r--------------Boletin de Informacion Tecnlca 18

Detecci6n de Virus en la Producci6n de Semilla de Papa

Luis F. Salazar

CIP

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Dstecclon de Virus mediante inoculacion de plantas indicadoras

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\.~; Editorial Herniafario Sur S.R.L.

;::1 Centro Internacional de la Papa (CIPI es una entidad cientffica, autonOl"la y sin fines de lucro, establecida mediante Convenio con el Gobierno del ".n:. para desarrollar y diseminar conocimientos sobre la papa, con el proposito de lograr su mayor u tilizac.on como alimento basico, EI CIP se financra con fondos internacionales destinados a la ayuda tecnica de la agricultura.

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Referencia correcta:

SALAZAR, L. F. Deteccion de virus en la produccion de semilla de papa.

Montevideo, Hemisferio Sur y Centro I nternacional de la Papa, 1986. ;4 p. (Boletfn de Informacion Tecnica 18.)

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Boletin de Informacion Tecnica 18

Detecci6n de Virus en la Producci6n de Semilla de Papa

luis F. Salazar

Centro Internacional de la Papa (CIP) Editorial Agropecuaria Hemisferio Sur S.R.L.

1986

001913

Deteccion de Virus

en la Produccion de Semilla de Papa

Objetivos. EI estudio de este manual debe capacitarlo para:

• explicar la naturaleza y el efecto de los virus de la papa,

• describir los principios y objetivos en la deteccion de virus,

• explicar los principios y discutir la aplicacion de los metod os mas comunes en la detecci6n de virus (ver secciones 4,5 y 6).

Materiales de estudio.

• Plantas de papa con diferentes smtornas de virus.

• Plantas indicadoras con diferentes sintomas de virus.

• Ilustraciones 0 muestras de rnetodos sercloqicos.

Practicas.

• Practicar la deteccion de virus en campo y almacen.

• Demostrar aquellos rnetodos ser oloqicos que son tacilrnente apl icables bajo las condiciones de su pais.

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Cuestionario.

<'Qu,; par tcs de Iii plant a son invadidas par la mayor ia de virus!

2 <'CU,1Il qrande podrra ser la reduccion dl? rendirniento?

3. (Como pueden se r controladas las enfermedades virosas?

4 (Par que los virus deben ser de tectados tan pronto como sea posible dcspuus de la inf eccion?

5. c En que criterios se basaria para escoqer los rnetodos de deteccion?

6. "-Bajo que consideraciones podria ser rndeseable la produccion de semilla completamente libie de virus?

7

<'Que precondrciones son requerrdas p.ua la observacion de s mtornas en el J

campo?

8. 9. 10.

c Cuales son los principales sintomas de virus en papa?

z Cuales son las ventajas de la observacion de sintomas en el campo?

z Cuando es la observacion de s intornas en el campo el metoda mas indicado?

11 12. 13

z Cuales son las precondiciones para la prueba de plantas indicadoras? Describa el principio de las pruebas seroloqicas.

z Po. que es la prucba de latex mas scns.t iva que la de micr oprecipitacion?

3

Boletln de Informaci6n Tecnica 18

Deteccion de Virus en la Produccion de Semilla de Papa

J

1 lntroduccion.

2 Naturaleza y efecto de los virus de la papa.

3 Principios de la dstsccion de virus.

4 Observacion de sintomas en el campo.

5 Plantas indicadoras.

6 Pruebas seroloqicas.

7 Lecturas ad icionales.

1 INTRODUCCION.

Los virus son agentes de tamario extremadamente pequefio, causantes de enfermedad, que pueden reducir significativamente los rendimientos de papa. Una vez dentro de la planta de papa, la mayoria de los virus son transrnitidos a las generaciones siguientes a traves de tuoerculos infectados usados como semilla. En la rnavor ia de los casos practicos. en un programa de produccion de semilla, los virus solo pueden ser eliminados mediante erradicacion de las plantas intectadas. Las infecciones virales no siempre son visibles en las plantas de papa infectadas. Existen varios metodos de deteccion, algunos mas confiables que otros. EI metoda escogido depende pnicticamente del grado deseado de reduccion de virus en un campo y de los recursos disponibles.

