grupo de doenças hereditárias
nas quais os linfócitos falham ao desenvolver-se. Os indivíduos doentes têm
todas as suas funções imunes deficientes, logo defesas quase ausentes.
Devido ás inúmeras infecções que afectam estes indivíduos, as crianças, a
menos que tratadas, não ultrapassam os 2 anos de idade.

Bases Celulares e Moleculares

Cerca de 20% dos casos de SCID ocorrem por deficiência genética na


enzima adenosina desaminase, a qual catalisa a desaminação da adenosina e
da desoxiadenosina. Esta deficiência na enzima leva a uma acumulação de
dATP, que em altas concentrações é prejudicial para células em proliferação,
pois o dATP inibe a ribonucleotídeo redutase, necessária para a síntese dos
desoxirribonucleotídeos trifosfatados. Logo uma elavada concentração de
dATP inibe a transcrição. Este deficiência afecta mais severamente os linfócitos
pois estes não possuem outras enzimas que degradam o dAMP e evitam desta
forma o acumular de dATP.
Mais concretamente a deficiência de adenosina desaminase intrefere
com a replicação do DNA dos linfócitos, evitando que estes se dividam.

Prevenção e Tratamento

Algumas crianças com deficiência na enzima adenosina transaminase


podem ser curadas pelo transplante de medula óssea. Em outros casos esta
doença por ser tratada pela terapia de reposição enzimática, na qual a
adenosina transaminase funcional é administrada por injecção endovenosa.
Embora este procedimento seja benéfico e atenue a patologia, ele não cura a
doença.
Foi então criada a primeira tentativa clínica de terapia génica no
tratamento de duas crianças com esta doença. Foram obtidos linfócitos destas
crianças e estimulados a proliferarem; um cDNA de adenosina desaminase
funcional clonado num vector retroviral foi introduzido nesses linfócitos, os
quais, retornaram aos pacientes. Estes tratamentos foram repetidos 11 a 12
vezes num período de 2 anos, e verificou-se que o vector era mantido após o
tratamento e um dos pacientes produziu cerca de 25% do nível normal de
adenosina transaminase.
Estes resultados são sustento para o sucesso da terapia génica como
tratamento neste tipo de doenças.

93
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Cancro do Cólon e Reparação do


DNA
A Doença
Os cancros do cólon e recto são um dos tipos de cancro mais comuns
em países ocidentais, a maioria deles não são hereditários. No entanto existem
já duas formas de cancro do cólon que foram descritas, e são hereditárias. Em
ambos os casos ele resulta do facto de herdar um gene de susceptibilidade ao
cancro, que determina uma elevada probabilidade de contrair cancro. A mais
comum é o Cancro do Cólon Hereditário sem Polipose (HNPCC).
A presença destes genes de susceptibilidade ao cancro aumentam
igualmente, mas de forma menos significativa, a probabilidade de contrair
outros cancros.

Bases Celulares e Moleculares

Assim como outros cancros, o cancro do cólon, resulta de mutações em


genes que regulam a proliferação celular e provocando um crescimento
descontrolado dessas células. Esporadicamente estas mutações ocorrem em
células somáticas, no entanto, como era de esperar, em cancro hereditários
elas ocorrem em células da linha germinativa.
Foi descoberto que cerca de 50% dos casos de HNPCC resulta de
mutações num gene que codifica uma enzima responsável pela correcção do
malpareamente de bases durante a transcrição. Este gene em questão é
homólogo do MutS da E.Coli, e existem ainda outros que são homólogos do
MutL, estando igualmente ligados à reparação do DNA.
Lesões nos genes responsáveis pela reparação do DNA vão influenciar
o aparecimento de outras mutações em genes diferentes, e que provavelmete
irão alterar a proliferação celular, podendo dar origem a cancro.

Prevenção e Tratamento

A identificação dos genes responsáveis pelo HNPCC permite, através de


testes genéticos, identificar os indivíduos com alto risco. Esta identificação
pode ainda ser útil na prevenção da doenças em indivíduos com maior
predisposição ou para o diagnostico pré-natal, para casais portadores que
pretendam ter filhos.
É importante um diagnostico precoce, pois com o avançar do cancro as
hipóteses de sobrevivência diminuem. No entanto existem fármacos que estão
a ser testados, e que poderão inibir o desenvolvimento destes cancros.

94
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Factor de Transcrição Pit-1 e a


Deficiência da Hormona do
Crescimento
A Doença
A hormona do crescimento é uma proteína produzida pela glândula
pituitária que é necessária para um crescimento e desenvolvimento normal.
Com uma deficiente produção desta hormona as crianças ficam com uma
baixa-estatura. Esta deficiência é muitas vezes originada por uma mutação que
afecta a produção desta hormona, e geralmente de outras do mesmo grupo.