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2 NATURALEZA Y EFECTO DE LOS VIRUS DE LA PAPA.

Los virus son particulas muy pequerias, par ejemplo de 500 nm ~ 0,000 5 rnm. Solo se pueden ver con ayuda de un microscopic electr onico. Se multiplican en celulas vivas y son tr ansmit idos a plantas sanas por medio de insectos, nematodes, hongos, 0 contacto mecanico. Si la transrnision pr imaria es efectiva da lugar a inteccion primaria. Cuando la planta es susceptible el virus se multipl ica e invade posteriormente todos los tejidos de la misma.

Cuando la planta infectada crece y madura, la mayorfa de los virus puede invadir todas las partes vegetativas, incluyendo los tuberculos La mayorfa de los virus de papa pasan de un cultivo a otro a tr aves de tuberculos enfermos; esta es deno-

rninada infeccion secundaria. oJ

;;

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secundaria 2do. ano

etc

1er. ana

Despues de la infeccion inicial, los tuberculos-sernillas enfermos transmiten la mayoria de los virus. La severidad de la enfermedad aumenta de campafia en camparia. EI ciclo de la enfermedad se interrumpe mediante la elirninacion de las plantas enfermas de virus en los programas de multiplicaci6n de semi lias.

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Algunos virus infectan granos de polen u ovules y son transmitidos a travos de I" semilla botanica.

Las per didas causadas par los virus de la papa 5011 cuant it ativas (reduccior. del rendimiento) y cualitativas (reducci6n del valor comercial). EI tipo y la Sl'V(" idad de las perdid as dependen de la planta, de las condiciones arnb.onr alr-s y del virus. Unos ve int e virus causan en terrnedades en papa. Los virus X, S 0 M de la papa (PVX, PVS, PVM) pueden reducrr iOS rendimientos de 5 a 40'7,,; ot ro s como el virus del enrollamiento de las hojas (PLRV) 0 infecciones combinadas de PVX y PVY causan perdidas hast a de 90"/".

En la practica, las plantas infectadas con virus no pueden ser curadas. Generalmente, la soverid ad de la enfermedad y su diseminaci6n aumentan de una campafia a otra, a menos que el cicio de la enfermedad sea interrumpido. Una farma efectiva de intcrrumpir el cicio d!;lla enfermedad es excluir de la multipiicacion de semilla las plantas infectadas de virus. Para este proceso 58 r equ.er e de 13 detecci6n de inf ecciones vir ales.

3 PRINCIPIOS DE LA DETECCION DE VIRUS.

Las tecnicas de detecci6n de virus buscan identificar la causa de las infecciones vir ales:

tan pronto como sea posible despues de la inteccion, Y

antes que la planta infect ada Ilegue a ser un reservorio para posterior d iserninacion.

Las diferentes tecnicas de detecci6n varian en sensibilidad y cornplej idad. Ninguna de las tecnicas es completamente sequr a, La eficiencia depende tambien de la hab iI idad y el entrenamiento del operador

Una tecnica optima debe combinar alta sensibilidad con simplicidad de aplicaci6n y bajo coste, Como ninguna de las tecnicas es ideal para todas las situaciones, la selecci6n del metoda debe basarse en los criterios siguientes:

grado deseado de reduccion de virus, estado de multipl icacion de la semilla, virus involucrado,

recursos disponibles,

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Grado deseado de reduccion de virus. Los limites de sanidad respecto a virus dependen de las necesidades de un programa de produccion de semilla. AI· gunos virus solo causan perdidas insignificantes 0 no prevalecen en la region. La produccion indiscriminada de semilla libre de virus puede ser indeseable V costosa. Un programa de produccion de semilla debe ser restringido a los virus que son mas prevalentes V sever os.

Estado de rnultiplicacion de la semilla. La mul t iplicacio n de la semilla se hace en varios pasos. Si es solamente la rnult iplicacion final, son suficientes los metod os baratos V sencillos. Si se requiere probar plantas madres individuales se necesitan rnetodos de deteccion mas sensitives va que esas plantas son la base del programa.

J

Virus involucrado. Un rnetodo de deteccion puede ser efectivo para un virus especifico pero no para otro. De est a manera, la seleccion del rnetodo depende tamb ien del virus involucrado.

Recursos disponibles. Algunos rnetodos de deteccion requieren un minimo de precondiciones, por ejemplo, la observacion de sintomas en el campo solo necesita mspectores experiment ados. EI usa de otras tecnicas depende de la disponibilidad de invernaderos, laboratorios, equipo V materiales. Las pruebas con plantas ind icadoras solo pueden ser conducidas efectivamente cuando se dispone de invernaderos. Los metodos seroloqicos dependen de la d isponibi lidad de antisueros.

Las tecnicas mas comunes, que se analizan a continuacion, son:

observacio n de sintomas en el campo, plantas indicadoras,

pruebas seroloqicas.

Otras tecnicas estan restringidas a virus 0 aplicaciones especificos, tales como la prueba de callosa para el virus del enrollarniento de la hoja (antes de que se desarrollara ELISA), la electroforesis para el viroide del tuberculo ahusado, V la microscopia electroriica para observar particulas de virus en juga de plantas.

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4 OBSERVACION DE SINTOMAS EN EL CAMPO.

La mayoria de los virus inducen sintomas en las plantas de papa y ocasionalmente en tuberculos, La observacr6n de sintomas en el campo no es costosa ni requ iere de recursos especificos. S610 se necesita entrenar al observador.

En plantas se puede observar crecimiento reducido, amarillamiento, mosaico, necrosis y deformacio n de hojas. Los srntornas en tuberculos pueden ser la forma ahusada, rajaduras, d eformacio n y necrosis. Factores ambientales como temperatura, intensidad de luz y fertilidad del suelo (principal mente exceso de nitrogeno) afectan la expr esion de s intornas. En algunas circunstancias, las plantas infectadas s610 muestran sintomas ligeros 0 pueden no mostrar sintomas [inf eccion asintornatica olatente). Algunos virus pueden producir sintomas similares en la misma variedad de papa. En otros casos, variedades diferentes pueden reaccionar en forma diferente al rnisrno virus. La infeccio n combinada de var ios virus camb ia la exprusion de los s1ntomas. Los 5 intornas de virus pueden ser confundidos con causas no paras iticas 0 con smtornas causados por otros pat6- genos.

La dificultad para detectar s intornas Irgeros 0 infecciones latentes es otra desventaja al observar srntornas en el campo. Sin embargo, en la mayor ia de los casos, la observacion de sintomas en el campo permite detectar los virus mas importantes.

La observacion de smtornas en el campo es util cuando se requiere examinar poblaciones grandes de plantas en las ultirnas etapas de la rnultipticacion de semiIla. Es el metoda indicado para programas que buscan infecciones que reducen significativamente los rendimientos.

La publicaci6n del CIP, "La papa: principales enfermedades y nematodes" puede ser una ayuda util para reconocer smtomas de virus en el campo. Ver tambien Cortbaoui, 1980 (secci6n 7 del presente bolet in},

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L.ol ()1J~t~rV,ICI{-)1l dl' 'd!llolnd,) en (~i l:~!llIP(_l e~ 'i( flcu'nfp pard di~1cctilr la m.rvor i« dt: los virus Inlportolnt-cs_ Los "S-il1t(}n~llS d~:~ h Jlantd i nclu ven el .un.rr ilarnie n to riP I" hOJ" ('dlu""rL,) V I" dd'HllldCl('" de I" hej,' Id",pcha).

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5 PLANTAS INDICADORAS.

Muchos virus de la papa t ambien infectan otras plantas, incluyendo aquellas de otros qener os y familias. Algunas plantas hospederas reaccionan con sintomas conspicuos y caracteristicos, tales como difer ent es tipos de mosaicos 0 lesiones locales. Estos sintomas caracter isticos en las Ilamadas plantas indicadoras avudan a detectar e identificar los virus de la papa, inclusive cuando son latentes.

Los sintomas caracteristicos en las plantas indicadoras incluyen mosaicos sistemicos (izquierda, Nicoiiana debneyi) y lesiones locales (derecha, Solanum dem,· ssum A6).