Bases Celulares e Moleculares


As deficientes humanas combinadas de hormonas pituitárias lembram
fenótipos de indivíduos anões, que não possuem o tipo de células responsáveis
pela secreção da hormona do crescimento. No entanto foi descoberto que as
deficiências humanas combinadas de hormonas pituitárias resultam de uma
mutação de um gene responsável por um factor de transcrição, o Pt-1. Após
novas experiencias verificou-se que este factor não afecta apenas a transcrição
da hormona de crescimento, mas sim de todas as hormonas pituitárias.

Prevenção e Tratamento

Crianças com deficiência em hormonas de crescimentos podem ser


eficazmente tratadas por injecções desta hormona. Até muito recentemente
esta hormona apenas era possível de obter de cérebros humanos, no entanto a
partir de 1979 foi possível expressar com sucesso na E.Coli esta hormona de
crescimento, passando ser usado para fins clínicos a partir de 1985.
Quando esta deficiência em hormonas de crescimento é de origem
genética, é importante a existência de testes genéticos para um diagnóstico
mais correcto.

95
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Antibióticos e Síntese Proteica


A Doença
As bactérias são responsáveis por uma ampla variedade de doenças
infecciosas potencialmente letais. Até 1940 os médicos não tinham
medicamentos para combater estas infecções, até ao aparecimento dos
antibióticos, que tornaram curáveis muitas doenças até ai letais.

Bases Celulares e Moleculares

Para ser efectivo clinicamente um antibiótico deve matar ou inibir o


crescimento de bactérias sem ser tóxico para humanos. Então assim sendo, os
alvos dos antibióticos estão apenas presentes nas bactérias, e não nas células
humanas. Por exemplo, a penicilina, inibe a síntese da parede celular
bacteriana. Muitos outros antibióticos inibem outros passos na síntese proteica,
sendo específicos para os ribossomas.

Prevenção e Tratamento

O uso de medicamentos teve um grande impacto na medicina moderna


por permitir curar infecções, que de outra maneira levariam um individuo à
morte. No entanto mutações no genoma bacteriano podem levar a uma
multiresistencia das bactérias aos antibióticos.
Esta situação é preocupante pois surgem muitas vezes em hospitais
bactérias deste tipo e que levam os médicos a não encontrar uma maneira
rápida e eficaz de controlar as infecções por elas causadas.

96
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Doença de Gaucher
A Doença
A doença de Gaucher é a mais comum das doenças de armazenamento
dos lisossomas, que são causadas por uma falha dos lisossomas em degradar
substancias que eles normalmente degradam. A acumulação de compostos
leva a uma aumento do tamanho e número de lisossomas dentro da célula,
resultanto falência das células onde isto acontece.
Existem três tipos da doença que diferem na gravidade e no
envolvimento do sistema nervoso. A forma mais comum (tipo I), o sistema
nervoso não está envolvido; a doença aparece com o aumento do baço e do
fígado e o desenvolvimento de lesões ósseas. As formas mais graves da
doença (tipo II e III) são mais raras, sendo a mais devastadora a do tipo II,
onde o envolvimento neurológico é detectado logo na infância e os indivíduos
morrem precocemente. A doença do tipo III é intermediária e é caracterizada
pelos sintomas neurológicos por volta dos 10 anos.

Bases Celulares e Moleculares


A doença de Gaucher é causada pela deficiência da enzima lisossomal
glicocerebrosidade que catalisa a hidrólise de glicocerebrosídeo para glicose e
ceramida. Foram identificadas mais de 30 mutações responsáveis por esta
patologia, sendo que a gravidade da doença por ser determinada pela natureza
dessas mutações.
A doença do tipo II e III pode ter origem na substituição de uma prolina
por uma leucina.
Excepto os tipos II e III, a doença de Gaucher é apenas detectado nos
macrofagos, pois estes são responsáveis pela hidrólise de muitos
componentes, levando assim a uma grande acumulação de compostos.

Prevenção e Tratamento

Esta patologia pode ser tratada pela terapia de reposição enzimática, na


qual a administração exógena da enzima é utilizada para corrigir o defeito
enzimático. Através de diversas experiências descobriu-se que os macrófagos
expressam receptores na superfície celular que ligam resíduos de manose em
glicoproteínas extracelulares e depois internalizam estas proteínas. É assim
possível dirigir especificamente a glicocerebrosidade para os macrófagos
através de modificações que expusessem os resíduos de manose.

97
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Doenças das Mitocôndrias:


Neurapatias Ópticas Hereditátia de
Leber
A Doença
É um doença hereditária que causa a cegueira devido à degeneração do
nervo óptico. A perda de visão ocorre entre os 15 e os 35 anos, sendo
geralmente o úncio sintoma da doença.
As mulheres são menos afectadas, o que nos poderia sugerir que é uma
doença ligada ao sexo, no entanto neste caso os homens nunca transmite a
doença. A doença é apenas transmitida por via materna, o que nos leva a
concluir que é uma doença de herença citoplasmática, visto que o citiplasma
resulta quase na sua totalidade do oócito.