Algtmas plantas ind icadoras comunes son: el cion A6 (5. demissum x S. tuberosum "Aquila"), Chenopodium smsrenticolor, Gomphrena giobosa, y Physalis fioridana.

Las plantas indicadoras son generalmenh cultivadas de semilla, en invernaderos. En cierto estado de desarrollo son inoculadas mccanicamente 0 por insectos (principalmente afidos). Los primeros sintomas tipicos pueden ser observados una semana despues de la inoculacion.

EI rnet odo de plantas indicadoras es sensuivo a varios virus y relativamente f acil de conducir. Es recomendable para prohar plantas mad res 0 material de semilla basica. EI cult ivo de plantas indicadoras debe ser sincronizado de tal manera que plantas de cor recto est ado de desarrollo esten disponibles en el momenta preciso. EI metoda requ iere instalaciones pard crecimiento de las plantas y materiales Irnacetas, suelo, materiales simples de lab oratorio}.

6 PRUEBAS SEROLOGICAS.

CUilllcl" d dillmdies de 50111'1'" callelll", C("lI'IOS, pur cjernp!o se lcs mvcct.in ant iqcnos (d'l'!lliCS caUSdllk" de '~11II~1 Ilwri"d 0 .ilqunas rnolr-culas or qanicas) Si' iOlrndll I'll [~i SI.Jf;IO dp SLJ sdnqt!~ o t ras pIC tcir)dS (h~nOlninadds anticu erpos Ld 1l1dY(lI i,1 <Ii' los VIIUS <Ie la pdpa son buenos .int i'lenos, cs ricer .nducen LlCIIIlll"" If' III fori ldCI(')!1 (It' .llltiClJ!'lpC)S.

EI :;U"iO ('1U,,; corti.nn .mt rcucr pos) puetic .cr separado ele la s.mqre del animal V ('5 rI'!llClmrrlddo antrsuer o Cu.mdo I'S apI,)pladilfnenlt' pr cpararlo. un ant isucr o cs lall ('speciflcD que ,,(,10 r cacciona con "I vi us (anr iqcno) que indujo la produccio n d[~ (1llllclIcrpos

Cuarn lo los ant tCLlCr pos y el ant Iqeno s(~ unt an in vitro ocur rr: una reaccion Estd r"dec"'''1 I"Jerie sel ob servad.i (Ii! d,I,'1 '111" forma, depcndicnciu del met odo

empleaci(). Ulld tCdccic-)f) posit iva indica ILl l.as pi uchas selolr'l'licds mas COI1lUIWS SOil ELISA,

p"~Sel1CIJ del vii us en co ns.deracio n nicr ooi ccipuacion, pruoha de latex y

Anticuerpo Antigeno Heaccion
• • • • • • • • • ~
• + • • -
• • • -
• •
• •
• • • Cuando los anucuerpos y el antigeno se untan ill oitro ocurre una reaccion.

Microprectpitacion. Ulla qo t a de ant isuuo S8 rnezcla cun una gota de juqo de plallta cl.u if icar!». Dospucs de cierto ticmpo, pref er iblernern e con .ivuda de Ull rnicro scop.o COil campo OSCUIO, se rued" cbservar una f loculacio n. La flocu!a cion ocu Ie COil las muestr as intectadas pen, 110 CUll las sanas.

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Prueba de Latex. EStd pruciJa PS simi]. I iI Iii de microp: ccipi tacion Lil scnsiblliddd ,It, la prucha se aurnunt a ,II ;)(111"111 l;lS P(lqll6idS rnoleculas ck anticuerpos a las psi eras rclat ivamnnt e rjrdlldes de l.it e. an t es de redliLal Id prllclJd. {El Litex es lind macr omotccuta Olll,\nic" dp polrco;til',no.}

Ulla qOla de li,lex sensllJllildcio con dllllCl (11P05 sc mcz c!a COil una 'Iota del juqo de la pl.mt a qUI: est;i ell P'LJr:iJd S, el IlJ<!il conr icnr- virus. OCUIrc I" f loculacion <lr:1 l.i t ox Ld Icacclc)11 res visih!« Sill 1111c"slClacl de microscopio. La prucb a de I;',tr:x "s 100 a 1000 veces mils sensu iva q;Ie-lil de mrcr oprcc.pu acion. 110 "'qulf]Ie cl.iri+icaco n <lr:1 JUlJo rI" la plant.i, la "'" :CI(')(1 ocurrc m.is riipldamente, y nece- 511<, mcnos aru isuer o. Requil'le ;ilrlUlloS pr oduct o, quimicos y t.icilidades dp lahur;Jt(JlIO.

En la prueba de latex, la floculaci6n en una muestra infectada (iz quie rda) es visible sin necesidad del microscopic.

ELISA, EI l\~rrl1lno ELISA "5 un ar.r c u.mo Iormado (ic- "Enz vrneLink ed trnmunosorbent ASSilY." Rr:qulclc rn.is Pi! .os prepnrattvo s <ill" las t ecnicas men clonadas pr"viamell1e. Es el m('\()c\o S<'rotCl IICO mils scns.trvo <'11 uso actualrnent e y pmmi t e est irn.u cu.mt it a t ivamunt e Id c(Jr1centtacion de virus en IdS rnucst. as.

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Generalmente, las pruebas serol6gicas son preferidas en diagn6stico de virus debido a su adaptabilidad para probar un 'Iran nurnero de muestras. En varios laboratorios se obtienen los antisueros para la mayoria de virus. La serologia es usualmente menos sensitiva que las plantas indicadoras.

ELISA es la mas sensitiva de las tres tecnic.rs seroloqicas descritas, seguida por Iii prueba de latex. La rnicr oprecipit acion, aunque es menos sensitiva, es ut il cuando no se dispone de las facilidades de laboratorio para conducir las otras pruebas.

Tanto la microprecipitacio n como la prueba de latex pueden mostrar floculaci6n no especifica con algunos componentes del extracto de la planta. La r eaccion puede fallar cuando la cantidad de anticuerpos excede considerablemente la cantidad de particulas de virus, 0 viceversa. Por esta raz6n, las muestras sonpr obadas en dos diluciones diferentes. J

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7 lECTURAS ADICIONALES.

Bokx, J. A. de. 1972. Viruses of potatoes and seed potato production. Centre for Agriculture Publishing and Documentation. Wageningen, The Netherlands. 233 pp.

Clark, M.F. and A.N. Adams, 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. gen. Virol. 34 475-483.

Cortbaoui, R. 1980. Descarte de plantas de papa. Boletfn de Informaci6n Teenica 5. Centro I nternacional de la Papa, Lima, Peru. 11 pp.

Fribourg, C. y J. Nakashima. 1981. Prueba de latex para detectar virus de para. Juego de Diapositivas 11/1. CentrQ,rlnternacional de la Papa. 31 diapositivas.

Fr ibourq, C. y J. Nakashima. 1981. Prucha de latex para detectar virus de papa. Guia JI/1. Centro Internacional de la Papa. 12 pp. (Descripci6n ilustrada de la tecruca. Puede usarse con el juego de diapositivas arriba mencionado, 0 para el estudio individual).

Hooker, W.J. (ed) 1980. Compendio de enfermedades de la papa. Centro Internacional de la Papa, Lima, Peru. pp.95-12ii.

Hunnius, W. 1977. Virus testing of seed potatoes. Z. PflKrankh. PflSchutz 84: 748·763. [Tex t o en aleman; tr aduccion al inqles disponible en el CIPl.

Centro I nternacional de la Papa. 1978. La papa: principales enfermedades y nematodos. Centro Internacional de la Papa, Lima-Peru. 68 pp.

Salazar, L.F. 1979. Aplicacion de la tocnica serol6gica con conjugados enz irnaticos (ELISA) para diagnosticar virus de la papa. Fitopatologia 14: 1-19.

Ploper, L.D. y RamaJlo, N.E. 1981. Tecnicas para el diaonostico de enfermedades virosas de la papa en Tucurnan. Bolct m No. 136. Estacion Experimental Agro-Industrial "Obispo Colombres", Tucurnan, Argentina. 11 pp.

Torrance, L. and Jones, R.A.C. 1981. Recent developments in serological methods suited for use in routine testing for plant viruses. PI. Path. 30: 1·24

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