Bases Celulares e Moleculares


Foi identificada nos pacientes com LHON uma mutação no seu DNA
mitocôndrial que afecta uma das subunidades do complexo I da cadeia
transportadora de electrões. Foram diagnosticadas outras mutações nos
pacientes com esta doença, no entanto todas elas reduzem a capacidade
mitocôndrial de realizar fosforilação oxidativa. Os efeitos desta falência são
sentidos nos tecidos mais dependentes de fosforilação oxidativa, como é o
caso do sistema nervoso, como é o caso do nervo óptico.
Esta doença está associada às mitocôndrias, o que nos faz ter que
mudar um pouco os parâmetros de intrepertação. Nas nossas células
possuímos diversas mitocôndrias com genomas diferentes, é por isso possível
que tenhamos a mutação, mas sendo o número de mitocôndrias mutadas
diminuto, a doença não se manifesta.

Prevenção e Tratamento

A identificação das mutações no DNA mitocôndrial pode ser decisiva


para o diagnostico precoce de pacientes com historial familiar de LHON. No
entanto a identificação da mutação no genoma mitocôndrial é pouco
conclusiva, pois não é possível determinar com certeza de o individuo sofre ou
não da patologia, o que contraste com a identificação de mutações no DNA
nuclear.
Uma das terapias consiste na terapia metabólica, ou seja, administrar
substratos ou cofactores da via de fosforilação oxidativa; outra das hipóteses
seria a terapia génica, introduzindo um gene saudável para a proteína em falta
no DNA nuclear, com a particularidade que essa proteína possuiria um sinal
que a levaria até à mitocôndria.

98
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Distrofia Muscular e Citoesqueleto


A Doença
As distrofias musculares são um grupo de doenças hereditárias
caracterizadas por uma perda progressiva de células musculares. A distrofia
muscular de Duchene (DMD) é a mais frequente e grave.
Os sintomas aparecem por volta dos 3 a 5 anos, por volta dos 12 anos
são confinados a uma cadeira de rodas e poucos são os que ultrapassam a
idade adulta dos 20 anos, acabam por morrer com falência respiratória.

Bases Celulares e Moleculares

Existe uma maior incidência em indivíduos do sexo masculino, o que nos


indica que se trata de uma doença ligada aos cromossomas sexuais; este facto
foi confirmado por testes genéticos que indicaram que o gene responsável pela
DMD se encontra no cromossoma X.
O gene mutado condifica uma proteína denominada de distrofina, esta
encontra-se ligada à membrana das células musculares, o que lhes permite
resistir ao stress da contracção muscular.
Existem mutações que levam a uma ausência completa na expressam
de distrofina, e outras a uma proteína mutada, este factor vai condicionar a
gravidade da doença.

Prevenção e Tratamento
A identificação do gene DMD possibilitou o desenvolvimento de testes
diagnósticos sensíveis. Mulheres portadoras do alelo mutante para este gene
podem ser identificadas, e as suas gerações monotorizadas a fim de preceber
de houve transmição do alelo mutado.
É assim possível identificar em embriões in vitro a presença desta
mutação, antes que estes sejam implantados no útero da mãe. A combinação
do aconselhamento genético e o diagnostico pré-natal representa uma medida
potencial de prevenção de DMD hereditária.
Infelizmente a eficiência destes procedimentos é limitada pelo facto de
que aproximadamente um terço dos doentes de DMD não são hereditários. É
assim necessário desenvolver terapias para os doentes que se encontram
nestes casos, e para os restantes que sofrem de DMD hereditária; actualmente
existe o esforço para desenvolver uma terapia genética para restabelecer a
produção de distrofina no musculo.

99
2007/2008
Biologia Molecular da Célula – Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa

Fibrose Cística
A Doença
A fibrose cistíca é uma doença genética recessiva que afecta crianças e
adultos jovens. É a doença hereditária mais comum em brancos, que é
caracterizada pela produção de um fino muco por vários tipos de células
epiteliais, incluindo as que envolvem as vias respiratórias e gastrintestinal.
Os primeiros sintomas consistem numa obstrução das vias aéreas
superiores por acumulação de muco e uma consequente infecção bacteriana.
As glândulas sudoríparas apresentam-se igualmente alteradas, sendo
característico uma presença excessiva de sal no suor.
Os procedimentos para esta doença incluem terapia física para
promover drenagem bronquial, administração de antibióticos e reposição de
enzimas pancreáticas.

Bases Celulares e Moleculares

A característica marcante da fibrose cística é um defeito no transporte de


-
Cl nos epitélios afectados. A sequência que codifica uma proteína da famila
dos transportadores ABC está mutada, denominada CFTR.
Vários estudos demonstram que a CFTR funciona como um canal de Cl-
e que as mutações responsáveis pelo estabelecimento da fibrose cística
resultam directamente no transporte deficitário de Cl-.

Prevenção e Tratamento
O isolamento do gene da fibrose cística possibilitou identificar os
indivíduos portadores do alelo mutado; o que juntamente com a compreensão
do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens
para o tratamento. Uma das possibilidades é a utilização de drogas que
estimulem a abertura dos canais de Cl-; outras das alternativas é a terapia
génica com a reposição do gene da CFTR nas células afectadas.

100
2007/2008